Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב דרך הפה בעכברים נגועים ב- HIV-1

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/63696
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Hematology and Oncology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית להעברת תרופות אנטי-רטרו-ויראליות משולבות דרך הפה המדכאות בהצלחה שכפול RNA של HIV-1 בעכברים אנושיים.

Abstract

מגפת נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV-1) ממשיכה להתפשט ללא הפרעה ברחבי העולם, ונכון לעכשיו, אין חיסון זמין נגד HIV. למרות שטיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב (cART) הצליח לדכא שכפול נגיפי, הוא אינו יכול למגר לחלוטין את המאגר מאנשים נגועים ב- HIV. אסטרטגיית ריפוי בטוחה ויעילה להידבקות ב- HIV תדרוש שיטות רב-תכליתיות, ולכן ההתקדמות של מודלים חייתיים לזיהום ב- HIV-1 הם מרכזיים לפיתוח מחקר ריפוי HIV. עכברים אנושיים משחזרים תכונות מרכזיות של הידבקות ב- HIV-1. מודל העכבר האנושי יכול להיות נגוע ב- HIV-1 וניתן לשלוט בשכפול הנגיף באמצעות משטרי cART. יתר על כן, הפרעה ל-cART גורמת לריבאונד נגיפי מהיר בעכברים אנושיים. עם זאת, מתן cART לבעל החיים יכול להיות לא יעיל, קשה או רעיל, ומשטרי cART רלוונטיים רבים מבחינה קלינית אינם ניתנים לניצול מיטבי. לצד היותו עלול להיות לא בטוח עבור חוקרים, מתן cART על ידי הליך הזרקה יומי אינטנסיבי נפוץ גורם ללחץ על ידי ריסון פיזי של החיה. שיטת cART האוראלית החדשנית לטיפול בעכברים אנושיים נגועים ב- HIV-1 המתוארת במאמר זה הביאה לדיכוי של וירמיה מתחת לרמת הזיהוי, לשיעור מוגבר של שחזור CD4+ ולשיפור הבריאות הכללית בעכברים אנושיים נגועים ב- HIV-1.

Introduction

תוחלת החיים של אנשים הנגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי הכרוני (HIV) השתפרה באופן משמעותי עם טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב (cART)1,2. cART מפחית בהצלחה את שכפול ה- HIV-1 ומגדיל את ספירת תאי ה- CD4+ T לנורמליות אצל רוב המשתתפים הנגועים ב- HIV-1 באופן כרוני3, וכתוצאה מכך בריאות כללית משופרת והפחתה דרמטית בהתקדמות המחלה4. עם זאת, מאגר HIV-1 סמוי נוצר גם כאשר ART הוא יזם במהלך זיהום חריף 5,6,7. המאגרים נמשכים לאורך שנים במהלך ART וריבאונד נגיפי מהיר לאחר שהפרעת ART מתועדת היטב 8,9. אנשים החיים עם HIV על ART הם גם נטייה לסיכון גבוה יותר של תחלואה נלווית כגון מחלות לב וכלי דם, סרטן, והפרעות נוירו10,11,12. לכן, יש צורך בתרופה פונקציונלית ל- HIV. מודלים של בעלי חיים לזיהום ב- HIV-1 מציעים יתרונות ברורים בפיתוח ואימות אסטרטגיות ריפוי HIV חדשניות13,14,15. עכברים אנושיים, כמודל של חיה קטנה, יכולים לספק שחזור תאי חיסון אנושיים רב-שכבתיים ברקמות שונות, מה שמאפשר מחקר מקרוב של הידבקות ב- HIV16,17,18,19. מבין המודלים האנושיים, המודל האנושי של מח עצם-כבד-תימוס (BLT) משחזר בהצלחה זיהום כרוני ב-HIV-1, כמו גם תגובות חיסוניות אנושיות פונקציונליות לזיהום ב-HIV-1 20,21,22,23,24. לכן, מודל עכבר BLT האנושי נמצא בשימוש נרחב כדי לחקור היבטים שונים בתחום המחקר של HIV. עכברי BLT אנושיים הם לא רק מודלים מבוססים היטב לסיכום של זיהום מתמשך ב- HIV-1 ופתוגנזה, אלא גם כלים תוצאתיים להערכת אסטרטגיות התערבות מבוססות טיפול בתאים. המחברים הנוכחיים ואחרים הראו כי מודל עכברי BLT האנושיים משחזר זיהום מתמשך ב- HIV-1 ופתוגנזה 25,26,27 ומספק כלים להערכת אסטרטגיות התערבות מבוססות טיפול תאי 28,29,30,31,32,33.

משטרי cART המורכבים משילובים של תרופות אנטי-רטרו-ויראליות הנלקחות מדי יום מדכאות שכפול HIV-1 עד כדי כך שהעומס הנגיפי אצל אנשים שטופלו בהצלחה נותר בלתי ניתן לגילוי לאורךזמן 34. התוצאות של טיפול בעכברים אנושיים נגועים ב- HIV עם משטרי cART רלוונטיים מבחינה קלינית דומות לאלה שנצפו אצל אנשים נגועים ב- HIV-1 שטופלו ב- ART22: רמות HIV-1 מדוכאות מתחת לגבולות הגילוי וההפרעה של cART גורמת לריבאונד של שכפול HIV מהמאגר הסמוי35. הזרקה תת-עורית (SC)27,36,37 או תוך-צפקית (IP)37,38,39 היא המסלול המשמש בדרך כלל לטיפול ב-cART בעכברים אנושיים. עם זאת, הזרקה יומית אינטנסיבית גורמת ללחץ על בעלי חיים על ידי ריסון פיזי40. היא גם דורשת עבודה רבה ועלולה להיות לא בטוחה לחוקרים בשל חשיפה מוגברת ל-HIV תוך שימוש בחדים. מתן אוראלי הוא אידיאלי כדי לחקות את הספיגה, ההפצה וההפרשה של תרופות cART כי הם נלקחים על ידי אנשים נגועים ב- HIV-1. מתן אוראלי כולל בדרך כלל הליכים מותאמים אישית ולעתים קרובות מייגעים כדי לשים את התרופות antiretroviral מעוקר (הכרחי בשל הכשל החיסוני של העכברים) מזון 24,37,41 או מים 42,43,44,45,46 אשר עשוי או לא יכול להיות תואם כימית עם תרופות אנטי-רטרו-ויראליות רבות, או לגרום למשהו שהעכברים לא יאכלו או ישתו בקלות (מה שישפיע על רמות המינון והתרופות בגוף)., שיטת ניהול ה- cART הפרולית החדשנית המוצעת כאן עולה על ניסיונות אספקה קודמים בשל תאימותה לסוגים שונים של תרופות אנטי-רטרו-ויראליות, בטיחות וקלות הכנה וניהולם, והפחתת מתח וחרדה של בעלי חיים הנובעים מההזרקה היומית.

Tenofovir disoproxil fumarate (TDF), Elvitegravir (ELV) ו- Raltegravir (RAL) הן תרופות מסיסות במים. באופן מעניין, הזמינות הביולוגית המוגברת של TDF נצפתה עם מזונות שומניים, מה שמרמז על כך שעיכוב תחרותי של ליפאזות על ידי מזון שומני עשוי לספק הגנה מסוימת ל-TDF47. לכן, כוסות DietGel Boost נבחרו להחליף צ'או מכרסם רגיל כשיטת אספקה המבוססת על תכולת השומן הצנועה שלהן (20.3 גרם ל-100 גרם) בהשוואה לצ'או מכרסמים רגיל (10 גרם ל-100 גרם) ודיאטה טיפוסית עתירת שומן של עכברים (40-60 גרם ל-100 גרם)48. המשקל הכולל של אחת הוא 75 גרם; לפיכך, כל תכיל את כמות המזון, ולכן תרופות, מספיק עבור 5 עכברים במשך 3 ימים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

רקמת עובר אנושית אנונימית נרכשה באופן מסחרי. המחקר בבעלי חיים בוצע על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי אוניברסיטת קליפורניה, לוס אנג'לס, וועדת המחקר בבעלי חיים (UCLA) (ARC) בהתאם לכל ההנחיות הפדרליות, המדינתיות והמקומיות. באופן ספציפי, כל הניסויים בוצעו בהתאם להמלצות ולהנחיות לדיור וטיפול בחיות מעבדה של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) והאגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה (AALAC) הבינלאומי תחת פרוטוקול ARC מספר UCLA 2010-038-02B. כל הניתוחים בוצעו תחת קטמין (100 מ"ג/ק"ג)/קסילזין (5 מ"ג/ק"ג) והרדמה איזופלורן (2-3 וולט%) וכל המאמצים נעשו כדי למזער את הכאב ואי הנוחות של בעלי החיים.

1. עכברים אנושיים נגועים ב- HIV-1

הערה: עכברים אנושיים נבנו כפי שתואר קודם לכןב-30,31,49. הפרוטוקול מתואר בקצרה להלן.

  1. לטהר את CD34+ תאי אב המטופויאטיים מהכבד העוברי האנושי באמצעות מיקרובים אנטי-CD34 בהתאם לפרוטוקול היצרן.
  2. להרדים עכברים זכרים ונקבות בני 6-8 שבועות מסוג NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) ולהקרין באופן תת-קטלני (2.7 Gy) לפני הניתוח.
  3. שתל תימוס, המופק מאותו תורם כמו כבד העובר, מתחת לכמוסת הכליה יחד עם הכבד.
  4. לאחר ההשתלה, הזריקו לעכברים 0.5 מיליון עד מיליון תאי CD34+, דרך הווריד.
  5. לאחר 8-10 שבועות, אסוף 100 μL של דם עכבר באמצעות דימום רטרו-אורביטלי50 לתוך צינורות microcentrifuge המכילים 5 μL של EDTA וצנטריפוגה ב 350 x g במשך 3 דקות.
  6. אחסן את הפלזמה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי לפקח על העומס הנגיפי לאחר שהעכבר נדבק ב- HIV-1. יש להוסיף 2 מ"ל של תמיסת NH4C 83% ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר כדי ללזות תאי דם אדומים.
  7. יש להוסיף 10 מ"ל של RPMI עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) כדי לעצור את התזה. סובב ב 300 x גרם במשך 5 דקות.
  8. לשאוף סופרנטנט. תאי כתם עם פאנל נוגדנים (ראו טבלת חומרים) ונתחו על ידי ציטומטריה של זרימה כדי לבדוק את השתלת תאי החיסון האנושיים.
  9. להדביק עכברים המציגים יותר מ-50% מתאי CD45+ במחזור הדם על ידי הזרקת ורידים רטרו-אורביטליים51,52 עם לפחות 200 ננוגרם של p24 של זן HIV-1 (כלומר, NFNSXSL9 30,53,54) באמצעות מזרק אינסולין. לאסוף דם דו שבועי לניתוח ציטומטריה זרימה ולמדוד את העומס הנגיפי.

2. הכנת תרופות ART

  1. לשקול תרופות בודדות; לדוגמה, כדי להכין 10 כוסות מזון עם cART, השתמש במגרדי תאים סטריליים כדי לשקול 250 מ"ג של FTC (Emtricitabine), 375 מ"ג של TDF ו-500 מ"ג של RAL או ELV לצינורות צנטריפוגה סטריליים בודדים של 15 מ"ל בארון בטיחות ביולוגית.
  2. הוסף 1 מ"ל של DMSO לתוך 250 מ"ג צינור FTC (ריכוז סופי של 250 מ"ג / מ"ל), הוסף 1.5 מ"ל של DMSO לתוך 375 מ"ג TDF צינור (ריכוז סופי של 250 מ"ג / מ"ל), והוסף 1 מ"ל של DMSO לתוך 500 מ"ג RAL או צינור ELV (ריכוז סופי של 500 מ"ג / מ"ל). מערבבים או מקטרים את תערובת התרופות עד להמסה מלאה ומתקבל פתרון ברור.
  3. השתמש במסנן קרום PVDF הידרופילי בגודל 0.22 μM כדי לעקר תמיסות באמצעות מזרק סטרילי. פתרונות סמים בודדים ניתן לאחסן ב -20 °C (75 °F) במשך 12 שבועות.
  4. כאשר הוא מוכן לשימוש, יש להפשיר אליקוט אחד של כל תמיסת תרופה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עד שהפתרון מתבהר. מערבבים היטב באמצעות פיפט.
  5. שלבו תרופות וערבבו היטב כדי ליצור תערובת מאסטר: 1 מ"ל של FTC ב-DMSO, 1.5 מ"ל של TDF ב-DMSO, ו-1 מ"ל של ELV או RAL ב-DMSO.
    הערה: כמות זו תכין 10 כוסות מזון.
  6. הוסיפו 350 מיקרון של תמיסת תערובת מאסטר cART לכוס אחת כדי להכין cART אחת של DietGel Boost.
  7. הוסיפו לכוס 0.75 מ"ל של טרימתופרים-סולפאמתוקסזול (ריכוז סופי של 0.48 מ"ג/מ"ל).
  8. מערבבים היטב באמצעות 1 מ"ל קצוות פיפטה סטריליים.
  9. אליקוט את המזון המכילה cART מהכוס המקורית עם מיקרו מרית על צלחת פטרי 60 מ"מ לפי הצורך. שקלו את המזון בסולם כדי לחשב את כמות המזון המכילה cART עבור כל כלוב בהתאם למספר העכברים.

3. מתן תרופות ART לעכברים נגועים ב- HIV-1

  1. הוציאו צ'או רגיל מהכלוב והחליפו אותו בכוס מזון המכילה cART.
    הערה: בממוצע, עכבר יאכל עד 5 גרם מזון ביום. ניתן לתת בערך מזון אחת לחמישה עכברים למשך יומיים.
  2. רעננו את האוכל של cART שלוש פעמים בשבוע.
  3. שקלו כוסות משומשות כדי לעקוב אחר הצריכת. שקלו עכברים מדי שבוע כדי לאשר את הצריכה.

4. עקוב אחר עומס ויראלי על ידי PCR בזמן אמת

  1. הערך את תאי מערכת החיסון האנושית (רמות תאי T מסוג CD4 ו-CD8) ואת שכפול ה-HIV-1 בעכברי BLT כל שבועיים על-ידי דימום רטרו-אורביטלי. קציר פלזמה על ידי ביצוע ההוראות בשלבים 1.5-1.8.
  2. עקוב אחר עומסים נגיפיים בפלזמה של עכברים הנגועים ב- HIV-1 לפני ובמהלך מתן cART דרך הפה במשך 8 שבועות. חלצו RNA נגיפי פלזמה מפלזמה באמצעות ערכת מיצוי RNA נגיפית וכמתו על ידי PCR בזמן אמת באמצעות פריימרים וגששים (ראו טבלת חומרים) כפי שתואר קודם לכן 27,30,31. השתמש בפרוטוקול המחזור הבא: 48 °C (15 דקות), 95 °C (10 דקות), ולאחר מכן רכיבה על אופניים 95 °C (15 שניות), 60 °C (דקה אחת) במשך 45 מחזורים.

5. הערך את יחסי CD4/CD8 לפי ציטומטריה של זרימה

  1. הכן תרחיפים חד-תאיים מדם היקפי של דימומים דו-שבועיים בשלבים 1.5-1.8.
  2. תאי כתם עם סמני פני השטח ולנתח על ידי ציטומטריה זרימה. השתמש בנוגדנים הבאים של סמן פני השטח 27,30,43,49 בציטומטריית זרימה: CD45 (שיבוט HI30), CD8 (שיבוט SK1), CD3 (שיבוט OKT3), CD4 (שיבוט RPA-T4)27,30,42,49.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בהנחה שעכבר ממוצע השוקל 25 גרם צורך 4 גרם מזון ביום, מינון התרופה היומית באמצעות צריכה פומית מתאים ל-2.88 מ"ג/ק"ג TFV, 83 מ"ג/ק"ג FTC ו-768 מ"ג/ק"ג RAL. כדי לבחון אם משטר המזון הממוטב רעיל ומשפיע על הבריאות הכללית בהשוואה להזרקה יומית של cART, משקל העכברים היה מנוטר מדי שבוע לפני ובמהלך cART באמצעות הזרקה דרך הפה או התת עור. לא היו הבדלי משקל משמעותיים לפני מתן cART בכל קבוצה (איור 1). עם זאת, משקל העכבר ירד ללא הרף במהלך הזרקת cART SC יומית. לעומת זאת, FTC/TDF/ELV או FTC/TDF/RAL ב-DietGel החזירו את משקל העכבר לרמות התחלת טרום-ART לאחר 5 שבועות של מתן cART דרך הפה. בנוסף, לא נצפו שינויים משמעותיים במשקל בין קבוצות Raltegravir או Elvitegravir.

כדי לבדוק אם מתן cART דרך הפה מדכא את העומס הנגיפי באותה יעילות כמו הזרקה יומית, הוערכו עומסים נגיפיים דו-שבועיים בפלזמה באמצעות RT-PCR. איור 2 מראה שמשטר המזון FTC/TDF/ELV ART דיכא ביעילות 100% את שכפול הנגיף לרמות בלתי ניתנות לגילוי תוך 4 שבועות; משטר המזון FTC/TDF/RAL ART יכול לדכא 80% מהעכברים לרמות בלתי ניתנות לגילוי תוך 4 שבועות, בעוד שרק 70% מהעכברים שקיבלו זריקת SC הגיעו לרמות בלתי ניתנות לגילוי לאחר 4 שבועות של טיפול. התוצאות הראו כי מתן פומי מדכא את שכפול הנגיף מהר יותר וביעילות רבה יותר מאשר הזרקת SC. יתר על כן, משטר המזון cART מנע ירידה נוספת של יחסי CD4/CD8 בדם ההיקפי מוקדם יותר מההזרקה היומית של SC (איור 3). תוצאות אלה הציעו כי משטר cART האוראלי המוצע יכול לדכא בהצלחה וירמיית פלזמה מתחת לרמת הזיהוי, לשחזר במהירות את רמות תאי ה- CD4 T ולשפר את הבריאות הכללית של בעלי החיים בעכברים אנושיים נגועים ב- HIV-1.

Figure 1
איור 1: משקל הגוף של עכבר משתנה לפני ובמהלך טיפול ב-cART לאחר הידבקות ב-HIV-1 בקבוצות שונות. עכברים שעברו הומניזציה נדבקוב-HIV NFNSXSL9 לאחר שיקום מערכת החיסון. לאחר 4 שבועות של הידבקות ב-HIV-1, עכברים טופלו במשך 7.5 שבועות נוספים עם משטר FTC/TDF/RAL באמצעות הזרקה תת-עורית (SC), או על ידי מתן פומי של FTC/TDF/RAL או FTC/TDF/ELV. משקלי הגוף של העכברים נמדדו החל משבוע לפני הידבקות ב-HIV. כל ההשוואות הסטטיסטיות נערכו באמצעות מבחן מאן-וויטני, ממוצע קבוצת דיווח (± S.E.). כוכבי כוכבית ירוקים מראים הבדלים סטטיסטיים בין קבוצת הזרקת המזון FTC/TDF/ELV לבין קבוצת הזרקת FTC/TDF/RAL SC. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. n=6-7 בכל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: מתן cART פומי למזון מראה דיכוי נגיפי מהיר יותר. כפי שמתואר באיור 1, עכברים לא טופלו או טופלו במשטר FTC/TDF/RAL באמצעות הזרקה תת-עורית, ובאמצעות מתן פומי של משטרי מזון מדומים, FTC/TDF/RAL או FTC/TDF/ELV למשך 7.5 שבועות נוספים. (A) עומס נגיפי בפלזמה לאורך זמן לאחר הידבקות ב- HIV-1 בקבוצות שונות. (B) סיכום העומס הנגיפי לאורך זמן לאחר הידבקות ב- HIV-1 בקבוצות שונות, דיווח על ממוצע גיאומטרי קבוצתי עם רווח בר-סמך של 95% (CI). חיצים שחורים מציינים את זמן התחלת cART עבור קבוצות שטופלו ב-cART. (C) ניתוח הישרדות של טיפול זמן לאחר cART לעומס ויראלי בלתי ניתן לגילוי עבור כל קבוצה. n= 6-7 בכל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: מתן אוראלי של מזון ART מראה שחזור מהיר יותר של יחס CD4/CD8. יחס CD4/CD8 בדם היקפי לאורך זמן לאחר הידבקות ב- HIV-1 עבור כל קבוצה. כל ההשוואות הסטטיסטיות נעשו באמצעות מבחן מאן-וויטני, ממוצע קבוצת דיווח (± S.E.). כוכביות אדומות מראות הבדלים סטטיסטיים בין קבוצת הזרקת המזון FTC/TDF/RAL לבין קבוצת הזרקת FTC/TDF/RAL SC. *P < 0.05. n=6-7 בכל קבוצה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שיטת מתן cART דרך הפה מפותחת כאן עבור עכברים נגועים ב- HIV-1 על ידי שילוב של שלוש תרופות אנטי-רטרו-ויראליות בתוך מזון עשיר בחומרים מזינים. בהשוואה למתן על ידי זריקות יומיות, משלוח דרך הפה קל יותר לשימוש, מגביל את תדירות הניהול, מפחית את הטיפול בבעלי חיים, ממזער מתח ומשפר את הבטיחות55. עד לנקודה זו, רק מחקרים מעטים בעכברים אנושיים 24,37,41 השתמשו בכדורי מזון המכילים תרופות ART כתושות לטיפול בעכברים. עם זאת, שיטה זו מאתגרת ליישום נרחב בשל גישה מוגבלת לייצור כדורי מזון מיוחדים. מחקרים אחרים 42,43,44,45,46 השתמשו במי שתייה כמערכת אספקת cART. עם זאת, שילוב של תרופה במי השתייה עלול לשנות את היציבות, הטוהר או אפילו העוצמה של החומרים הפעילים. בנוסף, תרופות אנטי-רטרו-ויראליות רבות, כולל TDF, RAL ו-ELV, אינן מסיסות במים. מחקרים הראו כי הזמינות הביולוגית של TDF דרך הפה עלתה ב-40% לאחר ארוחה עתירת שומן56, מה שמצביע על כך שעיכוב תחרותי של ליפאזות על ידי מזון עשוי לספק הגנה מסוימת ל-TDF57. DietGel Boost הוא תוסף מזון המספק הידרציה, תזונה ומוצרי העשרה המשפרים את הרווחה הכללית של חיות מחקר58. הג'ל המועשר בחומרים מזינים מורכב מ-25%-30% מים טהורים בתוספת פחמימות, חלבונים, שומנים, מינרלים ואלקטרוליטים, והוא מאושר כנטול פיטואסטרוגנים וניטרוסאמינים58. הוא מספק חלופה חסכונית, יעילה ויעילה לעבודה לדיאטות מחית58. מאחר ש-20.3% מכלל השומן נכללו בכוס Boost, אנו מציעים שרמות גבוהות של חומרים מזינים יכולות להמיס את ה-TDF בצורה טובה יותר, ולכן להגדיל את הזמינות הביולוגית שלו דרך הפה. לכן, תרחיף מזון עשיר בחומרים מזינים נוצל כדי לספק את תרופות ה- cART כדי לחקות את האספקה הפרואורלית של תרופות cART שאנשים נגועים ב- HIV-1 משתמשים בהן כיום.

לעכברים יש חילוף חומרים גבוה יותר מאשר לבני אדם, ולכן המינון של התרכובות הנפרדות הומר ונעשה בו שימוש על ידי נוסחה כמתואר בהתייחסות59. מינונים אנושיים של 0.4 מ"ג (מינון כולל) של RAL, 0.1 מ"ג (מינון כולל) של FTC ו-2.14 מ"ג (מינון כולל) של TDF הומרו על בסיס גורם תיקון (ק"מ, המוערך על ידי חלוקת משקל הגוף הממוצע (ק"ג) של מינים בשטח הפנים של גופו (מ'2)) כדי להעריך את ערכי המינון המקבילים לעכבר של 37 (ק"מ) ו-3 (ק"מ) עבור בני אדם ועכברים59, בהתאמה. בהתחשב במסיסות הנמוכה יחסית של TDF, RAL ו-ELV במים, DMSO שימש כאן כממס לתרופות cART. הריכוז הסופי של DMSO הכלול במזון cART דרך הפה הוא 0.0059% (v/v). ריכוז ה-DMSO נמוך מאוד ובטוח יחסית כממס תרופתי60,61,62,63. חשוב לציין שבמחקרים אלה לא נצפו אובדן פרווה או שינויי התנהגות כלשהם בעכברים.

ההליך שתואר לעיל הוא שיטת העברת cART חזקה ביותר וניתנת לחזרה לטיפול בעכברים אנושיים נגועים ב- HIV-1. ניתן לעקוב אחר פרוטוקול זה בקלות. השלבים הקריטיים בפרוטוקול הם 1) לשמור על סטרילי כל התהליך של כל חומר המעורב בפרוטוקול הקשור למזון DietGel בהתחשב בכשל חיסוני של העכברים ההומנים, ו-2) להימנע ממספר פתרונות הפשרה/הקפאה של cART, ותרופות cART אליקוט כראוי על פי מספרי עכברים וקבוצות. הנתונים מצביעים על כך שמתן פומי של cART בעל שלוש תרופות (TDF, FTC ו-RAL או ELV) מעורבב מראש בתוך המזון מדכא ביעילות את שכפול ה-HIV-1 ומפחית את העומס הנגיפי בפלזמה לרמות בלתי ניתנות לגילוי תוך 4 שבועות מהטיפול. מתן מזון cART דרך הפה לא רק מנע ירידה נוספת בתאי T מסוג CD4, אלא גם הביא לעלייה באחוז תאי ה-CD4 T בדם ההיקפי. בנוסף, שיטת מתן cART דרך הפה החזירה את משקל העכבר מהר יותר מהזרקה יומית ושיפרה את הבריאות הכללית.

חשוב לציין ששיטה זו הסירה את הסיכון לחשיפה של החוקר לחדים במהלך הזרקה יומית של תרופות cART לעכברים אנושיים נגועים ב- HIV-1. השיטה המוצעת המדכאת בהצלחה שכפול RNA של HIV-1 בעכברים אנושיים תהיה בעלת ערך רב למחקרי הוכחת היתכנות פרה-קליניים לפיתוח טיפולי ריפוי חדשניים המחקים באופן הדוק את אספקת התרופה באנשים הנגועים ב- HIV-1 כרוניים שטופלו ב- cART.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SK היא המייסדת של CDR3 Inc. שאר המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר קשרים מסחריים או פיננסיים שיכולים להתפרש כניגוד עניינים פוטנציאלי.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לד"ר רומאס גלזיונאס ולג'ף מורי ולאנשים בגיליאד על אספקת התרופות האנטי-רטרו-ויראליות ששימשו במחקר זה. עבודה זו מומנה על ידי NCI 1R01CA239261-01 (למטבח), מענקי NIH P30AI28697 (ליבת הווירולוגיה של UCLA CFAR, ליבת הטיפול בגנים ותאים, וליבת עכבר אנושית), U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (לג'ן), NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (קאריו). עבודה זו נתמכה גם על ידי מכון האיידס של UCLA, קרן הצדקה על שם ג'יימס ב. פנדלטון וקרן משפחת מקארתי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm petri dish Thermo Scientific Nunc 150288 For aliquoting ART food
APC anti-human CD8 Antibody Biolegend 344722 For flow cytometry
BD LSRFortessa BD biosciences For flow data collection
CD34 microbeads Miltenyi Biotec 130-046-702 For NSG-BLT mice generation
Centrifuge tubes Falcon 14-432-22 For dissolving ART
DietGel Boost ClearH2O 72-04-5022 For making ART food
Elvitegravir Gilead Gifted from Gilead
Emtricitabine Gilead Gifted from Gilead
FITC anti-human CD3 Antibody Biolegend 317306 For flow cytometry
Flowjo software FlowJo For flow cytometry data analysis
HIV-1 forward primer: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 probe: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′;		 IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 reverse primer: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
Human fetal tissue Advanced Bioscience Resources, Inc
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Pacific Blue anti-human CD45 Biolegend 304022 For flow cytometry
PerCP anti-human CD4 Antibody Biolegend 300528 For flow cytometry
QIAamp Viral RNA Kits Qiagen  52904 For measuring viral load
Raltegravir Merck Gifted from Merck
Sterile cell scrapers Thermo Scientific 179693 For aliquoting ART food
TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit Applied Biosystems 4392653 For plasma viral load detection
Tenofovir disoproxil fumarate Gilead Gifted from Gilead
Trimethoprim-Sulfamethoxazole Pharmaceutical Associates NDC 0121-0854-16 For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains
200 mg Sulfamethoxazole, USP
40 mg Trimethoprim, USP
NMT 0.5% Alcohol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Antiretroviral Therapy Cohort Collaboration. Life expectancy of individuals on combination antiretroviral therapy in high-income countries: a collaborative analysis of 14 cohort studies. Lancet. 372 (9635), 293-299 (2008).
  2. May, M. T., et al. Impact on life expectancy of HIV-1 positive individuals of CD4+ cell count and viral load response to antiretroviral therapy. AIDS. 28 (8), 1193-1202 (2014).
  3. Autran, B., et al. Positive effects of combined antiretroviral therapy on CD4+ T cell homeostasis and function in advanced HIV disease. Science. 277 (5322), 112-116 (1997).
  4. Palella, F. J., et al. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV outpatient study investigators. The New England Journal of Medicine. 338 (13), 853-860 (1998).
  5. Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
  6. Ananworanich, J., Dube, K., Chomont, N. How does the timing of antiretroviral therapy initiation in acute infection affect HIV reservoirs. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (1), 18-28 (2015).
  7. Whitney, J. B., et al. Rapid seeding of the viral reservoir prior to SIV viraemia in rhesus monkeys. Nature. 512 (7512), 74-77 (2014).
  8. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4 T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  9. Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature Immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  10. Brothers, T. D., et al. Frailty in people aging with human immunodeficiency virus (HIV) infection. Journal of Infectious Disease. 210 (8), 1170-1179 (2014).
  11. D. A. D. Study Group. Use of nucleoside reverse transcriptase inhibitors and risk of myocardial infarction in HIV-infected patients enrolled in the D:A:D study: a multi-cohort collaboration. Lancet. 371 (9622), 1417-1426 (2008).
  12. Schouten, J., et al. Cross-sectional comparison of the prevalence of age-associated comorbidities and their risk factors between HIV-infected and uninfected individuals: the AGEhIV cohort study. Clinical Infectious Diseases. 59 (12), 1787-1797 (2014).
  13. Policicchio, B. B., Pandrea, I., Apetrei, C. Animal models for HIV cure research. Frontiers in Immunology. 7, 12 (2016).
  14. Hessell, A. J., Haigwood, N. L. Animal models in HIV-1 protection and therapy. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (3), 170-176 (2015).
  15. Ambrose, Z., KewalRamani, V. N., Bieniasz, P. D., Hatziioannou, T. HIV/AIDS: in search of an animal model. Trends in Biotechnology. 25 (8), 333-337 (2007).
  16. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature Medicine. 12 (11), 1316 (2006).
  17. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  18. Wege, A. K., Melkus, M. W., Denton, P. W., Estes, J. D., Garcia, J. V. Functional and phenotypic characterization of the humanized BLT mouse model. Current Topics in Microbiology and Immunology. 324, 149-165 (2008).
  19. Garcia, J. V. In vivo platforms for analysis of HIV persistence and eradication. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 424-431 (2016).
  20. Carrillo, M. A., Zhen, A., Kitchen, S. G. The use of the humanized mouse model in gene therapy and immunotherapy for HIV and cancer. Frontiers in Immunology. 9, 746 (2018).
  21. Abeynaike, S., Paust, S. Humanized mice for the evaluation of novel HIV-1 therapies. Frontiers in Immunology. 12, 636775 (2021).
  22. Marsden, M. D., Zack, J. A. Humanized mouse models for human immunodeficiency virus infection. Annual Review of Virology. 4 (1), 393-412 (2017).
  23. Brainard, D. M., et al. Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
  24. Nischang, M., et al. Humanized mice recapitulate key features of HIV-1 infection: a novel concept using long-acting anti-retroviral drugs for treating HIV-1. PLoS One. 7 (6), 38853 (2012).
  25. Garcia-Beltran, W. F., et al. Innate immune reconstitution in humanized bone marrow-liver-thymus (HuBLT) mice governs adaptive cellular immune function and responses to HIV-1 infection. Frontiers in Immunology. 12, 667393 (2021).
  26. Cheng, L., et al. Blocking type I interferon signaling enhances T cell recovery and reduces HIV-1 reservoirs. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 269-279 (2017).
  27. Zhen, A., et al. Targeting type I interferon-mediated activation restores immune function in chronic HIV infection. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 260-268 (2017).
  28. Khamaikawin, W., et al. Modeling anti-HIV-1 HSPC-based gene therapy in humanized mice previously infected with HIV-1. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 23-32 (2018).
  29. Kitchen, S. G., et al. Engineering antigen-specific T cells from genetically modified human hematopoietic stem cells in immunodeficient mice. PLoS One. 4 (12), 8208 (2009).
  30. Zhen, A., et al. Robust CAR-T memory formation and function via hematopoietic stem cell delivery. PLoS Pathogens. 17 (4), 1009404 (2021).
  31. Zhen, A., et al. HIV-specific immunity derived from chimeric antigen receptor-engineered stem cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
  32. Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2013).
  33. Mu, W., Carrillo, M. A., Kitchen, S. G. Engineering CAR T cells to target the hiv reservoir. Frontiers in Celluar and Infection Microbiology. 10, 410 (2020).
  34. Arts, E. J., Hazuda, D. J. HIV-1 antiretroviral drug therapy. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 2 (4), 007161 (2012).
  35. Denton, P. W., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  36. Kovarova, M., et al. A long-acting formulation of the integrase inhibitor raltegravir protects humanized BLT mice from repeated high-dose vaginal HIV challenges. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (6), 1586-1596 (2016).
  37. Lavender, K. J., et al. An advanced BLT-humanized mouse model for extended HIV-1 cure studies. AIDS. 32 (1), 1-10 (2018).
  38. Denton, P. W., et al. Targeted cytotoxic therapy kills persisting HIV infected cells during ART. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003872 (2014).
  39. Marsden, M. D., et al. In vivo activation of latent HIV with a synthetic bryostatin analog effects both latent cell "kick" and "kill" in strategy for virus eradication. PLoS Pathogens. 13 (9), 1006575 (2017).
  40. Stuart, S. A., Robinson, E. S. Reducing the stress of drug administration: implications for the 3Rs. Science Report. 5, 14288 (2015).
  41. Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
  42. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics reduce systemic and gut inflammation in chronic treated HIV. PLoS Pathogens. 18 (1), 1010160 (2022).
  43. Mu, W., et al. Apolipoprotein A-I mimetics attenuate macrophage activation in chronic treated HIV. AIDS. 35 (4), 543-553 (2021).
  44. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics favorably impact cyclooxygenase 2 and bioactive lipids that may contribute to cardiometabolic syndrome in chronic treated HIV. Metabolism. 124, 154888 (2021).
  45. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational antiretroviral therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
  46. Llewellyn, G. N., et al. Humanized mouse model of HIV-1 latency with enrichment of latent virus in PD-1(+) and TIGIT(+) CD4 T cells. Journal of Virology. 93 (10), 02086 (2019).
  47. Kearney, B. P., Flaherty, J. F., Shah, J. Tenofovir disoproxil fumarate: clinical pharmacology and pharmacokinetics. Clinical Pharmacokinetics. 43 (9), 595-612 (2004).
  48. Speakman, J. R. Use of high-fat diets to study rodent obesity as a model of human obesity. International Journal of Obesity (Lond). 43 (8), 1491-1492 (2019).
  49. Zhen, A., et al. Stem-cell based engineered immunity against HIV infection in the humanized mouse model. Journal of Visualized Experiments. (113), e54048 (2016).
  50. Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A detailed protocol for characterizing the murine C1498 cell line and its associated leukemia mouse model. Journal of Visualized Experiments. (116), e54270 (2016).
  51. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
  52. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  53. Shimizu, S., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  54. Ladinsky, M. S., et al. Mechanisms of virus dissemination in bone marrow of HIV-1-infected humanized BLT mice. Elife. 8, 46916 (2019).
  55. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  56. Lamorde, M., et al. Effect of food on the steady-state pharmacokinetics of tenofovir and emtricitabine plus efavirenz in Ugandan adults. AIDS Research and Treatment. 2012, 105980 (2012).
  57. Watkins, M. E., et al. Development of a novel formulation that improves preclinical bioavailability of tenofovir disoproxil fumarate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 906-919 (2017).
  58. Moccia, K. D., Olsen, C. H., Mitchell, J. M., Landauer, M. R. Evaluation of hydration and nutritional gels as supportive care after total-body irradiation in mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (3), 323-328 (2010).
  59. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  60. Santos, N. C., Figueira-Coelho, J., Martins-Silva, J., Saldanha, C. Multidisciplinary utilization of dimethyl sulfoxide: pharmacological, cellular, and molecular aspects. Biochemical Pharmacology. 65 (7), 1035-1041 (2003).
  61. Kolb, K. H., Jaenicke, G., Kramer, M., Schulze, P. E. Absorption, distribution and elimination of labeled dimethyl sulfoxide in man and animals. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 85-95 (1967).
  62. Yellowlees, P., Greenfield, C., McIntyre, N. Dimethylsulphoxide-incuded toxicity. Lancet. 2 (8202), 1004-1006 (1980).
  63. Swanson, B. N. Medical use of dimethyl sulfoxide (DMSO). Reviews in Clinical & Basic Pharmacology. 5 (1-2), 1-33 (1985).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 188
טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב דרך הפה בעכברים נגועים ב- HIV-1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A.,… More

Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A., Rezek, V., Martin, H., Lizarraga, M., Kitchen, S. Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice. J. Vis. Exp. (188), e63696, doi:10.3791/63696 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter