Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Orale gecombineerde antiretrovirale behandeling bij hiv-1 geïnfecteerde gehumaniseerde muizen

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/63696
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Hematology and Oncology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om orale gecombineerde antiretrovirale geneesmiddelen te leveren die met succes hiv-1-RNA-replicatie bij gehumaniseerde muizen onderdrukken.

Abstract

De pandemie van het humaan immunodeficiëntievirus (HIV-1) blijft zich wereldwijd onverminderd verspreiden en momenteel is er geen vaccin beschikbaar tegen HIV. Hoewel gecombineerde antiretrovirale therapie (cART) succesvol is geweest in het onderdrukken van virale replicatie, kan het het reservoir van HIV-geïnfecteerde personen niet volledig uitroeien. Een veilige en effectieve genezingsstrategie voor HIV-infectie vereist multipronged methoden, en daarom zijn de vooruitgang van diermodellen voor HIV-1-infectie cruciaal voor de ontwikkeling van hiv-genezingsonderzoek. Gehumaniseerde muizen recapituleren de belangrijkste kenmerken van hiv-1-infectie. Het gehumaniseerde muismodel kan worden geïnfecteerd door HIV-1 en virale replicatie kan worden gecontroleerd met cART-regimes. Bovendien resulteert cART-onderbreking in een snelle virale rebound bij gehumaniseerde muizen. Toediening van cART aan het dier kan echter ineffectief, moeilijk of toxisch zijn en veel klinisch relevante cART-regimes kunnen niet optimaal worden gebruikt. Naast het feit dat het potentieel onveilig is voor onderzoekers, veroorzaakt toediening van cART door een veelgebruikte intensieve dagelijkse injectieprocedure stress door fysieke beperking van het dier. De nieuwe orale cART-methode voor de behandeling van HIV-1 geïnfecteerde gehumaniseerde muizen die in dit artikel worden beschreven, resulteerde in onderdrukking van viremie onder het detectieniveau, verhoogde snelheid van CD4 + -herstel en verbeterde algehele gezondheid bij HIV-1 geïnfecteerde gehumaniseerde muizen.

Introduction

De levensverwachting van personen die met chronisch humaan immunodeficiëntievirus (HIV) zijn geïnfecteerd, is aanzienlijk verbeterd met combinatie antiretrovirale behandeling (cART)1,2. cART vermindert met succes de HIV-1-replicatie en verhoogt het aantal CD4 + T-cellen tot normaliteit bij de meerderheid van hiv-1 chronisch geïnfecteerde deelnemers3, wat resulteert in een verbeterde algehele gezondheid en dramatisch verminderde ziekteprogressie4. Het latente HIV-1-reservoir wordt echter zelfs vastgesteld wanneer ART wordt geïnitieerd tijdens acute infectie 5,6,7. Reservoirs blijven jarenlang bestaan tijdens ART en snelle virale rebound na ART-onderbreking is goed gedocumenteerd 8,9. Mensen met hiv op ART zijn ook vatbaar voor een hoger risico op comorbiditeiten zoals hart- en vaatziekten, kanker en neurostoornissen 10,11,12. Daarom is een functionele remedie voor HIV nodig. Diermodellen voor HIV-1-infectie bieden duidelijke voordelen bij het ontwikkelen en valideren van nieuwe HIV-genezingsstrategieën 13,14,15. Gehumaniseerde muizen, als een klein diermodel, kunnen multilineage menselijke immuuncelreconstitutie in verschillende weefsels bieden, wat de nauwkeurige studie van HIV-infectie mogelijk maakt 16,17,18,19. Onder gehumaniseerde modellen recapituleert het gehumaniseerde beenmerg-lever-thymus (BLT) -model met succes chronische HIV-1-infectie en functionele menselijke immuunresponsen op HIV-1-infectie 20,21,22,23,24. Daarom is het gehumaniseerde BLT-muismodel op grote schaal gebruikt om verschillende aspecten op het gebied van HIV-onderzoek te onderzoeken. Gehumaniseerde BLT-muizen zijn niet alleen gevestigde modellen voor de recapitulatie van persistente HIV-1-infectie en pathogenese, maar ook consequente hulpmiddelen voor de evaluatie van op celtherapie gebaseerde interventiestrategieën. De huidige auteurs en anderen hebben aangetoond dat het gehumaniseerde BLT-muizenmodel persistente HIV-1-infectie en pathogenese 25,26,27 samenvat en hulpmiddelen biedt om op celtherapie gebaseerde interventiestrategieën te evalueren 28,29,30,31,32,33.

cART-regimes bestaande uit combinaties van antiretrovirale geneesmiddelen die dagelijks worden ingenomen, onderdrukken hiv-1-replicatie tot het punt dat de virale lading bij succesvol behandelde personen op lange termijn niet detecteerbaar blijft34. De resultaten van de behandeling van hiv-geïnfecteerde gehumaniseerde muizen met klinisch relevante cART-regimes lijken op die waargenomen bij hiv-1 geïnfecteerde art-behandelde personen22: HIV-1-niveaus worden onderdrukt onder de detectiegrenzen en onderbreking van cART resulteert in een rebound van HIV-replicatie uit het latente reservoir35. Subcutane (SC)27,36,37 of intraperitoneale (IP)37,38,39 injectie is de route die vaak wordt gebruikt voor cART-behandeling bij gehumaniseerde muizen. Intensieve dagelijkse injectie veroorzaakt echter stress bij dieren door fysieke terughoudendheid40. Het is ook arbeidsintensief en potentieel onveilig voor onderzoekers vanwege verhoogde blootstelling aan HIV tijdens het gebruik van scherpe voorwerpen. Orale toediening is ideaal om de absorptie, distributie en uitscheiding na te bootsen van cART-geneesmiddelen die worden ingenomen door HIV-1-geïnfecteerde personen. Orale toediening omvat meestal aangepaste en vaak moeizame procedures om de antiretrovirale geneesmiddelen in gesteriliseerd (noodzakelijk vanwege de immunodeficiëntie van de muizen) voedsel 24,37,41 of water 42,43,44,45,46 , die al dan niet chemisch compatibel zijn met veel antiretrovirale geneesmiddelen, of resulteren in iets dat de muizen niet gemakkelijk zouden eten of drinken (wat de dosis- en medicijnniveaus in het lichaam zou beïnvloeden). De nieuwe perorale cART-toedieningsmethode die hier wordt voorgesteld, overtreft eerdere toedieningspogingen vanwege de compatibiliteit met verschillende soorten antiretrovirale geneesmiddelen, de veiligheid en het gemak van voorbereiding en toediening, en de vermindering van stress en angst bij dieren als gevolg van de dagelijkse injectie.

Tenofovirdisoproxilfumaraat (TDF), Elvitegravir (ELV) en Raltegravir (RAL) zijn slecht in water oplosbare geneesmiddelen. Interessant is dat een verhoogde biologische beschikbaarheid van TDF wordt waargenomen met vet voedsel, wat suggereert dat competitieve remming van lipasen door vet voedsel een zekere bescherming voor TDF47 kan bieden. Daarom werden DietGel Boost-bekers geselecteerd om reguliere knaagdier chow te vervangen als de leveringsmethode op basis van hun bescheiden vetgehalte (20,3 g per 100 g) in vergelijking met gewone knaagdier chow (10 g per 100 g) en een typisch muis vetrijk dieet (40-60 g per 100 g)48. Het totale gewicht van één kopje is 75 g; dus elke beker bevat de hoeveelheid voedsel en dus het medicijn, voldoende voor vijf muizen gedurende 3 dagen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Geanonimiseerd menselijk foetaal weefsel werd commercieel verkregen. Dieronderzoek werd uitgevoerd volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Universiteit van Californië, Los Angeles en (UCLA) Animal Research Committee (ARC) in overeenstemming met alle federale, staats- en lokale richtlijnen. In het bijzonder werden alle experimenten uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen en richtlijnen voor huisvesting en verzorging van proefdieren van de National Institutes of Health (NIH) en de Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) International onder UCLA ARC Protocol Number 2010-038-02B. Alle operaties werden uitgevoerd onder ketamine (100 mg /kg) / xylazine (5 mg / kg) en isofluraanane anesthesie (2-3 vol%) en alle inspanningen werden geleverd om pijn en ongemak bij dieren te minimaliseren.

1. Gehumaniseerde muizen geïnfecteerd met HIV-1

OPMERKING: Gehumaniseerde muizen werden geconstrueerd zoals eerder beschreven in 30,31,49. Het protocol wordt hieronder kort beschreven.

  1. Zuiver CD34 + hematopoietische voorlopercellen uit de menselijke foetale lever via anti-CD34 microbeads volgens het protocol van de fabrikant.
  2. Anesthetiseer 6-8 weken oude NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) mannelijke en vrouwelijke muizen en bestraling subletaal (2,7 Gy) vóór de operatie.
  3. Implanteer thymus, afgeleid van dezelfde donor als de foetale lever, onder de niercapsule samen met de lever.
  4. Na implantatie injecteert u muizen intraveneus met 0,5 miljoen tot een miljoen CD34+ cellen.
  5. Verzamel na 8-10 weken 100 μL muizenbloed via retro-orbitale bloeding50 in microcentrifugebuizen met 5 μL EDTA en centrifugeer bij 350 x g gedurende 3 minuten.
  6. Bewaar het plasma bij -80 °C om de virale lading te controleren nadat de muis is geïnfecteerd met HIV-1. Voeg 2 ml 83% NH4C-oplossing toe en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om rode bloedcellen te lyseren.
  7. Voeg 10 ml RPMI toe met 10% foetaal runderserum (FBS) om de lysis te stoppen. Draai op 300 x g gedurende 5 min.
  8. Aspirate supernatant. Kleur cellen met antilichaampaneel (zie Tabel van materialen) en analyseer door flowcytometrie om de entransplantatie van menselijke immuuncellen te controleren.
  9. Infecteer muizen die meer dan 50% van de circulerende CD45+ cellen vertonen door retro-orbitale aderinjectie51,52 met ten minste 200 ng p24 van een HIV-1 stam (d.w.z. NFNSXSL9 30,53,54) met behulp van een insulinespuit. Verzamel tweewekelijks bloed voor flowcytometrie-analyse en om de virale lading te meten.

2. Bereiding van ART-medicijnen

  1. Weeg individuele medicijnen; als u bijvoorbeeld 10 voedselbekers met cART wilt maken, gebruikt u steriele celschrapers om 250 mg FTC (Emtricitabine), 375 mg TDF en 500 mg RAL of ELV af te wegen in individuele steriele centrifugebuizen van 15 ml in een bioveiligheidskast.
  2. Voeg 1 ml DMSO toe aan de FTC-buis van 250 mg (eindconcentratie van 250 mg/ml), voeg 1,5 ml DMSO toe aan de buis van 375 mg TDF (eindconcentratie van 250 mg/ml) en voeg 1 ml DMSO toe aan de buis van 500 mg RAL of ELV (eindconcentratie van 500 mg/ml). Roer of pipetteer het medicijnmengsel totdat het volledig is opgelost en een heldere oplossing is verkregen.
  3. Gebruik een hydrofiel PVDF-membraanfilter van 0,22 μM om oplossingen te steriliseren met een steriele spuit. Individuele geneesmiddeloplossingen kunnen gedurende 12 weken bij -20 °C worden bewaard.
  4. Wanneer u klaar bent voor gebruik, ontdooit u vers één aliquot van elke geneesmiddeloplossing bij 37 °C totdat de oplossing helder wordt. Meng goed met een pipet.
  5. Combineer medicijnen en meng goed om mastermix te maken: 1 ml FTC in DMSO, 1,5 ml TDF in DMSO en 1 ml ELV of RAL in DMSO.
    OPMERKING: Dit bedrag maakt 10 voedselbekers.
  6. Voeg 350 μL cART master mix oplossing toe aan één kopje om één DietGel Boost cART cup te maken.
  7. Voeg 0,75 ml Trimethoprim-Sulfamethoxazol (0,48 mg / ml eindconcentratie) toe aan de cup.
  8. Roer grondig met behulp van 1 ml steriele pipetpunten.
  9. Plaats de voedselbeker met cART uit de originele beker met een microspatel op een petrischaal van 60 mm als dat nodig is. Weeg het voedsel op een weegschaal om de hoeveelheid voedselbeker met cART voor elke kooi te berekenen op basis van het aantal muizen.

3. Toediening van ART-geneesmiddelen aan hiv-1-geïnfecteerde muizen

  1. Haal gewone chow uit de kooi en vervang deze door een voedselbeker met cART.
    OPMERKING: Gemiddeld eet een muis tot 5 g voedsel per dag. Ongeveer één voedselbeker kan gedurende 2 dagen aan vijf muizen worden toegediend.
  2. Ververs cART-voedsel drie keer per week.
  3. Weeg gebruikte bekers om de inname te controleren. Weeg muizen wekelijks om de consumptie te bevestigen.

4. Monitor viral load door real-time PCR

  1. Beoordeel menselijke immuuncellen (CD4- en CD8 T-celniveaus) en HIV-1-replicatie in BLT-muizen elke 2 weken door retro-orbitale bloedingen. Oogst plasma door de instructies in stap 1.5-1.8 te volgen.
  2. Controleer plasma virale ladingen van muizen geïnfecteerd met HIV-1 voor en tijdens orale cART toediening gedurende 8 weken. Extraheer plasmaviraal RNA uit plasma met behulp van een virale RNA-extractiekit en kwantificeer het door real-time PCR met behulp van de primers en sondes (zie Tabel van materialen) zoals eerder beschreven 27,30,31. Gebruik het volgende fietsprotocol: 48 °C (15 min), 95 °C (10 min), dan fietsen 95 °C (15 s), 60 °C (1 min) gedurende 45 cycli.

5. Beoordeel CD4/CD8-verhoudingen door middel van flowcytometrie

  1. Bereid eencellige suspensies voor uit perifeer bloed van tweewekelijkse bloedingen volgens stappen 1.5-1.8.
  2. Kleur cellen met oppervlaktemarkers en analyseer door flowcytometrie. Gebruik de volgende oppervlaktemarkerantistoffen 27,30,43,49 in flowcytometrie: CD45 (kloon HI30), CD8 (kloon SK1), CD3 (kloon OKT3), CD4 (kloon RPA-T4)27,30,42,49.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ervan uitgaande dat een gemiddelde muis met een gewicht van 25 g 4 g voedsel per dag consumeert, komt de dagelijkse geneesmiddeldosis via orale inname overeen met 2,88 mg / kg TFV, 83 mg / kg FTC en 768 mg / kg RAL. Om te testen of het geoptimaliseerde voedselregime giftig is en de algehele gezondheid beïnvloedt in vergelijking met dagelijkse injectie van cART, werd het gewicht van muizen wekelijks vóór en tijdens cART gecontroleerd via orale of subcutane injectie. Er waren geen significante gewichtsverschillen vóór toediening van cART in elke groep (figuur 1). Het gewicht van de muis nam echter voortdurend af tijdens de dagelijkse cART SC-injectie. Daarentegen herstelde FTC/TDF/ELV of FTC/TDF/RAL in DietGel het muisgewicht naar pre-ART startniveaus na 5 weken orale cART-toediening. Bovendien werden geen significante gewichtsveranderingen waargenomen tussen de groepen Raltegravir of Elvitegravir.

Om te testen of orale toediening van cART de virale lading net zo effectief onderdrukt als een dagelijkse injectie, werden tweewekelijkse plasma-virale ladingen beoordeeld met RT-PCR. Figuur 2 laat zien dat FTC/TDF/ELV ART-voedselregime de virale replicatie binnen 4 weken 100% efficiënt onderdrukte tot niet-detecteerbare niveaus; FTC / TDF / RAL ART-voedingsregime kan 80% van de muizen binnen 4 weken tot niet-detecteerbare niveaus onderdrukken, terwijl slechts 70% van de muizen die SC-injectie kregen, na 4 weken behandeling niet-detecteerbare niveaus bereikte. De resultaten toonden aan dat orale toediening virale replicatie sneller en efficiënter onderdrukt dan SC-injectie. Bovendien voorkwam het cART-voedingsregime de verdere daling van CD4/CD8-verhoudingen in het perifere bloed eerder dan de dagelijkse SC-injectie (figuur 3). Deze resultaten suggereerden dat het voorgestelde orale cART-regime met succes plasmaviremie onder het detectieniveau kan onderdrukken, de CD4 T-celniveaus snel kan herstellen en de algehele gezondheid van de dieren bij hiv-1-geïnfecteerde gehumaniseerde muizen kan verbeteren.

Figure 1
Figuur 1: Het lichaamsgewicht van de muis verandert voor en tijdens de behandeling met cART na hiv-1-infectie in verschillende groepen. Gehumaniseerde muizen werden geïnfecteerd met HIVNFNSXSL9 na immuunreconstitutie. Na 4 weken HIV-1-infectie werden muizen nog eens 7,5 weken behandeld met FTC / TDF / RAL-regime via subcutane (SC) injectie, of door orale toediening van FTC / TDF / RAL of FTC / TDF / ELV. Het lichaamsgewicht van de muis werd gemeten vanaf 1 week voor de hiv-infectie. Alle statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van de Mann-Whitney-test, rapporterend groepsgemiddelde (± S.E.). Groene sterretjes tonen statistische verschillen tussen FTC/TDF/ELV voedsel orale groep en FTC/TDF/RAL SC injectiegroep. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. n=6-7 in elke groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Orale toediening van cART in voedsel toont een snellere virale onderdrukking. Zoals beschreven in figuur 1, werden muizen onbehandeld of behandeld met FTC / TDF / RAL-regime door subcutane injectie en door orale toediening van voedselbeker mock, FTC / TDF / RAL of FTC / TDF / ELV-voedselregimes gedurende nog eens 7,5 weken. (A) Plasma virale lading na verloop van tijd na HIV-1 infectie in verschillende groepen. (B) Samenvatting van de virale lading in de loop van de tijd na HIV-1-infectie in verschillende groepen, rapporterend groep geometrisch gemiddelde met 95% betrouwbaarheidsinterval (CI). Zwarte pijlen geven het tijdstip van cART-initiatie aan voor met cART behandelde groepen. (C) Overlevingsanalyse van de tijd na de behandeling met cART tot niet-detecteerbare virale lading voor elke groep. n= 6-7 in elke groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: ART food oral administrations laten een sneller herstel van de CD4/CD8-verhouding zien. CD4/CD8-verhouding in perifeer bloed na verloop van tijd na HIV-1-infectie voor elke groep. Alle statistische vergelijkingen werden gedaan met behulp van de Mann-Whitney-test, rapporterend groepsgemiddelde (± S.E.). Rode sterretjes tonen statistische verschillen tussen FTC/TDF/RAL voedsel orale groep en FTC/TDF/RAL SC injectiegroep. *P < 0,05. n=6-7 in elke groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een orale cART-toedieningsmethode wordt hier ontwikkeld voor HIV-1 geïnfecteerde gehumaniseerde muizen door drie antiretrovirale geneesmiddelen te combineren in voedsel met een hoog voedingsgehalte. In vergelijking met toediening door dagelijkse injecties is orale toediening gemakkelijker te gebruiken, beperkt de toedieningsfrequentie, vermindert de behandeling van dieren, minimaliseert stress en verbetert de veiligheid55. Tot nu toe hebben slechts een paar studies bij gehumaniseerde muizen 24,37,41 voedselpellets met gemalen ART-medicijnen gebruikt om muizen te behandelen. Deze methode is echter een uitdaging om op grote schaal toe te passen vanwege de beperkte toegang tot de productie van speciale voedselpellets. Andere studies 42,43,44,45,46 hebben drinkwater gebruikt als een cART-afgiftesysteem. Het samenstellen van een medicijn in drinkwater kan echter de stabiliteit, zuiverheid of zelfs potentie van de actieve ingrediënten veranderen. Bovendien zijn veel antiretrovirale geneesmiddelen, waaronder TDF, RAL en ELV, slecht oplosbaar in water. Studies hebben aangetoond dat de orale biologische beschikbaarheid van TDF met 40% was toegenomen na een vetrijke maaltijd56, wat suggereert dat competitieve remming van lipasen door voedsel een zekere bescherming voor TDF57 kan bieden. DietGel Boost is een voedingssupplement dat hydratatie-, voedings- en verrijkingsproducten biedt die het algehele welzijn van proefdieren verbeteren58. De met voedingsstoffen verrijkte gel bestaat uit 25% -30% zuiver water met toegevoegde koolhydraten, eiwitten, vetten, mineralen en elektrolyten en is gecertificeerd vrij van fyto-oestrogenen en nitrosaminen58. Het biedt een economisch, effectief en arbeidsefficiënt alternatief voor pureediëten58. Aangezien 20,3% van het totale vet in de Boost-beker is opgenomen, stellen we voor dat hoge voedingsniveaus de TDF beter kunnen oplossen en dus de orale biologische beschikbaarheid kunnen verhogen. Daarom werd een voedselsuspensie met een hoge voedingswaarde gebruikt om de cART-geneesmiddelen af te leveren om de perorale toediening van cART-geneesmiddelen na te bootsen die HIV-1-geïnfecteerde personen momenteel gebruiken.

Muizen hebben een hoger metabolisme dan mensen, en dus werd de dosis van de verschillende verbindingen omgezet en gebruikt door een formule zoals beschreven in referentie59. Humane doses van 0,4 mg (totale dosis) RAL, 0,1 mg (totale dosis) FTC en 2,14 mg (totale dosis) TDF werden omgezet op basis van correctiefactor (Km, geschat door het gemiddelde lichaamsgewicht (kg) van de soort te delen door het lichaamsoppervlak (m2)) om de equivalente dosiswaarden van de muis van 37 (Km) en 3 (Km) voor mensen en muizen59 te schatten, respectievelijk. Gezien de relatief lage oplosbaarheid van TDF, RAL en ELV in water, werd DMSO hier gebruikt als oplosmiddel voor cART-geneesmiddelen. De uiteindelijke concentratie DMSO in het orale cART-voedsel is 0,0059% (v/v). De DMSO-concentratie is zeer laag en relatief veilig als geneesmiddeloplosmiddel 60,61,62,63. Belangrijk is dat er in deze studies geen bontverlies of gedragsveranderingen bij muizen werden waargenomen.

De hierboven beschreven procedure is een zeer robuuste en herhaalbare cART-toedieningsmethode voor de behandeling van HIV-1 geïnfecteerde gehumaniseerde muizen. Dit protocol is eenvoudig te volgen. De kritieke stappen in het protocol zijn 1) om het hele proces van elk materiaal dat betrokken is bij het protocol met betrekking tot het DietGel-voedsel steriel te houden, rekening houdend met immunodeficiëntie van de gehumaniseerde muizen, en 2) om meerdere dooi / vries cART-stamoplossingen te voorkomen, en aliquot cART-geneesmiddelen op de juiste manier volgens muisnummers en groepen. De gegevens suggereren dat orale toediening van cART met drie geneesmiddelen (TDF, FTC en RAL of ELV) voorgemengd in de voedselbeker efficiënt hiv-1-replicatie onderdrukt en de virale lading in plasma vermindert tot niet-detecteerbare niveaus binnen 4 weken na de behandeling. Orale toediening van cART-voedsel voorkwam niet alleen een verdere afname van CD4 T-cellen, maar resulteerde ook in een verhoogd CD4 T-celpercentage in het perifere bloed. Bovendien herstelde de orale cART-toedieningsmethode het gewicht van de muis sneller dan de dagelijkse injectie en verbeterde de algehele gezondheid.

Belangrijk is dat deze methode het risico van blootstelling van de onderzoeker aan scherpe voorwerpen tijdens de dagelijkse injectie van cART-geneesmiddelen in hiv-1-geïnfecteerde gehumaniseerde muizen heeft verwijderd. De voorgestelde methode die met succes HIV-1 RNA-replicatie in gehumaniseerde muizen onderdrukt, zal zeer waardevol zijn voor preklinische proof-of-concept-studies voor het ontwikkelen van nieuwe genezingsbehandelingen die de medicijnafgifte bij met cART behandelde chronische HIV-1-geïnfecteerde personen nauw nabootsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SK is een van de oprichters van CDR3 Inc. De overige auteurs verklaren dat het onderzoek is uitgevoerd bij afwezigheid van commerciële of financiële relaties die kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Acknowledgments

We willen Drs. Romas Geleziunas en Jeff Murry en de mensen van Gilead bedanken voor het verstrekken van de antiretrovirale geneesmiddelen die in deze studie worden gebruikt. Dit werk werd gefinancierd door NCI 1R01CA239261-01 (to Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (de UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core en Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PI's: Kitchen &Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (naar Zhen), NIAID R2120200174 (PI's: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Dit werk werd ook ondersteund door het UCLA AIDS Institute, de James B. Pendleton Charitable Trust en de McCarthy Family Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm petri dish Thermo Scientific Nunc 150288 For aliquoting ART food
APC anti-human CD8 Antibody Biolegend 344722 For flow cytometry
BD LSRFortessa BD biosciences For flow data collection
CD34 microbeads Miltenyi Biotec 130-046-702 For NSG-BLT mice generation
Centrifuge tubes Falcon 14-432-22 For dissolving ART
DietGel Boost ClearH2O 72-04-5022 For making ART food
Elvitegravir Gilead Gifted from Gilead
Emtricitabine Gilead Gifted from Gilead
FITC anti-human CD3 Antibody Biolegend 317306 For flow cytometry
Flowjo software FlowJo For flow cytometry data analysis
HIV-1 forward primer: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 probe: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′;		 IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 reverse primer: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
Human fetal tissue Advanced Bioscience Resources, Inc
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Pacific Blue anti-human CD45 Biolegend 304022 For flow cytometry
PerCP anti-human CD4 Antibody Biolegend 300528 For flow cytometry
QIAamp Viral RNA Kits Qiagen  52904 For measuring viral load
Raltegravir Merck Gifted from Merck
Sterile cell scrapers Thermo Scientific 179693 For aliquoting ART food
TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit Applied Biosystems 4392653 For plasma viral load detection
Tenofovir disoproxil fumarate Gilead Gifted from Gilead
Trimethoprim-Sulfamethoxazole Pharmaceutical Associates NDC 0121-0854-16 For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains
200 mg Sulfamethoxazole, USP
40 mg Trimethoprim, USP
NMT 0.5% Alcohol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Antiretroviral Therapy Cohort Collaboration. Life expectancy of individuals on combination antiretroviral therapy in high-income countries: a collaborative analysis of 14 cohort studies. Lancet. 372 (9635), 293-299 (2008).
  2. May, M. T., et al. Impact on life expectancy of HIV-1 positive individuals of CD4+ cell count and viral load response to antiretroviral therapy. AIDS. 28 (8), 1193-1202 (2014).
  3. Autran, B., et al. Positive effects of combined antiretroviral therapy on CD4+ T cell homeostasis and function in advanced HIV disease. Science. 277 (5322), 112-116 (1997).
  4. Palella, F. J., et al. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV outpatient study investigators. The New England Journal of Medicine. 338 (13), 853-860 (1998).
  5. Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
  6. Ananworanich, J., Dube, K., Chomont, N. How does the timing of antiretroviral therapy initiation in acute infection affect HIV reservoirs. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (1), 18-28 (2015).
  7. Whitney, J. B., et al. Rapid seeding of the viral reservoir prior to SIV viraemia in rhesus monkeys. Nature. 512 (7512), 74-77 (2014).
  8. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4 T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  9. Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature Immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  10. Brothers, T. D., et al. Frailty in people aging with human immunodeficiency virus (HIV) infection. Journal of Infectious Disease. 210 (8), 1170-1179 (2014).
  11. D. A. D. Study Group. Use of nucleoside reverse transcriptase inhibitors and risk of myocardial infarction in HIV-infected patients enrolled in the D:A:D study: a multi-cohort collaboration. Lancet. 371 (9622), 1417-1426 (2008).
  12. Schouten, J., et al. Cross-sectional comparison of the prevalence of age-associated comorbidities and their risk factors between HIV-infected and uninfected individuals: the AGEhIV cohort study. Clinical Infectious Diseases. 59 (12), 1787-1797 (2014).
  13. Policicchio, B. B., Pandrea, I., Apetrei, C. Animal models for HIV cure research. Frontiers in Immunology. 7, 12 (2016).
  14. Hessell, A. J., Haigwood, N. L. Animal models in HIV-1 protection and therapy. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (3), 170-176 (2015).
  15. Ambrose, Z., KewalRamani, V. N., Bieniasz, P. D., Hatziioannou, T. HIV/AIDS: in search of an animal model. Trends in Biotechnology. 25 (8), 333-337 (2007).
  16. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature Medicine. 12 (11), 1316 (2006).
  17. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  18. Wege, A. K., Melkus, M. W., Denton, P. W., Estes, J. D., Garcia, J. V. Functional and phenotypic characterization of the humanized BLT mouse model. Current Topics in Microbiology and Immunology. 324, 149-165 (2008).
  19. Garcia, J. V. In vivo platforms for analysis of HIV persistence and eradication. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 424-431 (2016).
  20. Carrillo, M. A., Zhen, A., Kitchen, S. G. The use of the humanized mouse model in gene therapy and immunotherapy for HIV and cancer. Frontiers in Immunology. 9, 746 (2018).
  21. Abeynaike, S., Paust, S. Humanized mice for the evaluation of novel HIV-1 therapies. Frontiers in Immunology. 12, 636775 (2021).
  22. Marsden, M. D., Zack, J. A. Humanized mouse models for human immunodeficiency virus infection. Annual Review of Virology. 4 (1), 393-412 (2017).
  23. Brainard, D. M., et al. Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
  24. Nischang, M., et al. Humanized mice recapitulate key features of HIV-1 infection: a novel concept using long-acting anti-retroviral drugs for treating HIV-1. PLoS One. 7 (6), 38853 (2012).
  25. Garcia-Beltran, W. F., et al. Innate immune reconstitution in humanized bone marrow-liver-thymus (HuBLT) mice governs adaptive cellular immune function and responses to HIV-1 infection. Frontiers in Immunology. 12, 667393 (2021).
  26. Cheng, L., et al. Blocking type I interferon signaling enhances T cell recovery and reduces HIV-1 reservoirs. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 269-279 (2017).
  27. Zhen, A., et al. Targeting type I interferon-mediated activation restores immune function in chronic HIV infection. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 260-268 (2017).
  28. Khamaikawin, W., et al. Modeling anti-HIV-1 HSPC-based gene therapy in humanized mice previously infected with HIV-1. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 23-32 (2018).
  29. Kitchen, S. G., et al. Engineering antigen-specific T cells from genetically modified human hematopoietic stem cells in immunodeficient mice. PLoS One. 4 (12), 8208 (2009).
  30. Zhen, A., et al. Robust CAR-T memory formation and function via hematopoietic stem cell delivery. PLoS Pathogens. 17 (4), 1009404 (2021).
  31. Zhen, A., et al. HIV-specific immunity derived from chimeric antigen receptor-engineered stem cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
  32. Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2013).
  33. Mu, W., Carrillo, M. A., Kitchen, S. G. Engineering CAR T cells to target the hiv reservoir. Frontiers in Celluar and Infection Microbiology. 10, 410 (2020).
  34. Arts, E. J., Hazuda, D. J. HIV-1 antiretroviral drug therapy. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 2 (4), 007161 (2012).
  35. Denton, P. W., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  36. Kovarova, M., et al. A long-acting formulation of the integrase inhibitor raltegravir protects humanized BLT mice from repeated high-dose vaginal HIV challenges. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (6), 1586-1596 (2016).
  37. Lavender, K. J., et al. An advanced BLT-humanized mouse model for extended HIV-1 cure studies. AIDS. 32 (1), 1-10 (2018).
  38. Denton, P. W., et al. Targeted cytotoxic therapy kills persisting HIV infected cells during ART. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003872 (2014).
  39. Marsden, M. D., et al. In vivo activation of latent HIV with a synthetic bryostatin analog effects both latent cell "kick" and "kill" in strategy for virus eradication. PLoS Pathogens. 13 (9), 1006575 (2017).
  40. Stuart, S. A., Robinson, E. S. Reducing the stress of drug administration: implications for the 3Rs. Science Report. 5, 14288 (2015).
  41. Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
  42. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics reduce systemic and gut inflammation in chronic treated HIV. PLoS Pathogens. 18 (1), 1010160 (2022).
  43. Mu, W., et al. Apolipoprotein A-I mimetics attenuate macrophage activation in chronic treated HIV. AIDS. 35 (4), 543-553 (2021).
  44. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics favorably impact cyclooxygenase 2 and bioactive lipids that may contribute to cardiometabolic syndrome in chronic treated HIV. Metabolism. 124, 154888 (2021).
  45. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational antiretroviral therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
  46. Llewellyn, G. N., et al. Humanized mouse model of HIV-1 latency with enrichment of latent virus in PD-1(+) and TIGIT(+) CD4 T cells. Journal of Virology. 93 (10), 02086 (2019).
  47. Kearney, B. P., Flaherty, J. F., Shah, J. Tenofovir disoproxil fumarate: clinical pharmacology and pharmacokinetics. Clinical Pharmacokinetics. 43 (9), 595-612 (2004).
  48. Speakman, J. R. Use of high-fat diets to study rodent obesity as a model of human obesity. International Journal of Obesity (Lond). 43 (8), 1491-1492 (2019).
  49. Zhen, A., et al. Stem-cell based engineered immunity against HIV infection in the humanized mouse model. Journal of Visualized Experiments. (113), e54048 (2016).
  50. Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A detailed protocol for characterizing the murine C1498 cell line and its associated leukemia mouse model. Journal of Visualized Experiments. (116), e54270 (2016).
  51. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
  52. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  53. Shimizu, S., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  54. Ladinsky, M. S., et al. Mechanisms of virus dissemination in bone marrow of HIV-1-infected humanized BLT mice. Elife. 8, 46916 (2019).
  55. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  56. Lamorde, M., et al. Effect of food on the steady-state pharmacokinetics of tenofovir and emtricitabine plus efavirenz in Ugandan adults. AIDS Research and Treatment. 2012, 105980 (2012).
  57. Watkins, M. E., et al. Development of a novel formulation that improves preclinical bioavailability of tenofovir disoproxil fumarate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 906-919 (2017).
  58. Moccia, K. D., Olsen, C. H., Mitchell, J. M., Landauer, M. R. Evaluation of hydration and nutritional gels as supportive care after total-body irradiation in mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (3), 323-328 (2010).
  59. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  60. Santos, N. C., Figueira-Coelho, J., Martins-Silva, J., Saldanha, C. Multidisciplinary utilization of dimethyl sulfoxide: pharmacological, cellular, and molecular aspects. Biochemical Pharmacology. 65 (7), 1035-1041 (2003).
  61. Kolb, K. H., Jaenicke, G., Kramer, M., Schulze, P. E. Absorption, distribution and elimination of labeled dimethyl sulfoxide in man and animals. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 85-95 (1967).
  62. Yellowlees, P., Greenfield, C., McIntyre, N. Dimethylsulphoxide-incuded toxicity. Lancet. 2 (8202), 1004-1006 (1980).
  63. Swanson, B. N. Medical use of dimethyl sulfoxide (DMSO). Reviews in Clinical & Basic Pharmacology. 5 (1-2), 1-33 (1985).

Tags

Immunologie en infectie nummer 188
Orale gecombineerde antiretrovirale behandeling bij hiv-1 geïnfecteerde gehumaniseerde muizen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A.,… More

Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A., Rezek, V., Martin, H., Lizarraga, M., Kitchen, S. Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice. J. Vis. Exp. (188), e63696, doi:10.3791/63696 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter