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Immunology and Infection

HIV-1感染ヒト化マウスにおける経口併用抗レトロウイルス治療

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/63696
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Hematology and Oncology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

このプロトコルは、ヒト化マウスにおけるHIV-1 RNA複製を首尾よく抑制する経口併用抗レトロウイルス薬を送達するための新しい方法を説明しています。

Abstract

ヒト免疫不全ウイルス(HIV-1)のパンデミックは世界中に衰えることなく広がり続けており、現在、HIVに対するワクチンはありません。併用抗レトロウイルス療法(cART)はウイルス複製の抑制に成功していますが、HIV感染者からリザーバーを完全に根絶することはできません。HIV感染の安全で効果的な治療戦略には多面的な方法が必要であり、したがって、HIV-1感染の動物モデルの進歩は、HIV治療研究の発展にとって極めて重要です。ヒト化マウスは、HIV-1感染の重要な特徴を再現しています。ヒト化マウスモデルはHIV-1に感染することができ、ウイルス複製はcARTレジメンで制御することができる。さらに、cARTの中断は、ヒト化マウスにおいて迅速なウイルスリバウンドをもたらす。しかし、動物へのcARTの投与は効果がないか、困難であるか、または有毒である可能性があり、多くの臨床的に関連するcARTレジメンを最適に利用することはできません。研究者にとって潜在的に安全ではないことに加えて、一般的に使用される集中的な毎日の注射手順によるcARTの投与は、動物の身体的拘束によってストレスを誘発します。この記事に記載されているHIV-1感染ヒト化マウスを治療するための新しい経口cART法は、HIV-1感染ヒト化マウスの検出レベルを下回るウイルス血症の抑制、CD4+回復率の増加、および全体的な健康状態の改善をもたらしました。

Introduction

慢性ヒト免疫不全ウイルス(HIV)感染者の平均余命は、抗レトロウイルス併用療法(cART)によって大幅に改善されました1,2。cARTは、HIV-1慢性感染参加者の大多数において、HIV-1複製を減少させ、CD4+ T細胞数を正常まで増加させることに成功し3、全体的な健康状態を改善し、疾患の進行を劇的に減少させました4。しかし、潜在性HIV-1リザーバーは、急性感染中にARTが開始された場合でも確立されます5,6,7。リザーバーはARTの間何年にもわたって持続し、ART中断後の急速なウイルスリバウンドは十分に文書化されています8,9。ARTでHIVと共に生きる人々はまた、心血管疾患、癌、神経障害などの併存疾患のリスクが高くなる傾向があります10,11,12。したがって、HIVの機能的治療法が必要です。HIV-1感染の動物モデルは、新しいHIV治療戦略の開発と検証において明らかな利点を提供します13,14,15。ヒト化マウスは、小動物モデルとして、異なる組織における多系列ヒト免疫細胞の再構成を提供することができ、これはHIV感染の綿密な研究を可能にする16、17、18、19。ヒト化モデルの中で、ヒト化骨髄-肝臓-胸腺(BLT)モデルは、慢性HIV-1感染とHIV-1感染に対する機能的なヒト免疫応答を首尾よく再現します20、21、22、23、24。したがって、ヒト化BLTマウスモデルは、HIV研究分野における様々な側面を調査するために広く使用されている。ヒト化BLTマウスは、持続的なHIV-1感染と病因の再現のための確立されたモデルであるだけでなく、細胞療法に基づく介入戦略を評価するための重要なツールでもあります。現在の著者らは、ヒト化BLTマウスモデルが持続的なHIV-1感染と病因を要約し25,26,27、細胞療法に基づく介入戦略を評価するためのツールを提供することを実証しました28,29,30,31,32,33。

毎日服用される抗レトロウイルス薬の組み合わせからなるcARTレジメンは、HIV-1複製を抑制し、治療に成功した個人のウイルス量は長期間にわたって検出できないままである34。HIV感染ヒト化マウスを臨床的に関連するcARTレジメンで治療した結果は、HIV-1感染ART治療個体で観察されたものに類似している22:HIV-1レベルは検出限界以下に抑制され、cARTの中断は潜在リザーバー35からのHIV複製のリバウンドをもたらす。皮下(SC)27,36,37または腹腔内(IP)37,38,39注射は、ヒト化マウスのcART治療に一般的に使用される経路です。しかし、集中的な毎日の注射は、身体的拘束40によって動物にストレスを誘発する。また、鋭利物を使用している間、HIVへの曝露が増えるため、労働集約的であり、研究者にとって潜在的に安全ではありません。経口投与は、HIV-1感染者が服用するcART薬の吸収、分布、排泄を模倣するのに理想的です。経口投与は、典型的には、抗レトロウイルス薬を滅菌された(マウスの免疫不全のために必要)食物24、37、41または水42、43、44、45、46に入れるためのカスタマイズされた、しばしば面倒な手順を伴う。これは、多くの抗レトロウイルス薬と化学的に適合する場合とそうでない場合があり、マウスが容易に食べたり飲んだりしないものをもたらします(体内の用量と薬物レベルに影響します)。ここで提案する新規経口cART投与法は、さまざまな種類の抗レトロウイルス薬との適合性、安全性と調製と投与の容易さ、および毎日の注射に起因する動物のストレスと不安の軽減により、以前の送達の試みを上回っています。

テノホビルジソプロキシルフマル酸塩(TDF)、エルビテグラビル(ELV)、およびラルテグラビル(RAL)は難水溶性薬です。興味深いことに、脂肪分の多い食品ではTDFのバイオアベイラビリティの増加が観察され、脂肪分の多い食品によるリパーゼの競合的阻害がTDF47に一定の保護を提供する可能性があることを示唆しています。したがって、DietGel Boostカップは、通常のげっ歯類の飼料(100 gあたり10 g)および典型的なマウスの高脂肪食(100 gあたり40〜60 g)と比較して、適度な脂肪含有量(100 gあたり20.3 g)に基づいて、通常のげっ歯類の飼料の代わりに選択されました48。1カップの総重量は75gです。したがって、各カップには、3日間で5匹のマウスに十分な量の食物、したがって薬物が含まれます。

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Protocol

匿名化されたヒト胎児組織は商業的に取得された。動物研究は、カリフォルニア大学ロサンゼルス校および(UCLA)動物研究委員会(ARC)によって承認されたプロトコルに従って、すべての連邦、州、および地方のガイドラインに従って実施されました。具体的には、すべての実験は、国立衛生研究所(NIH)およびUCLA ARCプロトコル番号2010-038-02Bに基づく実験動物管理の評価および認定協会(AALAC)の実験動物の飼育および世話に関する推奨事項およびガイドラインに従って実施された。すべての手術はケタミン(100 mg / kg)/キシラジン(5 mg / kg)およびイソフルラン麻酔(2〜3 vol%)で行われ、動物の痛みと不快感を最小限に抑えるためにあらゆる努力が払われました。

1. HIV-1に感染したヒト化マウス

注:ヒト化マウスは、30、31、49で前述したように構築した。プロトコルについて以下に簡単に説明します。

  1. メーカーのプロトコルに従って、抗CD34マイクロビーズ を介して ヒト胎児肝臓からCD34+造血前駆細胞を精製します。
  2. 手術前に6〜8週齢のNOD / SCID / IL2Rγ−/−(NSG)の雄および雌マウスを麻酔し、致死下(2.7Gy)を照射します。
  3. 胎児の肝臓と同じドナーに由来する胸腺を、肝臓と一緒に腎臓嚢の下に移植します。
  4. 移植後、マウスに50万〜100万個のCD34+細胞を静脈内注射します。
  5. 8〜10週間後、後眼窩ブリード50を介して100 μLのマウス血液を5 μLのEDTAを含むマイクロ遠心チューブに収集し、350 x gで3分間遠心分離します。
  6. 血漿を-80°Cで保存して、マウスがHIV-1に感染した後のウイルス量をモニターします。2 mLの83%NH4C溶液を加え、室温で5分間インキュベートして赤血球を溶解します。
  7. 10%ウシ胎児血清(FBS)を含む10mLのRPMIを加えて、溶解を停止します。300 x g で5分間回転します。
  8. 上清を吸引する。抗体パネル( 材料表を参照)で細胞を染色し、フローサイトメトリーで分析してヒト免疫細胞の生着を確認します。
  9. インスリン注射器を用いたHIV-1株のp24(すなわち、NFNSXSL9 30,53,54)の少なくとも200ngを有する眼窩後静脈注射51,52により、循環CD45+細胞の50%以上を示すマウスに感染させる。フローサイトメトリー分析とウイルス量の測定のために隔週で血液を収集します。

2.ART薬の調製

  1. 個々の薬物の重量を量る。たとえば、cARTで10個のフードカップを作るには、滅菌セルスクレーパーを使用して、250 mgのFTC(エムトリシタビン)、375 mgのTDF、および500 mgのRALまたはELVをバイオセーフティキャビネット内の個々の滅菌15 mL遠心チューブに計量します。
  2. 250 mg FTCチューブ(最終濃度250 mg/mL)にDMSO1 mLを加え、375 mg TDFチューブ(最終濃度250 mg/mL)にDMSO1.5 mLを加え、500 mg RALまたはELVチューブ(最終濃度500 mg/mL)に1 mLのDMSOを加えます。完全に溶解して透明な溶液が得られるまで、薬物混合物を攪拌またはピペットで攪拌する。
  3. 孔径0.22 μMの親水性PVDFメンブレンフィルターを使用して、滅菌シリンジで溶液を滅菌します。個々の薬物溶液は、-20°Cで12週間保存できます。
  4. 使用する準備ができたら、溶液が透明になるまで37°Cで各薬液のアリコート1個を新たに解凍します。ピペットを使ってよく混ぜます。
  5. 薬物を混ぜ合わせ、よく混ぜてマスターミックスを作ります:DMSO中のFTC1 mL、DMSO中のTDFの1.5 mL、およびDMSO中のELVまたはRALの1 mL。
    注:この量は10個のフードカップになります。
  6. 350 μLのcARTマスターミックス溶液を1つのカップに加えて、1つのディートゲルブーストcARTカップを作成します。
  7. 0.75 mLのトリメトプリム-スルファメトキサゾール(0.48 mg / mLの最終濃度)をカップに追加します。.
  8. 1 mLの滅菌ピペットチップを使用して十分に攪拌します。
  9. 必要に応じて、元のカップからマイクロスパチュラでcARTを含むフードカップを60mmのペトリ皿に分注します。体重計で餌を秤量し、マウスの数に応じてケージごとにcARTを含む餌カップの量を算出する。

3. HIV-1感染マウスへのART薬の投与

  1. ケージから通常のチャウチャウを取り出し、cARTを含むフードカップと交換します。
    注:平均して、マウスは1日あたり最大5 gの食物を食べます。約1つのフードカップを5匹のマウスに2日間投与することができる。
  2. 週に3回cART食品を更新します。
  3. 使用済みのカップの重量を量って摂取量を監視します。毎週マウスの体重を測定して、消費量を確認します。

4. リアルタイムPCRによるウイルス量のモニタリング

  1. ヒト免疫細胞(CD4およびCD8 T細胞レベル)および眼窩後出血によるBLTマウスのHIV-1複製を2週間ごとに評価します。ステップ1.5〜1.8の指示に従って血漿を採取します。
  2. 経口cART投与前および経口投与中にHIV-1に感染したマウスの血漿ウイルス量を8週間監視します。ウイルスRNA抽出キットを用いて血漿から血漿ウイルスRNAを抽出し、前述のようにプライマーおよびプローブ(材料の表を参照)を用いたリアルタイムPCRによって定量する27、30、31。次のサイクリングプロトコルを使用します:48°C(15分)、95°C(10分)、次に95°C(15秒)、60°C(1分)で45サイクル。

5. フローサイトメトリーによるCD4/CD8比の評価

  1. ステップ1.5〜1.8に従って、隔週出血の末梢血から単一細胞懸濁液を調製する。
  2. 表面マーカーで細胞を染色し、フローサイトメトリーで分析します。以下の表面マーカー抗体27,30,43,49をフローサイトメトリーで使用する:CD45(クローンHI30)、CD8(クローンSK1)、CD3(クローンOKT3)、CD4(クローンRPA-T4)27、30、42、49。

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Representative Results

体重25gの平均的なマウスが1日あたり4gの食物を消費すると仮定すると、経口摂取による1日の薬物投与量は、2.88mg / kg TFV、83mg / kg FTC、および768mg / kgRALに相当します。最適化された食物レジメンが毒性であり、cARTの毎日の注射と比較して全体的な健康に影響を与えるかどうかをテストするために、マウスの体重を経口または皮下注射によるcARTの前と最中に毎週監視しました。各群において、cART投与前に有意な体重差はなかった(図1)。しかし、マウスの体重は、毎日のcART SC注射中に継続的に減少しました。対照的に、DietGelのFTC/TDF/ELVまたはFTC/TDF/RALは、経口cART投与の5週間後にマウスの体重をART開始前のレベルに回復させた。さらに、ラルテグラビル群またはエルビテグラビル群の間で有意な体重変化は観察されなかった。

経口cART投与が毎日の注射と同じくらい効果的にウイルス量を抑制するかどうかをテストするために、隔週の血漿ウイルス量をRT-PCRを使用して評価しました。 図2 は、FTC / TDF / ELV ART食品レジメンが4週間以内にウイルス複製を検出できないレベルまで100%効率的に抑制したことを示しています。FTC / TDF / RAL ARTの食物レジメンは、マウスの80%を4週間以内に検出不能レベルに抑制することができるが、SC注射を受けたマウスの70%のみが4週間の治療後に検出不能レベルに達した。その結果、経口投与はSC注射よりも迅速かつ効率的にウイルス複製を抑制することが実証されました。さらに、cARTの食事療法は、SCの毎日の注射よりも早く末梢血中のCD4/CD8比のさらなる低下を防ぎました(図3)。これらの結果は、提案された経口cARTレジメンが、HIV-1感染ヒト化マウスにおいて、血漿ウイルス血症を検出レベル以下に抑制し、CD4 T細胞レベルを迅速に回復し、動物の全体的な健康状態を改善することに成功できることを示唆しました。

Figure 1
図1:異なるグループにおけるHIV-1感染後のcART治療前および治療中のマウス体重の変化。 ヒト化マウスは、免疫再構成後にHIVNFNSXSL9に感染した。HIV-1感染の4週間後、マウスは、皮下(SC)注射によるFTC / TDF / RALレジメンでさらに7.5週間治療されるか、FTC / TDF / RALまたはFTC / TDF / ELVのいずれかの経口投与によって治療されました。マウスの体重は、HIV感染の1週間前から測定した。すべての統計的比較は、マン・ホイットニー検定を用いて実施し、群平均(± S.E.)を報告した。緑色のアスタリスク星は、FTC / TDF / ELV食品経口グループとFTC / TDF / RAL SC注射グループの統計的差を示しています。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001.各グループでn = 6-7。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:食品経口cART投与は、より速いウイルス抑制を示す。図1に記載されるように、マウスは、皮下注射、およびフードカップモック、FTC/TDF/RAL、またはFTC/TDF/ELV食物レジメンの経口投与により、未処置またはFTC/TDF/RALレジメンでさらに7.5週間処置された。(A)異なるグループにおけるHIV-1感染後の経時的な血漿ウイルス量。(B)異なる群におけるHIV-1感染後の経時的なウイルス量の要約、95%信頼区間(CI)を有する群幾何平均を報告する。黒い矢印は、cART処理群のcART開始時間を示す。(C)各グループのcART治療後から検出できないウイルス量までの時間の生存分析。各グループでn = 6-7。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:ART食品経口投与は、CD4/CD8比のより速い回復を示す。 各グループのHIV-1感染後の経時的な末梢血中のCD4 / CD8比。すべての統計的比較は、マン・ホイットニー検定を用いて行い、群平均(± S.E.)を報告した。赤いアスタリスク星は、FTC / TDF / RAL食品経口グループとFTC / TDF / RAL SC注射グループの統計的差を示しています。*P < 0.05各グループでn = 6-7。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Discussion

ここでは、HIV-1に感染したヒト化マウスに対して、高栄養食品中に3つの抗レトロウイルス薬を組み合わせることにより、経口cART投与法を開発しています。毎日の注射による投与と比較して、経口送達は使いやすく、投与頻度を制限し、動物の取り扱いを減らし、ストレスを最小限に抑え、安全性を向上させます55。この時点まで、ヒト化マウス24,37,41における少数の研究のみが、マウスを治療するために粉砕ART薬を含む食品ペレットを使用した。しかしながら、この方法は、特別な食品ペレットを製造するための限られたアクセスのために広く適用するのが難しい。他の研究42,43,44,45,46は、cART送達システムとして飲料水を使用している。ただし、薬を飲料水に配合すると、有効成分の安定性、純度、さらには効力が変化する可能性があります。さらに、TDF、RAL、ELVなどの多くの抗レトロウイルス薬は水溶性が悪いです。研究によると、TDFの経口バイオアベイラビリティは高脂肪食後に40%増加し56、食物によるリパーゼの競合阻害がTDF57に一定の保護を提供する可能性があることを示唆しています。DietGel Boostは、研究動物の全体的な福祉を改善する水分補給、栄養、および濃縮製品を提供する栄養補助食品です58。栄養強化ゲルは、炭水化物、タンパク質、脂肪、ミネラル、電解質を添加した25%〜30%の純水で構成され、植物エストロゲンとニトロソアミンが含まれていないことが認定されています58。それはマッシュダイエット58に代わる経済的、効果的、そして労働効率の高い代替手段を提供します。総脂肪の20.3%がブーストカップに含まれていたため、高栄養素レベルがTDFをよりよく溶解し、経口バイオアベイラビリティを高めることができることを提案します。したがって、HIV-1感染者が現在使用しているcART薬の経口送達を模倣するために、高栄養食品懸濁液がcART薬を送達するために利用されました。

マウスはヒトよりも高い代謝を有し、したがって、別個の化合物の用量は、参考文献59に記載されるような式によって変換および使用された。RALの0.4 mg(総用量)、FTCの0.1 mg(総用量)、およびTDFの2.14 mg(総用量)のヒト用量を補正係数(Km、種の平均体重(kg)をその体表面積(m2)で割って推定)に基づいて変換し、ヒトおよびマウスのマウス等価用量値37(Km)および3(Km)を推定した59。 それぞれ。TDF、RAL、およびELVの水への溶解度が比較的低いことを考慮して、ここではDMSOをcART薬の溶媒として使用しました。経口cART食品に含まれるDMSOの最終濃度は0.0059%(v / v)です。DMSO濃度は非常に低く、薬物溶媒として比較的安全である60、61、62、63。重要なことに、これらの研究では、マウスの毛皮の喪失や行動の変化は観察されませんでした。

上記の手順は、HIV-1感染ヒト化マウスを治療するための非常に堅牢で再現性の高いcART送達方法である。このプロトコルは簡単に従うことができます。プロトコルの重要なステップは、1)ヒト化マウスの免疫不全を考慮したDietGel食品に関連するプロトコルに関与するすべての材料の全プロセスを無菌状態に保つこと、および2)複数の解凍/凍結cARTストック溶液を回避し、マウスの数とグループに応じて適切にcART薬をアリコートすることです。データは、フードカップ内で事前に混合された3剤cART(TDF、FTC、およびRALまたはELV)の経口投与が、HIV-1複製を効率的に抑制し、治療後4週間以内に血漿中のウイルス量を検出できないレベルまで減少させることを示唆しています。経口cART食品投与は、CD4 T細胞のさらなる減少を防ぐだけでなく、末梢血中のCD4 T細胞の割合の増加ももたらしました。さらに、経口cART投与法は、毎日の注射よりも早くマウスの体重を回復させ、全体的な健康状態を改善しました。

重要なことに、この方法は、HIV-1に感染したヒト化マウスへのcART薬の毎日の注射中に研究者が鋭利物にさらされるリスクを排除しました。ヒト化マウスにおけるHIV-1 RNA複製の抑制に成功した提案手法は、cART治療を受けた慢性HIV-1感染者における薬物送達を厳密に模倣した新しい治療法を開発するための前臨床概念実証研究にとって非常に価値があります。

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Disclosures

SKはCDR3株式会社の創設者です。残りの著者は、潜在的な利益相反として解釈される可能性のある商業的または金銭的関係がない状態で研究が実施されたと宣言しています。

Acknowledgments

この研究で使用された抗レトロウイルス薬を提供してくれたRomas Geleziunas博士とJeff Murry博士、およびギリアドの人々に感謝します。この研究は、NCI 1R01CA239261-01 (to Kitchen)、NIH Grants P30AI28697 (the UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core, and Humanized Mouse Core)、U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen)、CIRM DISC2-10748、NIDA R01DA-52841 (to Zhen)、NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen)、IRACDA K12 GM106996 (Carrillo)によって資金提供された。この作業は、UCLAエイズ研究所、ジェームズB.ペンドルトン慈善信託、およびマッカーシー家族財団によっても支援されました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm petri dish Thermo Scientific Nunc 150288 For aliquoting ART food
APC anti-human CD8 Antibody Biolegend 344722 For flow cytometry
BD LSRFortessa BD biosciences For flow data collection
CD34 microbeads Miltenyi Biotec 130-046-702 For NSG-BLT mice generation
Centrifuge tubes Falcon 14-432-22 For dissolving ART
DietGel Boost ClearH2O 72-04-5022 For making ART food
Elvitegravir Gilead Gifted from Gilead
Emtricitabine Gilead Gifted from Gilead
FITC anti-human CD3 Antibody Biolegend 317306 For flow cytometry
Flowjo software FlowJo For flow cytometry data analysis
HIV-1 forward primer: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 probe: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′;		 IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 reverse primer: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
Human fetal tissue Advanced Bioscience Resources, Inc
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Pacific Blue anti-human CD45 Biolegend 304022 For flow cytometry
PerCP anti-human CD4 Antibody Biolegend 300528 For flow cytometry
QIAamp Viral RNA Kits Qiagen  52904 For measuring viral load
Raltegravir Merck Gifted from Merck
Sterile cell scrapers Thermo Scientific 179693 For aliquoting ART food
TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit Applied Biosystems 4392653 For plasma viral load detection
Tenofovir disoproxil fumarate Gilead Gifted from Gilead
Trimethoprim-Sulfamethoxazole Pharmaceutical Associates NDC 0121-0854-16 For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains
200 mg Sulfamethoxazole, USP
40 mg Trimethoprim, USP
NMT 0.5% Alcohol

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免疫学と感染、第188号、
HIV-1感染ヒト化マウスにおける経口併用抗レトロウイルス治療
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Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A., Rezek, V., Martin, H., Lizarraga, M., Kitchen, S. Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice. J. Vis. Exp. (188), e63696, doi:10.3791/63696 (2022).

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