Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

HIV-1 Enfekte İnsanlaştırılmış Farelerde Oral Kombinasyonel Antiretroviral Tedavi

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/63696
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Hematology and Oncology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

Bu protokol, insanlaştırılmış farelerde HIV-1 RNA replikasyonunu başarılı bir şekilde baskılayan oral kombinasyonel antiretroviral ilaçlar vermek için yeni bir yöntemi açıklamaktadır.

Abstract

İnsan immün yetmezlik virüsü (HIV-1) pandemisi dünya çapında hız kesmeden yayılmaya devam etmektedir ve şu anda HIV'e karşı bir aşı bulunmamaktadır. Kombinasyonel antiretroviral tedavi (cART) viral replikasyonu baskılamada başarılı olmasına rağmen, rezervuarı HIV ile enfekte bireylerden tamamen yok edemez. HIV enfeksiyonu için güvenli ve etkili bir tedavi stratejisi çok yönlü yöntemler gerektirecektir ve bu nedenle HIV-1 enfeksiyonu için hayvan modellerinin ilerlemesi HIV tedavi araştırmalarının geliştirilmesi için çok önemlidir. İnsanlaştırılmış fareler, HIV-1 enfeksiyonunun temel özelliklerini özetler. İnsanlaştırılmış fare modeli HIV-1 ile enfekte olabilir ve viral replikasyon cART rejimleri ile kontrol edilebilir. Dahası, cART kesintisi, insanlaştırılmış farelerde hızlı bir viral geri tepme ile sonuçlanır. Bununla birlikte, cART'nin hayvana uygulanması etkisiz, zor veya toksik olabilir ve klinik olarak ilgili birçok cART rejimi en uygun şekilde kullanılamaz. Araştırmacılar için potansiyel olarak güvensiz olmasının yanı sıra, cART'nin yaygın olarak kullanılan yoğun bir günlük enjeksiyon prosedürü ile uygulanması, hayvanın fiziksel olarak kısıtlanmasıyla strese neden olur. Bu makalede açıklanan HIV-1 ile enfekte olmuş insanlaştırılmış fareleri tedavi etmek için yeni oral cART yöntemi, vireminin tespit seviyesinin altında baskılanmasına, CD4 + restorasyon oranının artmasına ve HIV-1 ile enfekte olmuş insanlaştırılmış farelerde genel sağlığın iyileşmesine neden olmuştur.

Introduction

Kronik insan immün yetmezlik virüsü (HIV) ile enfekte bireylerin yaşam beklentisi, kombinasyonel antiretroviral tedavi (cART) ile anlamlı derecede iyileşmiştir1,2. cART, HIV-1 replikasyonunu başarılı bir şekilde azaltır ve kronik olarak enfekte olmuş katılımcıların çoğunda CD4 + T hücre sayısını normale yükseltir3, bu da genel sağlığın iyileşmesine ve hastalığın ilerlemesini önemli ölçüde azaltmasına neden olur4. Bununla birlikte, gizli HIV-1 rezervuarı, akut enfeksiyon sırasında ART başlatıldığında bile kurulur 5,6,7. Rezervuarlar YÜT sırasında yıllar içinde devam eder ve YÜT kesintisinden sonra hızlı viral geri tepme iyi belgelenmiştir 8,9. ART üzerinde HIV ile yaşayan insanlar ayrıca kardiyovasküler hastalık, kanser ve nöro bozukluklar gibi daha yüksek komorbidite riskine yatkındır10,11,12. Bu nedenle, HIV için fonksiyonel bir tedaviye ihtiyaç vardır. HIV-1 enfeksiyonu için hayvan modelleri, yeni HIV tedavi stratejilerinin geliştirilmesinde ve doğrulanmasında belirgin avantajlar sunmaktadır13,14,15. İnsanlaştırılmış fareler, küçük bir hayvan modeli olarak, farklı dokularda çok soylu insan bağışıklık hücresi resutansiyonu sağlayabilir, bu da HIV enfeksiyonunun yakından incelenmesine izin verir16,17,18,19. İnsanlaştırılmış modeller arasında, insanlaştırılmış kemik iliği-karaciğer-timus (BLT) modeli, kronik HIV-1 enfeksiyonunun yanı sıra HIV-1 enfeksiyonuna karşı fonksiyonel insan bağışıklık tepkilerini başarıyla özetler20,21,22,23,24. Bu nedenle, insanlaştırılmış BLT fare modeli, HIV araştırma alanındaki çeşitli yönleri araştırmak için yaygın olarak kullanılmaktadır. İnsanlaştırılmış BLT fareleri sadece kalıcı HIV-1 enfeksiyonu ve patogenezinin özetlenmesi için iyi kurulmuş modeller değil, aynı zamanda hücre tedavisine dayalı müdahale stratejilerinin değerlendirilmesi için sonuç niteliğinde araçlardır. Mevcut yazarlar ve diğerleri, insanlaştırılmış BLT fareleri modelinin kalıcı HIV-1 enfeksiyonu ve patogenezi25,26,27'yi özetlediğini ve hücre tedavisine dayalı müdahale stratejilerini değerlendirmek için araçlar sağladığını göstermiştir 28,29,30,31,32,33.

Günlük olarak alınan antiretroviral ilaçların kombinasyonlarından oluşan cART rejimleri, başarılı bir şekilde tedavi edilen bireylerde viral yükün uzun süre34 boyunca tespit edilemediği noktaya kadar HIV-1 replikasyonunu baskılar. HIV ile enfekte olmuş insanlaştırılmış farelerin klinik olarak ilgili cART rejimleriyle tedavi edilmesinin sonuçları, HIV-1 ile enfekte olmuş ART ile tedavi edilen bireylerde gözlenenlere benzemektedir22: HIV-1 seviyeleri, cART'nin tespit ve kesinti sınırlarının altında bastırılır ve bu da HIV replikasyonunun gizli rezervuardan geri tepmesine neden olur35. Subkutan (SC)27,36,37 veya intraperitoneal (IP)37,38,39 enjeksiyonu, insanlaştırılmış farelerde cART tedavisinde yaygın olarak kullanılan yoldur. Bununla birlikte, yoğun günlük enjeksiyon, fiziksel kısıtlama40 ile hayvanlara strese neden olur. Ayrıca, keskin nişan kullanırken HIV'e daha fazla maruz kalma nedeniyle araştırmacılar için emek yoğun ve potansiyel olarak güvensizdir. Oral uygulama, HIV-1 ile enfekte olmuş bireyler tarafından alınan cART ilaçlarının emilimini, dağılımını ve atılımını taklit etmek için idealdir. Oral uygulama tipik olarak, antiretroviral ilaçları sterilize edilmiş (farelerin immün yetmezliği nedeniyle gerekli) gıda 24,37,41 veya su42,43,44,45,46 içine koymak için özelleştirilmiş ve sıklıkla zahmetli prosedürleri içerir. Birçok antiretroviral ilaçla kimyasal olarak uyumlu olabilir veya olmayabilir veya farelerin kolayca yiyemeyeceği veya içmeyeceği bir şeyle sonuçlanabilir (bu da vücuttaki doz ve ilaç seviyelerini etkiler). Burada önerilen yeni peroral cART uygulama yöntemi, farklı antiretroviral ilaç türleriyle uyumluluğu, güvenliği ve hazırlık ve uygulama kolaylığı ve günlük enjeksiyondan kaynaklanan hayvan stresi ve kaygısının azaltılması nedeniyle önceki doğum girişimlerini aşmaktadır.

Tenofovir disoproksil fumarat (TDF), Elvitegravir (ELV) ve Raltegravir (RAL) zayıf suda çözünür ilaçlardır. İlginç bir şekilde, TDF'nin biyoyararlanımının artması yağlı gıdalarla gözlenir, bu da lipazların yağlı gıdalarla rekabetçi inhibisyonunun TDF47 için belirli bir koruma sağlayabileceğini düşündürmektedir. Bu nedenle, DietGel Boost bardakları, normal kemirgen chow'una (100 g başına 10 g) ve tipik bir fare yüksek yağlı diyetine (100 g başına 40-60 g) kıyasla, mütevazı yağ içeriğine (100 g başına 20.3 g) dayanarak teslimat yöntemi olarak normal kemirgen chow'unun yerini almak üzere seçilmiştir. Bir bardağın toplam ağırlığı 75 g'dır; Böylece, her fincan 3 gün boyunca beş fare için yeterli miktarda yiyecek ve dolayısıyla ilaç içerecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Anonimleştirilmiş insan fetal dokusu ticari olarak edinildi. Hayvan araştırmaları, Kaliforniya Üniversitesi, Los Angeles ve (UCLA) Hayvan Araştırma Komitesi (ARC) tarafından onaylanan protokollere göre, tüm federal, eyalet ve yerel yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Özellikle, tüm deneyler, UCLA ARC Protokol Numarası 2010-038-02B kapsamında Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) ve Uluslararası Laboratuvar Hayvanları Bakımının Değerlendirilmesi ve Akreditasyonu Derneği (AALAC) laboratuvar hayvanlarının barınması ve bakımı için önerilere ve kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Tüm ameliyatlar ketamin (100 mg/kg)/ksilazin (5 mg/kg) ve izofluran anestezisi (%2-3 vol) altında yapılmış ve hayvan ağrı ve rahatsızlığını en aza indirmek için tüm çabalar gösterilmiştir.

1. HIV-1 ile enfekte olmuş insanlaştırılmış fareler

NOT: İnsanlaştırılmış fareler daha önce 30,31,49'da açıklandığı gibi inşa edilmiştir. Protokol aşağıda kısaca açıklanmıştır.

  1. CD34 + hematopoetik progenitör hücrelerini, üreticinin protokolüne göre anti-CD34 mikroboncukları aracılığıyla insan fetal karaciğerinden arındırın.
  2. 6-8 haftalık NOD/SCID/IL2Rγ−/− (NSG) erkek ve dişi fareleri anestezi altına alın ve ameliyattan önce alt lökal olarak ışınlayın (2.7 Gy).
  3. İmplant timus, fetal karaciğer ile aynı donörden türetilen, karaciğer ile birlikte böbrek kapsülünün altında.
  4. İmplantasyonu takiben, farelere intravenöz olarak 0.5 milyon ila bir milyon CD34 + hücresi enjekte edin.
  5. 8-10 hafta sonra, retro-orbital kanama yoluyla 100 μL fare kanınıtoplayın 50, 5 μL EDTA içeren mikrosantrifüj tüplerine ve 3 dakika boyunca 350 x g'de santrifüj yapın.
  6. Fareye HIV-1 bulaştıktan sonra viral yükü izlemek için plazmayı -80 ° C'de saklayın. 2 mL% 83 NH4C çözeltisi ekleyin ve kırmızı kan hücrelerini lize etmek için oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  7. Lizizi durdurmak için% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS) ile 10 mL RPMI ekleyin. 5 dakika boyunca 300 x g'de döndürün.
  8. Süper natantı aspire edin. Antikor panelli leke hücreleri (bakınız Malzeme Tablosu) ve insan bağışıklık hücresi engraftmanını kontrol etmek için akış sitometrisi ile analiz edin.
  9. Bir insülin şırıngası kullanarak birHIV-1 suşunun (yani, NFNSXSL9 30,53,54) en az 200 ng p24'ü ile retro-orbital ven enjeksiyonu 51,52 ile dolaşımdaki CD45 + hücrelerinin%50'sinden fazlasını sergileyen fareleri enfekte edin. Akış sitometri analizi ve viral yükü ölçmek için iki haftada bir kan toplayın.

2. ART ilaçlarının hazırlanması

  1. Bireysel ilaçları tartın; Örneğin, cART ile 10 gıda bardağı yapmak için, bir biyogüvenlik kabinindeki bireysel steril 15 mL santrifüj tüplerine 250 mg FTC (Emtricitabin), 375 mg TDF ve 500 mg RAL veya ELV'yi tartmak için steril hücre kazıyıcıları kullanın.
  2. 250 mg FTC tüpüne 1 mL DMSO ekleyin (250 mg / mL'lik son konsantrasyon), 375 mg TDF tüpüne 1.5 mL DMSO ekleyin (250 mg / mL'lik son konsantrasyon) ve 500 mg RAL veya ELV tüpüne 1mL DMSO ekleyin (500 mg / mL'lik son konsantrasyon). İlaç karışımını tamamen çözünene ve berrak bir çözelti elde edilene kadar karıştırın veya pipetleyin.
  3. Steril bir şırınga ile çözeltileri sterilize etmek için 0,22 μM gözenek boyutunda hidrofilik PVDF membran filtre kullanın. Bireysel ilaç çözeltileri 12 hafta boyunca -20 ° C'de saklanabilir.
  4. Kullanıma hazır olduğunda, çözelti netleşene kadar her ilaç çözeltisinin bir alikotunu 37 ° C'de taze olarak çözün. Bir pipet kullanarak iyice karıştırın.
  5. Ana karışımı oluşturmak için ilaçları birleştirin ve iyice karıştırın: DMSO'da 1 mL FTC, DMSO'da 1,5 mL TDF ve DMSO'da 1 mL ELV veya RAL.
    NOT: Bu miktar 10 yemek bardağı yapacaktır.
  6. Bir DietGel Boost cART fincanı yapmak için bir kaba 350 μL cART master mix solüsyonu ekleyin.
  7. Bardağa 0.75 mL Trimetoprim-Sülfametoksazol (0.48 mg / mL nihai konsantrasyon) ekleyin.
  8. 1 mL steril pipet uçlarını kullanarak iyice karıştırın.
  9. Aliquot orijinal bardaktan cART içeren gıda kabını, gerektiğinde 60 mm'lik bir Petri kabına mikro spatula ile alın. Fare sayısına göre her kafes için cART içeren yiyecek kabı miktarını hesaplamak için yiyeceği bir ölçekte tartın.

3. ART ilaçlarının HIV-1 ile enfekte farelere uygulanması

  1. Kafesten düzenli chow'u çıkarın ve cART içeren bir yiyecek kabı ile değiştirin.
    NOT: Ortalama olarak, bir fare günde 5 g'a kadar yiyecek yiyecektir. Yaklaşık bir yiyecek kabı 2 gün boyunca beş fareye uygulanabilir.
  2. CART yiyeceklerini haftada üç kez yenileyin.
  3. Alımı izlemek için kullanılmış bardakları tartın. Tüketimi doğrulamak için fareleri haftalık olarak tartın.

4. Gerçek zamanlı PCR ile viral yükü izleyin

  1. İnsan bağışıklık hücrelerini (CD4 ve CD8 T hücre seviyeleri) ve BLT farelerinde HIV-1 replikasyonunu her 2 haftada bir retro-orbital kanama ile değerlendirin. Adım 1.5-1.8'deki talimatları izleyerek plazma toplayın.
  2. 8 hafta boyunca oral cART uygulamasından önce ve sırasında HIV-1 ile enfekte olmuş farelerin plazma viral yüklerini izleyin. Bir viral RNA ekstraksiyon kiti kullanarak plazmadan plazma viral RNA'sını çıkarın ve daha önce tarif edildiği gibi primerleri ve probları kullanarak gerçek zamanlı PCR ile ölçün (bakınız Malzeme Tablosu) 27,30,31. Aşağıdaki döngü protokolünü kullanın: 48 °C (15 dakika), 95 °C (10 dakika), ardından 45 döngü için 95 °C (15 sn), 60 °C (1 dakika) bisiklet kullanın.

5. CD4 / CD8 oranlarını akış sitometrisi ile değerlendirin

  1. 1.5-1.8 adımlarını izleyerek iki haftada bir kanamaların periferik kanından tek hücreli süspansiyonlar hazırlayın.
  2. Yüzey belirteçleri ile leke hücreleri ve akış sitometrisi ile analiz edilir. Akış sitometrisinde aşağıdaki yüzey işaretleyici antikorları 27,30,43,49'u kullanın: CD45 (klon HI30), CD8 (klon SK1), CD3 (klon OKT3), CD4 (klon RPA-T4)27,30,42,49.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

25 g ağırlığındaki ortalama bir farenin günde 4 g yiyecek tükettiğini varsayarsak, oral alım yoluyla günlük ilaç dozu 2.88 mg / kg TFV, 83 mg / kg FTC ve 768 mg / kg RAL'ye karşılık gelir. Optimize edilmiş gıda rejiminin toksik olup olmadığını ve günlük cART enjeksiyonuna kıyasla genel sağlığı etkileyip etkilemediğini test etmek için, farelerin ağırlığı, oral veya deri altı enjeksiyon yoluyla cART'den önce ve sırasında haftalık olarak izlendi. Her grupta cART uygulamasından önce anlamlı ağırlık farkı yoktu (Şekil 1). Bununla birlikte, günlük cART SC enjeksiyonu sırasında fare ağırlığı sürekli olarak azalmıştır. Buna karşılık, DietGel'deki FTC / TDF / ELV veya FTC / TDF / RAL, 5 haftalık oral cART uygulamasından sonra fare ağırlıklarını ART öncesi başlangıç seviyelerine geri yükledi. Ek olarak, Raltegravir veya Elvitegravir grupları arasında anlamlı bir ağırlık değişikliği gözlenmedi.

Oral cART uygulamasının viral yükü günlük enjeksiyon kadar etkili bir şekilde baskılayıp baskılamadığını test etmek için, iki haftada bir plazma viral yükleri RT-PCR kullanılarak değerlendirildi. Şekil 2 , FTC / TDF / ELV ART gıda rejiminin% 100 viral replikasyonu 4 hafta içinde tespit edilemeyen seviyelere etkili bir şekilde bastırdığını göstermektedir; FTC / TDF / RAL ART gıda rejimi, farelerin% 80'ini 4 hafta içinde tespit edilemeyen seviyelere baskılayabilirken, SC enjeksiyonu alan farelerin sadece% 70'i 4 haftalık tedaviden sonra tespit edilemeyen seviyelere ulaştı. Sonuçlar, oral uygulamanın viral replikasyonu SC enjeksiyonundan daha hızlı ve daha verimli bir şekilde baskıladığını göstermiştir. Ayrıca, cART gıda rejimi, SC günlük enjeksiyonundan önce periferik kandaki CD4 / CD8 oranlarının daha da düşmesini önledi (Şekil 3). Bu sonuçlar, önerilen oral cART rejiminin, plazma viremisini tespit seviyesinin altında başarılı bir şekilde baskılayabileceğini, CD4 T hücre seviyelerini hızla geri yükleyebileceğini ve HIV-1 ile enfekte olmuş insanlaştırılmış farelerde hayvanların genel sağlığını iyileştirebileceğini göstermiştir.

Figure 1
Şekil 1: Farklı gruplarda HIV-1 enfeksiyonundan sonra cART tedavisi öncesi ve sırasında fare vücut ağırlığı değişir. İnsanlaştırılmış fareler, bağışıklık resusyonundan sonra HIVNFNSXSL9 ile enfekte oldu. 4 haftalık HIV-1 enfeksiyonundan sonra, fareler ya subkutan (SC) enjeksiyon yoluyla FTC / TDF / RAL rejimi ile 7.5 hafta daha tedavi edildi ya da FTC / TDF / RAL veya FTC / TDF / ELV'nin oral yoldan uygulanmasıyla tedavi edildi. Fare vücut ağırlıkları HIV enfeksiyonundan 1 hafta önce ölçüldü. Tüm istatistiksel karşılaştırmalar Mann-Whitney testi, raporlama grubu ortalaması (± S.E.) kullanılarak yapıldı. Yeşil yıldız yıldızları FTC/TDF/ELV gıda oral grubu ile FTC/TDF/RAL SC enjeksiyon grubu arasında istatistiksel farklılıklar göstermektedir. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P 0,001'<. n=6-7 her grupta. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Gıda oral cART uygulaması daha hızlı viral baskılanma gösterir. Şekil 1'de açıklandığı gibi, fareler ya tedavi edilmedi ya da deri altı enjeksiyonu yoluyla FTC / TDF / RAL rejimi ile tedavi edildi ve 7.5 hafta boyunca gıda kabı mock, FTC / TDF / RAL veya FTC / TDF / ELV gıda rejimlerinin oral yoldan uygulanması yoluyla tedavi edildi. (A) Farklı gruplarda HIV-1 enfeksiyonundan sonra zamanla plazma viral yükü. (B) Farklı gruplarda HIV-1 enfeksiyonu sonrası zaman içindeki viral yükün özeti, %95 güven aralığı (CI) ile grup geometrik ortalamasını raporlamak. Siyah oklar, cART ile tedavi edilen gruplar için cART başlatma zamanını gösterir. (C) Her grup için saptanamayan viral yüke cART tedavisi sonrası sürenin sağkalım analizi. n= 6-7 her grupta. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: ART gıda oral uygulamaları CD4/CD8 oranının daha hızlı restorasyonunu göstermektedir. Her grup için HIV-1 enfeksiyonundan sonra periferik kandaki CD4/CD8 oranı. Tüm istatistiksel karşılaştırmalar Mann-Whitney testi, raporlama grubu ortalaması (± S.E.) kullanılarak yapıldı. Kırmızı yıldız yıldızları FTC/TDF/RAL gıda oral grubu ile FTC/TDF/RAL SC enjeksiyon grubu arasında istatistiksel farklılıklar göstermektedir. *P 0,05 <. n=6-7 her grupta. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, HIV-1 ile enfekte olmuş insanlaştırılmış fareler için, yüksek besleyici gıdalar içinde üç antiretroviral ilacı birleştirerek oral bir cART uygulama yöntemi geliştirilmiştir. Günlük enjeksiyonlarla yapılan uygulamayla karşılaştırıldığında, oral teslimatın kullanımı daha kolaydır, uygulama sıklığını sınırlar, hayvan kullanımını azaltır, stresi en aza indirir ve güvenliği artırır55. Bu noktaya kadar, insanlaştırılmış farelerde yapılan sadece birkaç çalışma 24,37,41, fareleri tedavi etmek için ezilmiş ART ilaçları içeren gıda peletlerini kullanmıştır. Bununla birlikte, bu yöntemin, özel gıda peletlerinin üretimine sınırlı erişim nedeniyle yaygın olarak uygulanması zordur. Diğer çalışmalar 42,43,44,45,46 içme suyunu cART dağıtım sistemi olarak kullanmıştır. Bununla birlikte, bir ilacın içme suyuna bileşikleştirilmesi, aktif bileşenlerin stabilitesini, saflığını ve hatta gücünü değiştirebilir. Ek olarak, TDF, RAL ve ELV dahil olmak üzere birçok antiretroviral ilaç suda zayıf çözünür. Çalışmalar, TDF'nin oral biyoyararlanımının yüksek yağlı bir öğün56'dan sonra% 40 arttığını göstermiştir, bu da lipazların gıda tarafından rekabetçi inhibisyonunun TDF57 için belirli bir koruma sağlayabileceğini düşündürmektedir. DietGel Boost, araştırma hayvanlarının genel refahını artıran hidrasyon, beslenme ve zenginleştirme ürünleri sağlayan bir gıda takviyesidir58. Besin takviyeli jel, ilave karbonhidratlar, proteinler, yağlar, mineraller ve elektrolitler içeren% 25-30 saf sudan oluşur ve fitoöstrojenler ve nitrozaminleriçermez 58. Püre diyetlerine ekonomik, etkili ve emek açısından verimli bir alternatif sağlar58. Toplam yağın% 20.3'ü Boost kabına dahil edildiğinden, yüksek besin seviyelerinin TDF'yi daha iyi çözebileceğini ve dolayısıyla oral biyoyararlanımını artırabileceğini öneriyoruz. Bu nedenle, HIV-1 ile enfekte olmuş bireylerin şu anda kullandıkları cART ilaçlarının peroral dağıtımını taklit etmek için cART ilaçlarını vermek için yüksek besleyici bir gıda süspansiyonu kullanılmıştır.

Fareler insanlardan daha yüksek bir metabolizmaya sahiptir ve bu nedenle, farklı bileşiklerin dozu, referans59'da açıklandığı gibi bir formülle dönüştürülmüş ve kullanılmıştır. 0.4 mg (toplam doz) RAL, 0.1 mg (toplam doz) FTC ve 2.14 mg (toplam doz) TDF'nin insan dozları, insanlar ve fareler için 37 (Km) ve 3 (Km) fare eşdeğer doz değerlerini tahmin etmek için düzeltme faktörüne (Km, türlerin ortalama vücut ağırlığının (kg) vücut yüzey alanına (m2) bölünmesiyle tahmin edilen Km) esas alınarak dönüştürülmüştür59, sırasıyla. TDF, RAL ve ELV'nin suda nispeten düşük çözünürlüğü göz önüne alındığında, DMSO burada cART ilaçları için bir çözücü olarak kullanılmıştır. Oral cART gıdasında bulunan DMSO'nun son konsantrasyonu% 0.0059'dur (v / v). DMSO konsantrasyonu çok düşüktür ve bir ilaç çözücüsü60,61,62,63 olarak nispeten güvenlidir. Önemli olarak, bu çalışmalarda farelerde kürk kaybı veya herhangi bir davranış değişikliği gözlenmemiştir.

Yukarıda açıklanan prosedür, HIV-1 ile enfekte olmuş insanlaştırılmış fareleri tedavi etmek için oldukça sağlam ve tekrarlanabilir bir cART dağıtım yöntemidir. Bu protokol kolayca takip edilebilir. Protokoldeki kritik adımlar, 1) insanlaştırılmış farelerin immün yetmezliğini göz önünde bulundurarak DietGel gıdası ile ilgili protokolde yer alan herhangi bir materyalin tüm sürecini steril tutmak ve 2) çoklu çözülme / dondurulmuş cART stok çözeltilerinden kaçınmak ve aliquot cART ilaçlarını fare sayılarına ve gruplarına göre uygun şekilde önlemektir. Veriler, gıda kabı içinde önceden karıştırılmış üç ilaçlı cART'ın (tdf, ftc ve RAL veya ELV) oral yoldan uygulanmasının, HIV-1 replikasyonunu etkili bir şekilde baskıladığını ve plazmadaki viral yükü tedaviden sonraki 4 hafta içinde tespit edilemeyen seviyelere indirgediğini göstermektedir. Oral cART gıda uygulaması sadece CD4 T hücrelerinde daha fazla düşüşü önlemekle kalmadı, aynı zamanda periferik kanda CD4 T hücre yüzdesinin artmasına neden oldu. Ek olarak, oral cART uygulama yöntemi, fare ağırlığını günlük enjeksiyondan daha hızlı geri kazandırdı ve genel sağlığı iyileştirdi.

Önemli olarak, bu yöntem, araştırmacının cART ilaçlarının HIV-1 ile enfekte olmuş insanlaştırılmış farelere günlük enjeksiyonu sırasında keskinliğe maruz kalma riskini ortadan kaldırdı. İnsanlaştırılmış farelerde HIV-1 RNA replikasyonunu başarılı bir şekilde baskılayan önerilen yöntem, cART ile tedavi edilen kronik HIV-1 ile enfekte olmuş bireylerde ilaç dağıtımını yakından taklit eden yeni tedavi tedavileri geliştirmek için klinik öncesi kavram kanıtı çalışmaları için oldukça değerli olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

SK, CDR3 Inc.'in kurucusudur. Geri kalan yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir ticari veya finansal ilişkinin yokluğunda yapıldığını beyan etmektedir.

Acknowledgments

Bu çalışmada kullanılan antiretroviral ilaçları sağladıkları için Dr. Romas Geleziunas ve Jeff Murry'ye ve Gilead'deki insanlara teşekkür ederiz. Bu çalışma NCI 1R01CA239261-01 (Mutfağa), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Viroloji Çekirdeği, Gen ve Hücre Terapisi Çekirdeği ve İnsanlaştırılmış Fare Çekirdeği), U19AI149504 (PI'ler: Mutfak ve Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (Zhen'e), NIAID R2120200174 (PI'ler: Xie ve Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo) tarafından finanse edildi. Bu çalışma UCLA AIDS Enstitüsü, James B. Pendleton Charitable Trust ve McCarthy Aile Vakfı tarafından da desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm petri dish Thermo Scientific Nunc 150288 For aliquoting ART food
APC anti-human CD8 Antibody Biolegend 344722 For flow cytometry
BD LSRFortessa BD biosciences For flow data collection
CD34 microbeads Miltenyi Biotec 130-046-702 For NSG-BLT mice generation
Centrifuge tubes Falcon 14-432-22 For dissolving ART
DietGel Boost ClearH2O 72-04-5022 For making ART food
Elvitegravir Gilead Gifted from Gilead
Emtricitabine Gilead Gifted from Gilead
FITC anti-human CD3 Antibody Biolegend 317306 For flow cytometry
Flowjo software FlowJo For flow cytometry data analysis
HIV-1 forward primer: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 probe: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′;		 IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 reverse primer: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
Human fetal tissue Advanced Bioscience Resources, Inc
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Pacific Blue anti-human CD45 Biolegend 304022 For flow cytometry
PerCP anti-human CD4 Antibody Biolegend 300528 For flow cytometry
QIAamp Viral RNA Kits Qiagen  52904 For measuring viral load
Raltegravir Merck Gifted from Merck
Sterile cell scrapers Thermo Scientific 179693 For aliquoting ART food
TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit Applied Biosystems 4392653 For plasma viral load detection
Tenofovir disoproxil fumarate Gilead Gifted from Gilead
Trimethoprim-Sulfamethoxazole Pharmaceutical Associates NDC 0121-0854-16 For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains
200 mg Sulfamethoxazole, USP
40 mg Trimethoprim, USP
NMT 0.5% Alcohol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Antiretroviral Therapy Cohort Collaboration. Life expectancy of individuals on combination antiretroviral therapy in high-income countries: a collaborative analysis of 14 cohort studies. Lancet. 372 (9635), 293-299 (2008).
  2. May, M. T., et al. Impact on life expectancy of HIV-1 positive individuals of CD4+ cell count and viral load response to antiretroviral therapy. AIDS. 28 (8), 1193-1202 (2014).
  3. Autran, B., et al. Positive effects of combined antiretroviral therapy on CD4+ T cell homeostasis and function in advanced HIV disease. Science. 277 (5322), 112-116 (1997).
  4. Palella, F. J., et al. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV outpatient study investigators. The New England Journal of Medicine. 338 (13), 853-860 (1998).
  5. Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
  6. Ananworanich, J., Dube, K., Chomont, N. How does the timing of antiretroviral therapy initiation in acute infection affect HIV reservoirs. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (1), 18-28 (2015).
  7. Whitney, J. B., et al. Rapid seeding of the viral reservoir prior to SIV viraemia in rhesus monkeys. Nature. 512 (7512), 74-77 (2014).
  8. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4 T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  9. Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature Immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  10. Brothers, T. D., et al. Frailty in people aging with human immunodeficiency virus (HIV) infection. Journal of Infectious Disease. 210 (8), 1170-1179 (2014).
  11. D. A. D. Study Group. Use of nucleoside reverse transcriptase inhibitors and risk of myocardial infarction in HIV-infected patients enrolled in the D:A:D study: a multi-cohort collaboration. Lancet. 371 (9622), 1417-1426 (2008).
  12. Schouten, J., et al. Cross-sectional comparison of the prevalence of age-associated comorbidities and their risk factors between HIV-infected and uninfected individuals: the AGEhIV cohort study. Clinical Infectious Diseases. 59 (12), 1787-1797 (2014).
  13. Policicchio, B. B., Pandrea, I., Apetrei, C. Animal models for HIV cure research. Frontiers in Immunology. 7, 12 (2016).
  14. Hessell, A. J., Haigwood, N. L. Animal models in HIV-1 protection and therapy. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (3), 170-176 (2015).
  15. Ambrose, Z., KewalRamani, V. N., Bieniasz, P. D., Hatziioannou, T. HIV/AIDS: in search of an animal model. Trends in Biotechnology. 25 (8), 333-337 (2007).
  16. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature Medicine. 12 (11), 1316 (2006).
  17. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  18. Wege, A. K., Melkus, M. W., Denton, P. W., Estes, J. D., Garcia, J. V. Functional and phenotypic characterization of the humanized BLT mouse model. Current Topics in Microbiology and Immunology. 324, 149-165 (2008).
  19. Garcia, J. V. In vivo platforms for analysis of HIV persistence and eradication. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 424-431 (2016).
  20. Carrillo, M. A., Zhen, A., Kitchen, S. G. The use of the humanized mouse model in gene therapy and immunotherapy for HIV and cancer. Frontiers in Immunology. 9, 746 (2018).
  21. Abeynaike, S., Paust, S. Humanized mice for the evaluation of novel HIV-1 therapies. Frontiers in Immunology. 12, 636775 (2021).
  22. Marsden, M. D., Zack, J. A. Humanized mouse models for human immunodeficiency virus infection. Annual Review of Virology. 4 (1), 393-412 (2017).
  23. Brainard, D. M., et al. Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
  24. Nischang, M., et al. Humanized mice recapitulate key features of HIV-1 infection: a novel concept using long-acting anti-retroviral drugs for treating HIV-1. PLoS One. 7 (6), 38853 (2012).
  25. Garcia-Beltran, W. F., et al. Innate immune reconstitution in humanized bone marrow-liver-thymus (HuBLT) mice governs adaptive cellular immune function and responses to HIV-1 infection. Frontiers in Immunology. 12, 667393 (2021).
  26. Cheng, L., et al. Blocking type I interferon signaling enhances T cell recovery and reduces HIV-1 reservoirs. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 269-279 (2017).
  27. Zhen, A., et al. Targeting type I interferon-mediated activation restores immune function in chronic HIV infection. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 260-268 (2017).
  28. Khamaikawin, W., et al. Modeling anti-HIV-1 HSPC-based gene therapy in humanized mice previously infected with HIV-1. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 23-32 (2018).
  29. Kitchen, S. G., et al. Engineering antigen-specific T cells from genetically modified human hematopoietic stem cells in immunodeficient mice. PLoS One. 4 (12), 8208 (2009).
  30. Zhen, A., et al. Robust CAR-T memory formation and function via hematopoietic stem cell delivery. PLoS Pathogens. 17 (4), 1009404 (2021).
  31. Zhen, A., et al. HIV-specific immunity derived from chimeric antigen receptor-engineered stem cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
  32. Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2013).
  33. Mu, W., Carrillo, M. A., Kitchen, S. G. Engineering CAR T cells to target the hiv reservoir. Frontiers in Celluar and Infection Microbiology. 10, 410 (2020).
  34. Arts, E. J., Hazuda, D. J. HIV-1 antiretroviral drug therapy. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 2 (4), 007161 (2012).
  35. Denton, P. W., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  36. Kovarova, M., et al. A long-acting formulation of the integrase inhibitor raltegravir protects humanized BLT mice from repeated high-dose vaginal HIV challenges. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (6), 1586-1596 (2016).
  37. Lavender, K. J., et al. An advanced BLT-humanized mouse model for extended HIV-1 cure studies. AIDS. 32 (1), 1-10 (2018).
  38. Denton, P. W., et al. Targeted cytotoxic therapy kills persisting HIV infected cells during ART. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003872 (2014).
  39. Marsden, M. D., et al. In vivo activation of latent HIV with a synthetic bryostatin analog effects both latent cell "kick" and "kill" in strategy for virus eradication. PLoS Pathogens. 13 (9), 1006575 (2017).
  40. Stuart, S. A., Robinson, E. S. Reducing the stress of drug administration: implications for the 3Rs. Science Report. 5, 14288 (2015).
  41. Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
  42. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics reduce systemic and gut inflammation in chronic treated HIV. PLoS Pathogens. 18 (1), 1010160 (2022).
  43. Mu, W., et al. Apolipoprotein A-I mimetics attenuate macrophage activation in chronic treated HIV. AIDS. 35 (4), 543-553 (2021).
  44. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics favorably impact cyclooxygenase 2 and bioactive lipids that may contribute to cardiometabolic syndrome in chronic treated HIV. Metabolism. 124, 154888 (2021).
  45. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational antiretroviral therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
  46. Llewellyn, G. N., et al. Humanized mouse model of HIV-1 latency with enrichment of latent virus in PD-1(+) and TIGIT(+) CD4 T cells. Journal of Virology. 93 (10), 02086 (2019).
  47. Kearney, B. P., Flaherty, J. F., Shah, J. Tenofovir disoproxil fumarate: clinical pharmacology and pharmacokinetics. Clinical Pharmacokinetics. 43 (9), 595-612 (2004).
  48. Speakman, J. R. Use of high-fat diets to study rodent obesity as a model of human obesity. International Journal of Obesity (Lond). 43 (8), 1491-1492 (2019).
  49. Zhen, A., et al. Stem-cell based engineered immunity against HIV infection in the humanized mouse model. Journal of Visualized Experiments. (113), e54048 (2016).
  50. Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A detailed protocol for characterizing the murine C1498 cell line and its associated leukemia mouse model. Journal of Visualized Experiments. (116), e54270 (2016).
  51. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
  52. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  53. Shimizu, S., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  54. Ladinsky, M. S., et al. Mechanisms of virus dissemination in bone marrow of HIV-1-infected humanized BLT mice. Elife. 8, 46916 (2019).
  55. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  56. Lamorde, M., et al. Effect of food on the steady-state pharmacokinetics of tenofovir and emtricitabine plus efavirenz in Ugandan adults. AIDS Research and Treatment. 2012, 105980 (2012).
  57. Watkins, M. E., et al. Development of a novel formulation that improves preclinical bioavailability of tenofovir disoproxil fumarate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 906-919 (2017).
  58. Moccia, K. D., Olsen, C. H., Mitchell, J. M., Landauer, M. R. Evaluation of hydration and nutritional gels as supportive care after total-body irradiation in mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (3), 323-328 (2010).
  59. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  60. Santos, N. C., Figueira-Coelho, J., Martins-Silva, J., Saldanha, C. Multidisciplinary utilization of dimethyl sulfoxide: pharmacological, cellular, and molecular aspects. Biochemical Pharmacology. 65 (7), 1035-1041 (2003).
  61. Kolb, K. H., Jaenicke, G., Kramer, M., Schulze, P. E. Absorption, distribution and elimination of labeled dimethyl sulfoxide in man and animals. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 85-95 (1967).
  62. Yellowlees, P., Greenfield, C., McIntyre, N. Dimethylsulphoxide-incuded toxicity. Lancet. 2 (8202), 1004-1006 (1980).
  63. Swanson, B. N. Medical use of dimethyl sulfoxide (DMSO). Reviews in Clinical & Basic Pharmacology. 5 (1-2), 1-33 (1985).

Tags

İmmünoloji ve Enfeksiyon Sayı 188
HIV-1 Enfekte İnsanlaştırılmış Farelerde Oral Kombinasyonel Antiretroviral Tedavi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A.,… More

Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A., Rezek, V., Martin, H., Lizarraga, M., Kitchen, S. Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice. J. Vis. Exp. (188), e63696, doi:10.3791/63696 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter