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Immunology and Infection

एचआईवी -1 संक्रमित मानवीकृत चूहों में मौखिक संयोजन एंटीरेट्रोवाइरल उपचार

Published: October 6, 2022 doi: 10.3791/63696
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Division of Hematology and Oncology, David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles

Summary

यह प्रोटोकॉल मौखिक संयोजन एंटीरेट्रोवाइरल दवाओं को वितरित करने के लिए एक नई विधि का वर्णन करता है जो मानवकृत चूहों में एचआईवी -1 आरएनए प्रतिकृति को सफलतापूर्वक दबा देता है।

Abstract

ह्यूमन इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी -1) महामारी दुनिया भर में बेरोकटोक फैल रही है, और वर्तमान में, एचआईवी के खिलाफ कोई टीका उपलब्ध नहीं है। यद्यपि संयोजन एंटीरेट्रोवाइरल थेरेपी (सीएआरटी) वायरल प्रतिकृति को दबाने में सफल रही है, लेकिन यह एचआईवी संक्रमित व्यक्तियों से जलाशय को पूरी तरह से खत्म नहीं कर सकती है। एचआईवी संक्रमण के लिए एक सुरक्षित और प्रभावी इलाज रणनीति के लिए बहुआयामी तरीकों की आवश्यकता होगी, और इसलिए एचआईवी -1 संक्रमण के लिए पशु मॉडल की प्रगति एचआईवी इलाज अनुसंधान के विकास के लिए महत्वपूर्ण है। मानवकृत चूहे एचआईवी -1 संक्रमण की प्रमुख विशेषताओं को पुन: प्राप्त करते हैं। मानवकृत माउस मॉडल एचआईवी -1 से संक्रमित हो सकता है और वायरल प्रतिकृति को सीएआरटी आहार के साथ नियंत्रित किया जा सकता है। इसके अलावा, सीएआरटी रुकावट के परिणामस्वरूप मानवकृत चूहों में एक त्वरित वायरल रिबाउंड होता है। हालांकि, जानवर को सीएआरटी का प्रशासन अप्रभावी, कठिन या विषाक्त हो सकता है, और कई नैदानिक रूप से प्रासंगिक सीएआरटी आहार बेहतर उपयोग करने में असमर्थ हैं। शोधकर्ताओं के लिए संभावित रूप से असुरक्षित होने के साथ-साथ, आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली गहन दैनिक इंजेक्शन प्रक्रिया द्वारा सीएआरटी का प्रशासन जानवर के शारीरिक संयम से तनाव को प्रेरित करता है। इस लेख में वर्णित एचआईवी -1 संक्रमित मानवकृत चूहों के इलाज के लिए नई मौखिक सीएआरटी विधि के परिणामस्वरूप पहचान स्तर से नीचे विरेमिया का दमन हुआ, सीडी 4 + बहाली की दर में वृद्धि हुई, और एचआईवी -1 संक्रमित मानवकृत चूहों में समग्र स्वास्थ्य में सुधार हुआ।

Introduction

क्रोनिक ह्यूमन इम्यूनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) संक्रमित व्यक्तियों की जीवन प्रत्याशा में संयोजन एंटीरेट्रोवाइरल उपचार (सीएआरटी) 1,2 के साथ काफी सुधार हुआ है। सीएआरटी सफलतापूर्वक एचआईवी -1 प्रतिकृति को कम करता है और एचआईवी -1 क्रोनिक रूप सेसंक्रमित प्रतिभागियों के बहुमत में सीडी 4 + टी सेल की गिनती को सामान्य स्थिति में बढ़ाता है, जिसके परिणामस्वरूप समग्र स्वास्थ्य में सुधार होता है और नाटकीय रूप से रोग की प्रगति कम होजाती है। हालांकि, अव्यक्त एचआईवी -1 जलाशय तब भी स्थापित किया जाता है जब तीव्र संक्रमण 5,6,7 के दौरान एआरटी शुरू किया जाता है। एआरटी के दौरान जलाशय वर्षों से बने रहते हैं और एआरटी रुकावट के बाद तेजी से वायरल रिबाउंड अच्छी तरह से प्रलेखितहै 8,9. एआरटी पर एचआईवी के साथ रहने वाले लोगों को कार्डियोवैस्कुलर बीमारी, कैंसर और न्यूरो विकार10,11,12 जैसी कोमोर्बिडिटी का अधिक खतरा होता है। इसलिए, एचआईवी के लिए एक कार्यात्मक इलाज की आवश्यकता है। एचआईवी -1 संक्रमण के लिए पशु मॉडल नई एचआईवी इलाज रणनीतियों को विकसित करने और मान्य करने में स्पष्ट लाभ प्रदान करते हैं 13,14,15। मानवकृत चूहे, एक छोटे पशु मॉडल के रूप में, विभिन्न ऊतकों में बहुवंशीय मानव प्रतिरक्षा कोशिका पुनर्गठन प्रदान कर सकते हैं, जो एचआईवी संक्रमण16,17,18,19 के निकट अध्ययन की अनुमति देता है। मानवकृत मॉडलों में, मानवकृत अस्थि मज्जा-यकृत-थाइमस (बीएलटी) मॉडल सफलतापूर्वक पुरानी एचआईवी -1 संक्रमण के साथ-साथ एचआईवी -1 संक्रमण 20,21,22,23,24 के लिए कार्यात्मक मानव प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को पुन: उत्पन्न करता है। इसलिए, एचआईवी अनुसंधान क्षेत्र में विभिन्न पहलुओं की जांच के लिए मानवकृत बीएलटी माउस मॉडल का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। मानवकृत बीएलटी चूहे न केवल लगातार एचआईवी -1 संक्रमण और रोगजनन के पुनर्मूल्यांकन के लिए अच्छी तरह से स्थापित मॉडल हैं, बल्कि सेल थेरेपी-आधारित हस्तक्षेप रणनीतियों के मूल्यांकन के लिए परिणामी उपकरण भी हैं। वर्तमान लेखकों और अन्य लोगों ने प्रदर्शित किया है कि मानवकृत बीएलटी चूहों का मॉडल लगातार एचआईवी -1 संक्रमण और रोगजनन 25,26,27 को पुन: उत्पन्न करता है और सेल थेरेपी-आधारित हस्तक्षेप रणनीतियों 28,29,30,31,32,33 का मूल्यांकन करने के लिए उपकरण प्रदान करता है।

एंटीरेट्रोवाइरल दवाओं के संयोजन से युक्त सीएआरटी आहार जो दैनिक रूप से लिया जाता है, एचआईवी -1 प्रतिकृति को इस बिंदु तक दबा देता है कि सफलतापूर्वक इलाज किए गए व्यक्तियों में वायरल लोड लंबे समय तक पता लगाने योग्य नहीं रहताहै। नैदानिक रूप से प्रासंगिक सीएआरटी आहार के साथ एचआईवी संक्रमित मानवीकृत चूहों के इलाज के परिणाम एचआईवी -1 संक्रमित एआरटी-उपचारित व्यक्तियों में देखे गए समान हैं22: एचआईवी -1 का स्तर सीएआरटी का पता लगाने और रुकावट की सीमा से नीचे दबा दिया जाताहै जिसके परिणामस्वरूप अव्यक्त जलाशय से एचआईवी प्रतिकृति में वापसी होती है। चमड़े के नीचे (एससी) 27,36,37 या इंट्रापरिटोनियल (आईपी) 37,38,39 इंजेक्शन आमतौर पर मानवकृत चूहों में सीएआरटी उपचार के लिए उपयोग किया जाने वाला मार्ग है। हालांकि, गहन दैनिक इंजेक्शन शारीरिक संयम40 द्वारा जानवरों को तनाव लाता है। शार्प्स का उपयोग करते समय एचआईवी के बढ़ते जोखिम के कारण यह शोधकर्ताओं के लिए श्रम-गहन और संभावित रूप से असुरक्षित भी है। मौखिक प्रशासन एचआईवी -1 संक्रमित व्यक्तियों द्वारा ली जाने वाली सीएआरटी दवाओं के अवशोषण, वितरण और उत्सर्जन की नकल करने के लिए आदर्श है। मौखिक प्रशासन में आमतौर पर एंटीरेट्रोवाइरल दवाओं को निष्फल (चूहों के इम्यूनोडेफिशिएंसी के कारण आवश्यक) भोजन 24,37,41 या पानी 42,43,44,45,46 में रखने के लिए अनुकूलित और अक्सर श्रमसाध्य प्रक्रियाएं शामिल होती हैं , जो कई एंटीरेट्रोवाइरल दवाओं के साथ रासायनिक रूप से संगत हो सकता है या नहीं भी हो सकता है, या कुछ ऐसा होता है जो चूहे आसानी से नहीं खाएंगे या पीएंगे (जो शरीर में खुराक और दवा के स्तर को प्रभावित करेगा)। यहां प्रस्तावित नोवेल पेरोरियल सीएआरटी प्रशासन विधि विभिन्न प्रकार की एंटीरेट्रोवाइरल दवाओं, सुरक्षा और तैयारी और प्रशासन में आसानी, और दैनिक इंजेक्शन के परिणामस्वरूप पशु तनाव और चिंता में कमी के कारण पिछले प्रसव प्रयासों को पार करती है।

टेनोफोविर डिसोप्रोक्सिल फ्यूमरेट (टीडीएफ), एल्वितेग्रेविर (ईएलवी), और राल्टेग्रेविर (आरएएल) खराब पानी में घुलनशील दवाएं हैं। दिलचस्प बात यह है कि वसायुक्त खाद्य पदार्थों के साथ टीडीएफ की बढ़ी हुई जैव उपलब्धता देखी जाती है, यह सुझाव देते हुए कि फैटी भोजन द्वारा लाइपेस का प्रतिस्पर्धी निषेध टीडीएफ47 के लिए कुछ सुरक्षा प्रदान कर सकता है। इसलिए, नियमित कृंतक चाउ (10 ग्राम प्रति 100 ग्राम) और एक विशिष्ट माउस उच्च वसा वाले आहार (40-60 ग्राम प्रति 100 ग्राम) की तुलना में उनकी मामूली वसा सामग्री (20.3 ग्राम प्रति 100 ग्राम) के आधार पर डिलीवरी की विधि के रूप में नियमित कृंतक चाउ को बदलने के लिए डाइटगेल बूस्ट कप का चयन किया गया था। एक कप का कुल वजन 75 ग्राम है; इस प्रकार, प्रत्येक कप में भोजन की मात्रा होगी, और इसलिए दवा, 3 दिनों में पांच चूहों के लिए पर्याप्त होगी।

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Protocol

अनाम मानव भ्रूण ऊतक व्यावसायिक रूप से अधिग्रहित किया गया था। पशु अनुसंधान सभी संघीय, राज्य और स्थानीय दिशानिर्देशों के अनुसार कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, लॉस एंजिल्स और (यूसीएलए) पशु अनुसंधान समिति (एआरसी) द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार किया गया था। विशेष रूप से, सभी प्रयोग यूसीएलए एआरसी प्रोटोकॉल संख्या 2010-038-02 बी के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) और एसोसिएशन फॉर द असेसमेंट एंड एक्रेडिटेशन ऑफ लेबोरेटरी एनिमल केयर (एएएलएसी) इंटरनेशनल के प्रयोगशाला जानवरों के आवास और देखभाल के लिए सिफारिशों और दिशानिर्देशों के अनुसार किए गए थे। सभी सर्जरी केटामाइन (100 मिलीग्राम / किग्रा) / ज़ाइलज़िन (5 मिलीग्राम / किग्रा) और आइसोफ्लुरेन संज्ञाहरण (2-3 वॉल्यूम%) के तहत की गई थीं और जानवरों के दर्द और असुविधा को कम करने के लिए सभी प्रयास किए गए थे।

1. एचआईवी -1 से संक्रमित मानवीकृत चूहे

नोट: मानवकृत चूहों का निर्माण किया गया था जैसा कि पहले30,31,49 में वर्णित किया गया था। प्रोटोकॉल संक्षेप में नीचे वर्णित है।

  1. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार एंटी-सीडी 34 माइक्रोबीड्स के माध्यम से मानव भ्रूण के यकृत से सीडी 34 + हेमटोपोइएटिक पूर्वज कोशिकाओं को शुद्ध करें।
  2. सर्जरी से पहले 6-8 सप्ताह के NOD/SCID/IL2R-−−--(एनएसजी) नर और मादा चूहों और उप-घातक रूप से विकिरणित (2.7 GY) को एनेस्थेटाइज करें।
  3. भ्रूण के यकृत के समान दाता से प्राप्त थाइमस को यकृत के साथ गुर्दे के कैप्सूल के नीचे प्रत्यारोपित करें।
  4. आरोपण के बाद, चूहों को 0.5 मिलियन से एक मिलियन सीडी 34 + कोशिकाओं के साथ इंजेक्ट किया जाता है, अंतःशिरा रूप से।
  5. 8-10 सप्ताह के बाद, रेट्रो-ऑर्बिटल ब्लीड 50 के माध्यम से 100 μL माउस रक्त को माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में एकत्र करें जिसमें 5 μL EDTA और सेंट्रीफ्यूज 3 मिनट के लिए 350 x g पर होता है।
  6. माउस के एचआईवी -1 से संक्रमित होने के बाद वायरल लोड की निगरानी के लिए प्लाज्मा को -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 83% NH4C घोल के 2 एमएल जोड़ें और लाल रक्त कोशिकाओं को लाइस करने के लिए कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. लाइसिस को रोकने के लिए 10% भ्रूण बोवाइन सीरम (एफबीएस) के साथ आरपीएमआई के 10 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 300 x g पर स्पिन करें।
  8. एस्पिरेटेड सुपरनैटेंट। एंटीबॉडी पैनल के साथ स्टेन कोशिकाएं ( सामग्री की तालिका देखें) और मानव प्रतिरक्षा कोशिका एनग्राफमेंट की जांच के लिए फ्लो साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करें।
  9. इंसुलिन सिरिंज का उपयोग करके एचआईवी -1 स्ट्रेन (यानी, एनएफएनएसएक्सएसएल 930,53,54) के कम से कम 200 एनजी पी 24 के साथ रेट्रो-ऑर्बिटल नस इंजेक्शन 51,52 द्वारा 50% से अधिक परिसंचारी सीडी 45 + कोशिकाओं का प्रदर्शन करने वाले चूहों को संक्रमित किया गया। प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए और वायरल लोड को मापने के लिए रक्त को द्विसाप्ताहिक एकत्र करें।

2. एआरटी दवाओं की तैयारी

  1. व्यक्तिगत दवाओं का वजन; उदाहरण के लिए, सीएआरटी के साथ 10 खाद्य कप बनाने के लिए, 250 मिलीग्राम एफटीसी (एम्ट्रिसिटाबिन), 375 मिलीग्राम टीडीएफ, और 500 मिलीग्राम आरएएल या ईएलवी को बायोसेफ्टी कैबिनेट में अलग-अलग बाँझ 15 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में वजन करने के लिए बाँझ सेल स्क्रैपर का उपयोग करें।
  2. 250 मिलीग्राम एफटीसी ट्यूब (250 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम सांद्रता) में डीएमएसओ के 1 एमएल जोड़ें, 375 मिलीग्राम टीडीएफ ट्यूब (250 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता) में 1.5 एमएल डीएमएसओ जोड़ें, और 500 मिलीग्राम आरएएल या ईएलवी ट्यूब (500 मिलीग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता) में 1 एमएल डीएमएसओ जोड़ें। दवा मिश्रण को पूरी तरह से घुलने और एक स्पष्ट समाधान प्राप्त होने तक हिलाएं या पाइप करें।
  3. बाँझ सिरिंज के साथ समाधान को निष्फल करने के लिए 0.22 μM छिद्र आकार हाइड्रोफिलिक पीवीडीएफ झिल्ली फ़िल्टर का उपयोग करें। व्यक्तिगत दवा समाधान 12 सप्ताह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. उपयोग करने के लिए तैयार होने पर, समाधान स्पष्ट होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक दवा के घोल के एक एलिकोट को ताजा पिघलाएं। पिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह मिलाएं।
  5. दवाओं को मिलाएं और मास्टर मिश्रण बनाने के लिए अच्छी तरह से मिलाएं: डीएमएसओ में एफटीसी का 1 एमएल, डीएमएसओ में 1.5 एमएल टीडीएफ, और डीएमएसओ में 1 एमएल ईएलवी या आरएएल।
    नोट: यह राशि 10 खाद्य कप बनाएगी।
  6. एक DietGel Boost cART कप बनाने के लिए एक कप में 350 μL cART मास्टर मिक्स समाधान जोड़ें।
  7. कप में 0.75 मिलीलीटर ट्राइमेथोप्रिम-सल्फामेथोक्साज़ोल (0.48 मिलीग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता) जोड़ें।
  8. १ एमएल बाँझ पिपेट युक्तियों का उपयोग करके अच्छी तरह से हिलाएं।
  9. मूल कप से सीएआरटी युक्त खाद्य कप को आवश्यकतानुसार 60 मिमी पेट्री डिश पर माइक्रो स्पैटुला के साथ मिलाएं। चूहों की संख्या के अनुसार प्रत्येक पिंजरे के लिए सीएआरटी युक्त खाद्य कप की मात्रा की गणना करने के लिए भोजन को एक पैमाने पर तौलें।

3. एचआईवी -1 संक्रमित चूहों के लिए एआरटी दवाओं का प्रशासन

  1. पिंजरे से नियमित चाउ निकालें और इसे सीएआरटी युक्त खाद्य कप से बदलें।
    नोट: औसतन, एक माउस प्रति दिन 5 ग्राम तक भोजन खाएगा। लगभग एक खाद्य कप 2 दिनों के लिए पांच चूहों को प्रशासित किया जा सकता है।
  2. प्रति सप्ताह तीन बार सीएआरटी भोजन को ताज़ा करें।
  3. सेवन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किए गए कप का वजन करें। खपत की पुष्टि करने के लिए चूहों को साप्ताहिक वजन करें।

4. रियल-टाइम पीसीआर द्वारा वायरल लोड की निगरानी करें

  1. रेट्रो-ऑर्बिटल रक्तस्राव द्वारा हर 2 सप्ताह में बीएलटी चूहों में मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं (सीडी 4 और सीडी 8 टी सेल स्तर) और एचआईवी -1 प्रतिकृति का आकलन करें। चरण 1.5-1.8 में निर्देशों का पालन करके प्लाज्मा काटें।
  2. 8 सप्ताह के लिए मौखिक सीएआरटी प्रशासन से पहले और दौरान एचआईवी -1 से संक्रमित चूहों के प्लाज्मा वायरल लोड की निगरानी करें। वायरल आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग करके प्लाज्मा से प्लाज्मा वायरल आरएनए निकालें और प्राइमरों और जांच (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके वास्तविक समय पीसीआर द्वारा इसे निर्धारित करें जैसा कि पहले वर्णित 27,30,31 है। निम्नलिखित साइकिल िंग प्रोटोकॉल का उपयोग करें: 48 डिग्री सेल्सियस (15 मिनट), 95 डिग्री सेल्सियस (10 मिनट), फिर 45 चक्रों के लिए 95 डिग्री सेल्सियस (15 सेकंड), 60 डिग्री सेल्सियस (1 मिनट) साइकिल चलाना।

5. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सीडी 4 / सीडी 8 अनुपात का आकलन करें

  1. चरण 1.5-1.8 का पालन करते हुए द्विसाप्ताहिक रक्तस्राव के परिधीय रक्त से एकल-कोशिका निलंबन तैयार करें।
  2. सतह मार्करों के साथ दाग कोशिकाएं और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करें। फ्लो साइटोमेट्री में निम्नलिखित सतह मार्कर एंटीबॉडी 27,30,43,49 का उपयोग करें: सीडी 45 (क्लोन एचआई 30), सीडी 8 (क्लोन एसके 1), सीडी 3 (क्लोन ओकेटी 3), सीडी 4 (क्लोन आरपीए-टी 4) 27,30,42,49।

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Representative Results

मान लें कि 25 ग्राम वजन वाला एक औसत माउस प्रति दिन 4 ग्राम भोजन का उपभोग करता है, मौखिक सेवन के माध्यम से दैनिक दवा की खुराक 2.88 मिलीग्राम / किलोग्राम टीएफवी, 83 मिलीग्राम / किलोग्राम एफटीसी और 768 मिलीग्राम / किग्रा आरएएल से मेल खाती है। यह जांचने के लिए कि क्या अनुकूलित खाद्य आहार विषाक्त है और सीएआरटी के दैनिक इंजेक्शन की तुलना में समग्र स्वास्थ्य को प्रभावित करता है, मौखिक या चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से सीएआरटी से पहले और दौरान चूहों के वजन की साप्ताहिक निगरानी की गई थी। प्रत्येक समूह में सीएआरटी प्रशासन से पहले कोई महत्वपूर्ण वजन अंतर नहीं थे (चित्रा 1)। हालांकि, दैनिक सीएआरटी एससी इंजेक्शन के दौरान माउस का वजन लगातार कम हो गया। इसके विपरीत, डाइटजेल में एफटीसी / टीडीएफ / ईएलवी या एफटीसी / टीडीएफ / आरएएल ने मौखिक सीएआरटी प्रशासन के 5 सप्ताह के बाद माउस वजन को पूर्व-एआरटी दीक्षा स्तरों पर बहाल किया। इसके अलावा, राल्टेग्रेविर या एल्वितेग्रेविर समूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण वजन परिवर्तन नहीं देखा गया।

यह जांचने के लिए कि क्या मौखिक सीएआरटी प्रशासन दैनिक इंजेक्शन के रूप में प्रभावी ढंग से वायरल लोड को दबाता है, आरटी-पीसीआर का उपयोग करके द्विसाप्ताहिक प्लाज्मा वायरल लोड का मूल्यांकन किया गया था। चित्र 2 से पता चलता है कि एफटीसी / टीडीएफ / ईएलवी एआरटी खाद्य आहार 100% कुशलता से 4 सप्ताह के भीतर वायरल प्रतिकृति को अज्ञात स्तर तक दबा दिया; आरएएल एआरटी खाद्य आहार 4 सप्ताह के भीतर 80% चूहों को अज्ञात स्तर तक दबा सकता है, जबकि एससी इंजेक्शन प्राप्त करने वाले केवल 70% चूहे 4 सप्ताह के उपचार के बाद अज्ञात स्तर तक पहुंच गए। परिणामों से पता चला है कि मौखिक प्रशासन एससी इंजेक्शन की तुलना में वायरल प्रतिकृति को तेजी से और अधिक कुशलता से दबाता है। इसके अलावा, सीएआरटी खाद्य आहार ने एससी दैनिक इंजेक्शन (चित्रा 3) से पहले परिधीय रक्त में सीडी 4 / सीडी 8 अनुपात की और गिरावट को रोका। इन परिणामों ने सुझाव दिया कि प्रस्तावित मौखिक सीएआरटी आहार सफलतापूर्वक पता लगाने के स्तर से नीचे प्लाज्मा विरेमिया को दबा सकता है, सीडी 4 टी सेल के स्तर को तेजी से बहाल कर सकता है, और एचआईवी -1 संक्रमित मानवकृत चूहों में जानवरों के समग्र स्वास्थ्य में सुधार कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: विभिन्न समूहों में एचआईवी -1 संक्रमण के बाद सीएआरटी उपचार से पहले और दौरान माउस शरीर का वजन बदलता है। प्रतिरक्षा पुनर्गठन के बाद मानवकृत चूहों को एचआईवीएनएफएनएसएक्सएसएल 9 से संक्रमित किया गया था। एचआईवी -1 संक्रमण के 4 सप्ताह के बाद, चूहों को या तो चमड़े के नीचे (एससी) इंजेक्शन के माध्यम से एफटीसी / टीडीएफ / आरएएल आहार के साथ 7.5 सप्ताह के लिए इलाज किया गया था, या एफटीसी / टीडीएफ / आरएएल या एफटीसी / टीडीएफ / ईएलवी के मौखिक प्रशासन द्वारा। माउस शरीर के वजन को एचआईवी संक्रमण से 1 सप्ताह पहले से मापा गया था। सभी सांख्यिकीय तुलनाएं मान-व्हिटनी परीक्षण का उपयोग करके आयोजित की गई थीं, रिपोर्टिंग समूह माध्य (± एसई)। ग्रीन तारांकन सितारे एफटीसी / टीडीएफ / ईएलवी खाद्य मौखिक समूह और एफटीसी / टीडीएफ / आरएएल एससी इंजेक्शन समूह के बीच सांख्यिकीय अंतर दिखाते हैं। * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001। प्रत्येक समूह में n = 6-7। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: खाद्य मौखिक सीएआरटी प्रशासन तेजी से वायरल दमन दिखाता है। जैसा कि चित्र 1 में वर्णित है, चूहों को या तो अनुपचारित किया गया था या चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से एफटीसी / टीडीएफ / आरएएल आहार के साथ इलाज किया गया था, और खाद्य कप मॉक, एफटीसी / टीडीएफ / आरएएल, या एफटीसी / टीडीएफ / ईएलवी खाद्य आहार के मौखिक प्रशासन के माध्यम से 7.5 सप्ताह के लिए। (ए) विभिन्न समूहों में एचआईवी -1 संक्रमण के बाद समय के साथ प्लाज्मा वायरल लोड। (बी) विभिन्न समूहों में एचआईवी -1 संक्रमण के बाद समय के साथ वायरल लोड का सारांश, 95% आत्मविश्वास अंतराल (सीआई) के साथ समूह ज्यामितीय माध्य की रिपोर्ट करना। काले तीर सीएआरटी उपचारित समूहों के लिए सीएआरटी दीक्षा के समय को इंगित करते हैं। (सी) प्रत्येक समूह के लिए अज्ञात वायरल लोड के लिए सीएआरटी उपचार के बाद के समय का उत्तरजीविता विश्लेषण। प्रत्येक समूह में n = 6-7 कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: एआरटी खाद्य मौखिक प्रशासन सीडी 4 / सीडी 8 अनुपात की तेजी से बहाली दिखाते हैं। प्रत्येक समूह के लिए एचआईवी -1 संक्रमण के बाद समय के साथ परिधीय रक्त में सीडी 4 / सीडी 8 अनुपात। सभी सांख्यिकीय तुलनाएं मान-व्हिटनी परीक्षण का उपयोग करके की गई थीं, समूह माध्य (± एसई) की रिपोर्टिंग की गई थी। लाल तारांकन सितारे एफटीसी / टीडीएफ / आरएएल खाद्य मौखिक समूह और एफटीसी / टीडीएफ / आरएएल एससी इंजेक्शन समूह के बीच सांख्यिकीय अंतर दिखाते हैं। * पी < 0.05. प्रत्येक समूह में n = 6-7। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

उच्च पोषक तत्व भोजन के भीतर तीन एंटीरेट्रोवाइरल दवाओं के संयोजन से एचआईवी -1 संक्रमित मानवकृत चूहों के लिए एक मौखिक सीएआरटी प्रशासन विधि विकसित की गई है। दैनिक इंजेक्शन द्वारा प्रशासन की तुलना में, मौखिक प्रसव का उपयोग करना आसान है, प्रशासन आवृत्ति को सीमित करता है, पशु हैंडलिंग को कम करता है, तनाव को कम करता है, और सुरक्षा में सुधार करताहै। इस बिंदु तक, मानवकृत चूहों24,37,41 में केवल कुछ अध्ययनों ने चूहों के इलाज के लिए कुचल एआरटी दवाओं वाले खाद्य छर्रों का उपयोग किया है। हालांकि, विशेष खाद्य छर्रों के निर्माण तक सीमित पहुंच के कारण इस विधि को व्यापक रूप से लागू करना चुनौतीपूर्ण है। अन्यअध्ययनों में 42,43,44,45,46 ने पीने के पानी को सीएआरटी वितरण प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया है। हालांकि, पीने के पानी में एक दवा को संयोजित करने से सक्रिय अवयवों की स्थिरता, शुद्धता या यहां तक कि शक्ति भी बदल सकती है। इसके अलावा, टीडीएफ, आरएएल और ईएलवी सहित कई एंटीरेट्रोवाइरल दवाएं खराब पानी में घुलनशील हैं। अध्ययनों से पता चला है कि उच्च फैटीभोजन के बाद टीडीएफ की मौखिक जैव उपलब्धता में 40% की वृद्धि हुई थी, यह सुझाव देते हुए कि भोजन द्वारा लाइपेस का प्रतिस्पर्धी निषेध टीडीएफ57 के लिए कुछ सुरक्षा प्रदान कर सकता है। DietGel Boost एक खाद्य पूरक है जो जलयोजन, पोषण और संवर्धन उत्पाद प्रदान करता है जो अनुसंधान जानवरों के समग्र कल्याण में सुधारकरता है। पोषक तत्व-फोर्टिफाइड जेल में अतिरिक्त कार्बोहाइड्रेट, प्रोटीन, वसा, खनिज और इलेक्ट्रोलाइट्स के साथ 25% -30% शुद्ध पानी होता है, और फाइटोएस्ट्रोजेन और नाइट्रोसामाइन58 से मुक्त प्रमाणित होता है। यह मैश आहार58 के लिए एक किफायती, प्रभावी और श्रम-कुशल विकल्प प्रदान करता है। चूंकि कुल वसा का 20.3% बूस्ट कप में शामिल किया गया था, इसलिए हम प्रस्ताव करते हैं कि उच्च पोषक तत्व स्तर टीडीएफ को बेहतर ढंग से भंग कर सकते हैं, और इसलिए इसकी मौखिक जैव उपलब्धता में वृद्धि कर सकते हैं। इसलिए, सीएआरटी दवाओं को वितरित करने के लिए एक उच्च पोषक तत्व खाद्य निलंबन का उपयोग किया गया था ताकि वर्तमान में एचआईवी -1 संक्रमित व्यक्तियों द्वारा उपयोग की जाने वाली सीएआरटी दवाओं के मौखिक वितरण की नकल की जा सके।

चूहों में मनुष्यों की तुलना में उच्च चयापचय होता है, और इस प्रकार, अलग-अलग यौगिकों की खुराक को संदर्भ59 में वर्णित सूत्र द्वारा परिवर्तित और उपयोग किया गया था। आरएएल की 0.4 मिलीग्राम (कुल खुराक), एफटीसी की 0.1 मिलीग्राम (कुल खुराक) और टीडीएफ की 2.14 मिलीग्राम (कुल खुराक) की मानव खुराक को सुधार कारक (किमी, प्रजातियों के औसत शरीर के वजन (किलोग्राम) को उसके शरीर की सतह क्षेत्र (एम2)) से विभाजित करके अनुमानित) के आधार पर परिवर्तित किया गया था ताकि मनुष्यों और चूहों के लिए 37 (किमी) और 3 (किमी) के माउस समकक्ष खुराक मूल्यों का अनुमानलगाया जा सके। क्रमशः। पानी में टीडीएफ, आरएएल और ईएलवी की अपेक्षाकृत कम घुलनशीलता को ध्यान में रखते हुए, डीएमएसओ का उपयोग सीएआरटी दवाओं के लिए विलायक के रूप में किया गया था। मौखिक सीएआरटी भोजन में निहित डीएमएसओ की अंतिम एकाग्रता 0.0059% (v / v) है। डीएमएसओ एकाग्रता बहुत कम है और दवा विलायक 60,61,62,63 के रूप में अपेक्षाकृत सुरक्षित है। महत्वपूर्ण रूप से, इन अध्ययनों में चूहों में कोई फर हानि या व्यवहार में कोई बदलाव नहीं देखा गया था।

ऊपर वर्णित प्रक्रिया एचआईवी -1 संक्रमित मानवकृत चूहों के इलाज के लिए एक अत्यधिक मजबूत और दोहराने योग्य सीएआरटी वितरण विधि है। इस प्रोटोकॉल का आसानी से पालन किया जा सकता है। प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम हैं 1) मानवकृत चूहों के इम्यूनोडेफिशिएंसी पर विचार करते हुए डाइटगेल भोजन से संबंधित प्रोटोकॉल में शामिल किसी भी सामग्री की पूरी प्रक्रिया को बाँझ रखना, और 2) माउस संख्या और समूहों के अनुसार उचित रूप से कई पिघलाव / फ्रीज सीएआरटी स्टॉक समाधान, और एलिकोट सीएआरटी दवाओं से बचने के लिए। आंकड़ों से पता चलता है कि खाद्य कप के भीतर पूर्व-मिश्रित तीन-दवा सीएआरटी (टीडीएफ, एफटीसी, और आरएएल या ईएलवी) का मौखिक प्रशासन कुशलतापूर्वक एचआईवी -1 प्रतिकृति को दबा देता है और उपचार के 4 सप्ताह के भीतर प्लाज्मा में वायरल लोड को अज्ञात स्तर तक कम कर देता है। मौखिक सीएआरटी खाद्य प्रशासन ने न केवल सीडी 4 टी कोशिकाओं में और गिरावट को रोका, बल्कि परिधीय रक्त में सीडी 4 टी सेल प्रतिशत में भी वृद्धि हुई। इसके अलावा, मौखिक सीएआरटी प्रशासन विधि ने दैनिक इंजेक्शन की तुलना में माउस वजन को तेजी से बहाल किया और समग्र स्वास्थ्य में सुधार किया।

महत्वपूर्ण रूप से, इस विधि ने एचआईवी -1 संक्रमित मानवकृत चूहों में सीएआरटी दवाओं के दैनिक इंजेक्शन के दौरान शार्प्स के लिए शोधकर्ता के जोखिम को हटा दिया। प्रस्तावित विधि जो मानवकृत चूहों में एचआईवी -1 आरएनए प्रतिकृति को सफलतापूर्वक दबा देती है, नए इलाज उपचार विकसित करने के लिए पूर्व-नैदानिक प्रमाण-अवधारणा अध्ययनों के लिए अत्यधिक मूल्यवान होगी जो सीएआरटी-उपचारित क्रोनिक एचआईवी -1 संक्रमित व्यक्तियों में दवा वितरण की बारीकी से नकल करते हैं।

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Disclosures

एसके सीडीआर 3 इंक के संस्थापक हैं। शेष लेखक घोषणा करते हैं कि शोध किसी भी वाणिज्यिक या वित्तीय संबंधों की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था जिसे हितों के संभावित टकराव के रूप में माना जा सकता है।

Acknowledgments

हम इस अध्ययन में उपयोग की जाने वाली एंटीरेट्रोवाइरल दवाएं प्रदान करने के लिए डॉ रोमास गेलेज़ियुनस और जेफ मुरी और गिलियड के लोगों को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस कार्य को एनसीआई 1आर01सीए239261-01 (रसोई के लिए), एनआईएच ग्रांट्स पी30एआई28697 (यूसीएलए सीएफएआर वायरोलॉजी कोर, जीन और सेल थेरेपी कोर, और मानवीकृत माउस कोर), यू19एआई149504 (पीआई: किचन एंड चेन), सीआईआरएम डिस्क2-10748, एनआईडीए आर01डीए-52841 (से झेन), एनआईएआईडी आर212000174 (झेन) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। इस काम को यूसीएलए एड्स संस्थान, जेम्स बी पेंडलटन चैरिटेबल ट्रस्ट और मैकार्थी फैमिली फाउंडेशन द्वारा भी समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
60 mm petri dish Thermo Scientific Nunc 150288 For aliquoting ART food
APC anti-human CD8 Antibody Biolegend 344722 For flow cytometry
BD LSRFortessa BD biosciences For flow data collection
CD34 microbeads Miltenyi Biotec 130-046-702 For NSG-BLT mice generation
Centrifuge tubes Falcon 14-432-22 For dissolving ART
DietGel Boost ClearH2O 72-04-5022 For making ART food
Elvitegravir Gilead Gifted from Gilead
Emtricitabine Gilead Gifted from Gilead
FITC anti-human CD3 Antibody Biolegend 317306 For flow cytometry
Flowjo software FlowJo For flow cytometry data analysis
HIV-1 forward primer: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 probe: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′;		 IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 reverse primer: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
Human fetal tissue Advanced Bioscience Resources, Inc
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Pacific Blue anti-human CD45 Biolegend 304022 For flow cytometry
PerCP anti-human CD4 Antibody Biolegend 300528 For flow cytometry
QIAamp Viral RNA Kits Qiagen  52904 For measuring viral load
Raltegravir Merck Gifted from Merck
Sterile cell scrapers Thermo Scientific 179693 For aliquoting ART food
TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit Applied Biosystems 4392653 For plasma viral load detection
Tenofovir disoproxil fumarate Gilead Gifted from Gilead
Trimethoprim-Sulfamethoxazole Pharmaceutical Associates NDC 0121-0854-16 For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains
200 mg Sulfamethoxazole, USP
40 mg Trimethoprim, USP
NMT 0.5% Alcohol

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 188
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Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A., Rezek, V., Martin, H., Lizarraga, M., Kitchen, S. Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice. J. Vis. Exp. (188), e63696, doi:10.3791/63696 (2022).

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