Методы рассечения и гистологический отбор проб сердца на крупных животных моделях сердечно-сосудистых заболеваний

Summary

Из-за сложной анатомии последовательно воспроизводимый протокол вскрытия и сбора для сердечных образцов может быть сложным для реализации. В этой рукописи представлены ключевые элементы некоторых стандартных протоколов рассечения сердца, подчеркивая как подходы к грубому исследованию, так и участки отбора проб, обычно используемые для гистопатологического исследования.

Abstract

Стандартное грубое обследование и отбор проб являются ключевыми элементами воспроизводимости и успешности экспериментальных исследований сердечно-сосудистых заболеваний, проводимых на крупных животных. Учитывая сложную анатомию сердца, межвидовые различия, типы компенсаторных и патологических реакций, последовательные протоколы сложно реализовать. Использование нескольких протоколов вскрытия обычно адаптируется к опыту прозектора, и личные предпочтения продолжают оставаться источником экспериментальной и межнаблюдательной изменчивости. Здесь цель состоит в том, чтобы представить основные анатомические особенности и ориентиры, протоколы вскрытия и гистологические стандарты отбора проб сердца у некоторых часто используемых видов (включая собак, свиней, жвачных животных и кошек) в качестве моделей сердечно-сосудистых заболеваний.

Здесь представлены два стандартных протокола грубой экспертизы. Во-первых, метод притока-оттока, который следует физиологическому направлению кровотока через сердце и крупные сосуды (часто используется у собак, жвачных животных и свиней), и, во-вторых, метод четырехкамерного рассечения (на примере кошек). Оба метода могут быть адаптированы к любому виду в определенных экспериментальных обстоятельствах. Протоколы отбора проб включают все области, представляющие интерес (синоатриальный узел, желудочки, межжелудочковая перегородка, предсердия, клапаны и аорта), и при правильном проведении улучшают как воспроизводимость, так и надежность экспериментальных исследований.

Introduction

Из-за сложной анатомии и ранней строгости, которые могут мешать оценке толщины сердечной стенки, грубое обследование сердца является сложным и подвержено нескольким ошибкам, связанным с техникой или интерпретацией. Это усиливается межвидовыми морфологическими вариациями и тем, что многие клинические, основные сердечные патологии (включая ранние случаи ишемической болезни сердца, фиброза, артериита и амилоидоза) не связаны с какими-либо грубыми изменениями, являясь, по сути, гистологическими патологиями. Стандартизированный протокол вскрытия и гистологического отбора проб может обеспечить согласованность между наблюдателями и, в то же время, сопоставимость и воспроизводимость экспериментальных исследований сердечно-сосудистых заболеваний.

Образцы были взяты у двух собак (Canis lupus familiaris) (3-летний, самец французского бульдога и 8-летняя самка смешанной породы), кошка (Felis catus) (6-летний, самец европейского короткошерстного), домашняя свинья (Sus scrofa domesticus) (1-летний, самец Большой Белый) и корова (Bos taurus) (2-месячная самка Гольштейна). Каждый из выбранных видов имеет особое применение в качестве сердечно-сосудистой модели для различных заболеваний; например, собаки являются предпочтительной моделью для моделирования аритмии; кошки предпочтительны при гипертрофической кардиомиопатии (ГКМП), так как это вид с наибольшей распространенностью ГКМП; свиньи используются в качестве модели при остром инфаркте миокарда; и жвачные животные используются в качестве модели для интоксикации из-за их воздействия токсинов, которые можно легко найти на лугах¹¹.

В этой рукописи представлены один протокол некропсии и два протокола вскрытия сердца, призванные улучшить грубое и гистологическое исследование сердца при экспериментальных сердечно-сосудистых заболеваниях. Описанные протоколы разработаны на основе информации из ветеринарных учебников 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, журнальной литературы ^3,13,14, официальных документов¹⁵ и вебинаров^{16 ,17}. Образцы, использованные в этом исследовании, были собраны из трупов, представленных в отделение патологии USAMV Cluj-Napoca для рутинной диагностики вскрытия.

Protocol

Экспериментальный протокол получил биоэтическое соглашение (No 311 от 2022 года) и был одобрен Комитетом по биоэтике Университета сельскохозяйственных наук и ветеринарной медицины Клуж-Напока, в соответствии как с национальным (Закон No 43 от 2014 года), так и с европейским (Директива ЕС No 63 от 2010 года) законодательством. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах и инструментах, используемых в этом протоколе.

1. Протокол некропсии

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать один и тот же протокол некропсии для всех представленных видов из-за более легкого доступа, когда выполняется ^2,12. Следующие шаги представляют собой некропсию, выполненную у собаки среднего размера. Адаптируйте шаги при выполнении некропсий на разных предметах.

1. Взвесьте предмет и положите его на стол для некропсии с левой стороны (рисунок 1А). Приступают к внешнему осмотру предмета (путем осмотра и пальпации кутиса и слизистых оболочек, отмечая все изменения цвета, консистенции и объема).
2. Используйте нож (или скальпель) и сделайте разрез 7 см в правой подмышечной впадине (рисунок 1А).
3. Определите местонахождение коксофеморального соединения (рисунок 1A,B). Откройте капсулу ножом. Перережьте связку головки бедренной кости (рисунок 1В).
4. Используйте нож для расширения разреза кожи в подмышечной впадине черепа до нижнечелюстного симфиза и каудально до промежности (рисунок 1B).
5. Снимите кожу скальпелем и обнажите грудную и брюшную стенки от вентральной средней линии до уровня поперечных отростков позвонков (рисунок 1В).
6. С помощью скальпеля и щипцов создайте лоскут через брюшную стенку, вентрокудал к правой реберной дуге. Открыть брюшную полость ножницами – следить за каудальным аспектом правого подреберья (рисунок 1В).
7. Вытяните разрез каудально вдоль правой паралюмбальной области до наружного подвздошного гребня. После этого вытяните разрез до лобкового введения linea alba.
8. Вкратце, осмотрите органы брюшной полости in situ (отмечая любые изменения в цвете, консистенции, объеме и положении органов).
9. Скальпелем и щипцами проколоть диафрагму в самой высокой точке (рисунок 1В).
10. Введите в грудную полость, удалив правую грудную клетку с двумя продольными участками с помощью режущих кости щипцов. Срез парастернального хрящевого сегмента ребер. Далее разрезаем спинной сегмент ребер, проксимальный к костовертебральным суставам (рисунок 1С).
11. Осмотрите сердце in situ (рисунок 1С). Обратите внимание на размер, положение, цвет, связи с соседними тканями и при пальпации любые изменения консистенции⁹.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если присутствует тромбоз или врожденный порок сердца, сердце должно быть рассечено in situ (такой подход позволяет полностью обследовать крупные сосуды).
12. Используйте ножницы для осмотра и вскрытия полости перикарда с продольным сечением от основания до вершины сердца. Осмотрите полость перикарда и эпикард (отмечая любые изменения цвета, консистенции и объема)¹².
13. Отпустите сердце ножницами, получив поперечные участки аорты, легочного ствола и обеих вен. Сечение верхней полой вены не менее чем на 1 см выше входа в правое предсердие для сохранения crista terminalis^11,13.
14. Исследуйте внешний контур органа, внешний вид эпикарда, внешний вид миокарда по прозрачности эпикарда и внешний вид крупных сосудов (рисунок 2А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В целом, открытие и исследование перикарда представляют некоторые различия между видами. Обследование полости перикарда начинается с внешнего осмотра и оценки через прозрачность перикарда общего содержания перикарда ^1,2. У кошки или собаки перикард обычно содержит около 0,25 мл/кг тонкой, прозрачной, полупрозрачной до светло-желтой жидкости⁹. При наличии каких-либо патологических выпотов их следует собирать стерильным шприцем или трубкой вакутейнера.

2. Протокол рассечения

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сердца используется несколько техник некропсии, каждая из которых имеет несколько преимуществ. Для этого протокола были выбраны два наиболее часто используемых метода: 1) «метод притока-оттока», который позволяет лучше исследовать клапаны и эндокард и является протоколом, используемым для большинства видов 2,11,12,16, и 2) метод «четырехкамерного рассечения»/«эхокардиографической плоскости», обычно используемый для кошек или собак небольшого размера ^{1, 17}.

1. «Метод притока-оттока» для рассечения сердца 2,11,12,16
   1. Поместите сердце лицевой стороной предсердия вверх (рисунок 2А).
   2. Используйте ножницы и беззубые щипцы, чтобы широко разрезать каудальную полую вену вдоль правого предсердия (рисунок 2B). Продолжайте разрез к правому ушному придатку, чтобы обнажить crista terminalis/синоатриальный узел (узел SA). Осмотрите трехстворчатый клапан с дорсального вида.
   3. Отрежьте участок от правого предсердия до соединения между правым желудочком и межжелудочковой перегородкой (рисунок 2С). Отображение правого атриовентрикулярного клапана.
   4. Срез правого желудочка свободной стенки вдоль межжелудочковой перегородки. Продолжайте сечение до начала легочного ствола (рисунок 2C,D).
   5. Тщательно осмотрите правые атриовентрикулярные клапаны, в том числе хорды tendineae, и сосочковые мышцы (рисунок 2D). Вырежьте хорды tendineae.
   6. Поместите щипцы через легочный ствол и разрежьте ствол продольно (рисунок 2Е). Исследуют легочный тракт оттока, легочное стволовое происхождение и полулунные клапаны.
   7. Отрежьте левое предсердие от легочных вен до кончика левой ушной раковины (рисунок 2F). Осмотрите двустворчатый (митральный) клапан с дорсального вида.
   8. Поместите сердце межжелудочковой перегородкой лицом вниз (рисунок 2F). Сделайте большой разрез в свободной стенке желудочка от основания желудочка до сердечной вершины. Отобразите левый атриовентрикулярный клапан полностью.
   9. Вырежьте хорды сухожилий куспида левого атриовентрикулярного клапана.
   10. Поместите щипцы через отток левого желудочка и используйте его в качестве ориентира для открытия аорты (рисунок 2G).
   11. Используйте солевой раствор для удаления всех тромбов. После удаления всех сгустков крови оцените и сравните сердечную массу с массой тела или стандартными таблицами сердечного веса (таблица 1)^11,13.
   12. Взвесьте сердце.
   13. Если только узел SA является точкой интереса, после обследования левого желудочка поместите все сердце полностью в 10% нейтрально-буферный формалин (NBF) в течение 24 часов и обрежьте правое предсердие для отбора проб crista terminalis.
       ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью этой техники можно легко оценить левый и правый желудочки. Соотношение между толщиной стенки левого и правого желудочков составляет 3:1, с небольшими различиями по видам и породам; для сердца плода животного соотношение составляет 1:1¹².

3. Протокол выборки для гистологии¹⁶

1. С помощью скальпеля сделайте два продольных параллельных разреза (приблизительно на расстоянии 5 мм друг от друга) с участием правого предсердия, трикуспидального клапана и правой стенки желудочка (рисунок 2I)
2. Сделайте два продольных параллельных разреза (примерно на расстоянии 5 мм друг от друга) с участием левого предсердия, митрального клапана, дорсальной сосочковой мышцы и левого желудочка (рисунок 2H).
3. В дорсальной верхней трети сердца поперечное сечение основания сердца следует линии, включая межжелудочковую перегородку, правое предсердие, аорту, аортальный клапан и трехстворчатый клапан (рисунок 2J).
4. Сделайте два продольных параллельных разреза с участием основания аорты и межжелудочковой перегородки (рисунок 2J).
5. Обрежьте правое предсердие вокруг crista terminalis и предоставьте несколько параллельных секций, ориентированных поперечно на продольной оси crista (приблизительно 3-4 мм друг от друга), чтобы получить шесть частей узла SA (рисунок 3, рисунок 4I и рисунок 5H).
6. Обрезать полученные ткани в гистологических кассетах.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый протокол блокировки: шаг 3.1.-гистологический блок 1 (на рисунке 6 показан результирующий слайд из этого блока.), шаг 3.2.-гистологический блок 2 (на рисунке 7 показан результирующий слайд из этого блока), шаг 3.4.-гистологический блок 3 (на рисунке 8 показан результирующий слайд из этого блока), шаг 3.5.-гистологический блок 4 (на рисунке 9 показан полученный слайд из этого блока).
7. Погружайте ткани в 10% NBF в течение не менее 48 ч.

4. Забор коронарных артерий ^3,10,14

1. Используйте щипцы и скальпель для рассечения коронарных артерий от паракональной бороздки сердца (рисунок 4K). Фиксируют коронарную артерию на ночь в 10% NBF.
2. При необходимости достаточно декальцинируйте в смеси 1:1 8% муравьиной кислоты и соляной кислоты.
3. Делайте несколько поперечных разрезов с интервалом 3 мм. Поместите секции в кассету, а затем поместите кассету в 10% NBF до встраивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Свиньи могут быть использованы в качестве сердечной модели для людей, особенно когда речь идет об ишемической болезни сердца. Следовательно, дополнительные пробы и гистологические срезы коронарных артерий рекомендуются ^3,10,14.

5. Техника рассечения сердца «четыре камеры»/«эхокардиографическая плоскость» ^1,17

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод четырехкамерного рассечения состоит из разреза от основания до вершины сердца для получения стандартного вида¹. «Четырехкамерная» методика лучше всего применяется к фиксированным тканям.

1. Поместите все сердце в 10% NBF в течение не менее 48 ч.
2. После того, как сердце фиксируется в 10% NBF в течение не менее 48 ч (рисунок 10A), поместите два беззубых прямых рассеченных щипца, один через черепную полую часть предсердия-трикуспидальный клапан-правый желудочек, а второй через легочную вену-левое предсердие-митральный клапан-левый желудочек (Рисунок 10B).
3. Используйте пространство между щипцами в качестве ориентира для режущего лезвия от основания до вершины сердца (рисунок 10C). Предусмотреть дополнительное продольное сечение приблизительно на расстоянии 5 мм от сечения, описанного на этапе 5.2. на сердечном сегменте, который включает в себя аорту.
4. С помощью поперечного разреза полностью отделить сердечное основание от вершины. Поместите каждый сегмент ткани в гистологическую кассету.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемый протокол блокировки: сердечный верхний гистологический блок 5 (на рисунке 11А показан результирующий слайд из этого блока), сердечный базовый гистологический блок 6 (на фиг.11В показан полученный слайд из этого блока).
5. Поместите кассеты в 10% NBF до встраивания. Зафиксируйте все сердечные образцы в 10% NBF (более чем в 10 раз больше объема ткани), регулярно обрабатывайте их в парафиновом воске, сечении толщиной 4 мкм и окрашивании пятном гематоксилина и эозина (окрашивание H & E) в соответствии с ранее описанным протоколом¹⁰.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При подозрении на миокардит «кусочек свежей сердечной ткани должен быть сохранен в стерильных условиях со стерильным хирургическим материалом и стерильным контейнером для образцов для микробиологических и вирусных исследований»¹³.

6. Фотоматериальная документация

ПРИМЕЧАНИЕ: Фотодокументация является необязательным этапом в экспертизе некропсии. Тем не менее, фотографии и видеозаписи необходимы для того, чтобы иметь «точную документацию нормальной и аномальной анатомии»³.

1. Для надлежащей фотодокументации делайте цифровые снимки при выполнении «прогрессирующей рассечения сердечных тканей»¹³. Обратитесь к руководству по фотографической документации и фотографии¹⁵ общего вида - передний и задний; кусочек сердца; и любые предполагаемые повреждения.

Representative Results

Этот протокол использовался для визуализации анатомических особенностей и сбора образцов для гистологического исследования сердца у четырех различных видов (собака, кошка, свинья и корова). Протокол некропсии повторялся у каждого из вышеупомянутых видов, но проиллюстрирован только у собак. Протокол некропсии начинается с обширного внешнего осмотра тела (рисунок 1А) (включая кожу, исследуемые лимфатические узлы и внешнюю слизистую оболочку), измерения общего веса и оценки общего состояния животного. После внешнего осмотра некропсию продолжают с частичной обшивкой тела (направленной на тщательное обследование подкожной клетчатки и поверхностных мышц) и с вскрытием основных полостей тела (рисунок 1B-D).

Брюшная полость, как правило, исследуется первой (рисунок 1C), за которой следует обширное исследование in situ брюшной полости и органов брюшной полости, за которым следует сечение диафрагмы и, наконец, удаление правого гемиторакса (рисунок 1D). С помощью этой методики может быть достигнуто хорошее исследование in situ торакоабдоминальных органов (включая перикардиальную полость и сердце), одновременно позволяя правильно оценить связи этих органов с местными кровеносными сосудами, лимфатическими путями, связками и нервами. Исследование полости перикарда достигается широким сечением теменного перикарда по продольной оси сердца с последующим удалением сердца путем разрезания крупных сосудов сердца вблизи паренхимы легкого. За внешним осмотром сердца следует рассечение полостей сердца, что позволяет провести обширный осмотр и, наконец, правильный забор образцов тканей для гистопатологии. Вкратце представлены процедура и результаты двух методов рассечения сердца, «кровотока» (рисунок 2, рисунок 3, рисунок 4 и рисунок 5) и «четыре камеры» (рисунок 10).

Метод «кровотока» использовался в сердце собак, свиней и жвачных животных (рисунок 2, рисунок 4 и рисунок 5). После того, как сердце было удалено из тела, наблюдалась внешняя конфигурация (рисунок 2A, рисунок 4A и рисунок 5A). При выполнении рассечения следует заметить конфигурацию предсердий, crista terminalis, которая является макроскопическим элементом идентификации синоатриального узла (рисунок 2B, рисунок 4B и рисунок 5B). После перехода к этапам протокола (рисунок 2B-G, рисунок 4B-G и рисунок 5B-G) рассечение завершено, и можно начать протокол сбора для гистологии (рисунок 2H-J, рисунок 4G-J и рисунок 5H-K). В качестве альтернативы, crista terminalis также может быть собрана после фиксации сердца (рисунок 3) в 10% NBF. По сравнению с собаками, в сердце свиней необходимо провести дополнительный этап – заготовка коронарной артерии (рисунок 4К).

После сбора урожая образцы были зафиксированы в 10% NBF, обычно обработаны и внедрены в парафиновый воск и, наконец, разделены на 4 мкм и окрашены H &E. Гистологические слайды, полученные с помощью этого метода, обычно включают следующее: 1) эпикард, миокард и эндокард правого предсердия и желудочка, трикуспидальный клапан и коронарные артерии для гистологического блока 1 (рисунок 6); 2) эпикард, миокард и эндокард левого предсердия и желудочка, митральный клапан, коронарные артерии и сердечные нервы для гистологического блока 2 (рисунок 7); 3) миокард, эндокард межжелудочковой перегородки и эпикард правого предсердия, а также трехстворчатый клапан для гистологического блока 3 (рисунок 8); 4) множественные срезы от узла SA для гистологического блока 4 (рисунок 9); 5) эпикард, миокард и эндокард верхушки сердца (левый и правый желудочки и межжелудочковая перегородка) для гистологического блока 5 (рисунок 11А); и 6) эпикард, миокард и эндокард основания сердца (левое и правое предсердия, желудочки, межжелудочковая перегородка, атриовентрикулярные клапаны и коронарные артерии) для гистологического блока 6 (рисунок 11B).

Рисунок 1: Техника некропсии у собаки. а) размещение предмета с левой стороны; (B) открытие брюшной полости; (C) открытие грудной полости; (D) обследование грудной полости. 1-7 указывают расположение и порядок рекомендуемых разрезов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Протокол вскрытия и отбора проб в сердце собаки. (А) Внешняя конфигурация сердца; (B) Начните с каудальной полой части и обрежьте правое предсердие, откройте правое предсердие и наблюдайте за crista terminalis; (C) обрезать правый желудочек вдоль соединения с межжелудочковой перегородкой; отображение трехстворчатого клапана; (D) после разрезания chordae tendineae осмотреть правый желудочек и продолжить разрез вдоль паракональной бороздки; (E) пропустить щипцы через легочный ствол и использовать их для направления разреза; исследовать легочный отток; (F) 1 - открыть левое предсердие, 2 - от основания, разрезать до вершины; осмотреть митральный клапан и левый желудочек; (G) пропустить щипцы через аорту и использовать их для направления разреза; исследовать аорту; (H) сделать два разреза вдоль левого сердца и поместить среднюю часть в 10% NBF; (I) сделать два разреза вдоль правого сердца, поместить средний кусок в 10% NBF и обрезать crista terminalis; (J) обрезать основание сердца, сделать два разреза вдоль куска и поместить средний кусок в 10% NBF. Сокращения: SAN = синоатриальный узел; NBF = формалин с нейтральной буферизацией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Выборка crista terminalis из сердце с фиксацией формалина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Протокол вскрытия и отбора проб в сердце свиньи. (А) Внешняя конфигурация сердца; (B) Начните с каудальной полой части и срезайте правое предсердие, осмотрите правое предсердие, найдите crista terminalis и начните открывать правый желудочек; (C) обрезать правый желудочек вдоль соединения с межжелудочковой перегородкой и осмотреть трехстворчатый клапан; (D) после разрезания chordae tendineae осмотреть правый желудочек, поместить щипцы через легочный ствол и использовать их для направления разреза; (E) изучить легочный отток; после разрезания левого предсердия разрезают левый желудочек от основания до вершины; (F) осмотреть митральный клапан и левый желудочек и разрезать chordae tendineae; поместите щипцы через аорту и используйте их для направления разреза; (G) осмотреть аорту, сделать два разреза вдоль левого сердца, поместить средний кусок в 10% NBF; (H) сделать два разреза вдоль правого сердца; поместите среднюю часть в 10% NBF; (I) обрезать crista terminalis, поместить кусок в 10% NBF; (J) обрезать основание сердца, сделать два разреза вдоль куска и поместить средний кусок в 10% NBF; (K) обрезать коронарную артерию, зафиксировать ее на ночь, а затем сделать несколько поперечных разрезов с интервалом 3 мм. Аббревиатура: NBF = нейтрально-буферизованный формалин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Протокол вскрытия и отбора проб в сердце коровы. (А) Внешняя конфигурация сердца; (B) Начните с каудальной полой части и срезайте правое предсердие, осмотрите правое предсердие, найдите crista terminalis и начните открывать правый желудочек; (C) обрезать правый желудочек вдоль соединения с межжелудочковой перегородкой и осмотреть трехстворчатый клапан; (D) продолжать разрез параллельно паракональной канавке, пропускать щипцы через легочный ствол и использовать их для направления разреза; (E) осмотреть легочный отток, начать разрезать легочные вены и левое предсердие, а затем продолжить разрезать левый желудочек от основания до вершины; (F) осмотреть митральный клапан и левый желудочек и разрезать chordae tendineae; (G) пропускать щипцы через аорту, использовать их для направления разреза и исследовать аорту; (H) обрезать crista terminalis и поместить кусок в 10% NBF; (I) сделать два разреза вдоль левого сердца и поместить среднюю часть в 10% NBF; (J) сделать два разреза вдоль правого сердца и поместить среднюю часть в 10% NBF; (K) обрезать основание сердца, сделать два разреза вдоль куска и поместить средний кусок в 10% NBF. Аббревиатура: NBF = нейтрально-буферизованный формалин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Гистологическое исследование правого желудочка, правого предсердия и трикуспидального клапана в сердце собаки. Окрашивание H&E. (A) Гистологический образец правого желудочка, правого предсердия и трикуспидального клапана; (B) правый желудочек, правое предсердие и трикуспидальный клапан. Шкала стержней = 500 мкм; (C) правый желудочек, правое предсердие и коронарные артерии. Шкала стержней = 100 мкм; (D) правое предсердие. Шкала баров = 500 мкм. Аббревиатуры: H&E = гематоксилин и эозин; RV = правый желудочек; РА = правое предсердие; Ts-V = трехстворчатый клапан; CA = коронарная артерия; EnC = эндокард; МС = миокард; EpC = эпикардий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Гистологическое исследование левого желудочка, левого предсердия и митрального клапана в сердце собаки. Окрашивание H&E. (А) гистологический образец левого желудочка, левого предсердия и митрального клапана; (Б) левое предсердие. Шкала стержней = 500 мкм; (C) левое предсердие, левый желудочек, коронарная артерия и нерв. Шкала стержней = 100 мкм; (D) коронарная артерия, нерв. Шкала баров = 50 мкм. Аббревиатуры: H&E = гематоксилин и эозин; LA = левое предсердие; LV = левый желудочек; Mt-V = митральный клапан; CA = коронарная артерия; EnC = эндокард; МС = миокард; EpC = эпикард; NV = нерв. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Гистологическое исследование межжелудочковой перегородки, правого предсердия и трикуспидального клапана в сердце собаки. Окрашивание H&E (A) Межжелудочковая перегородка, правое предсердие и трикуспидальный клапанно-гистологический образец; (B) межжелудочковая перегородка, правое предсердие и трикуспидальный клапан. Шкала баров = 500 мкм. Аббревиатуры: H&E = гематоксилин и эозин; IVS = межжелудочковая перегородка; РА = правое предсердие; Ts-V трехстворчатый клапан. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9: Гистологическое исследование синоатриального узла в сердце собаки. Окрашивание H&E. (A) Гистологический образец crista terminalis; (B) синоатриальный узел 4x увеличение. Шкала стержней = 500 мкм; (C) синоатриальный узел 20-кратное увеличение. Шкала стержней = 100 мкм; (D) синоатриальный узел 40-кратное увеличение. Шкала баров = 50 мкм. Аббревиатуры: H&E = гематоксилин и эозин; Узел SA = синоатриальный узел. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 10: Протокол рассечения на формалин-фиксированном сердце кошки. (А) Внешняя конфигурация сердца; (B) пропускают щипцы через черепно-мозговые полые и легочные вены; щипцы направляют продольное сечение от основания до вершины; (C) четырехкамерный вид после разреза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 11: Гистологические образцы сердца кошки. Окрашивание H&E. (A) Вершина сердечно-гистологического образца; (B) основание сердечно-гистологического образца. Сокращения: H&E = гематоксилин и эозин; LV = левый желудочек; IVS = межжелудочковая перегородка; RV = правый желудочек; LA = левое предсердие; MV = митральный клапан; TS-V = трехстворчатый клапан; РА = правое предсердие. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Вид	Возраст	Среднее %BW	(LV + S)/RV	Номера ссылок
Кошка	Новорожденный	0.77%	-	7
Кошка	Взрослый	0.33%-0.46%	2.94-4.17	8, 5, 11
Собака	Новорожденный	0.47%-0.76%	-	8, 7
Собака	Взрослый	0.70%-0.85%	2.39-5.12	8, 6, 11
Свинья	Взрослый	0.32%-0.48%	2.38-3.84	11
Овца	Взрослый	0.17%-0.65%	2.63-4.54	11
Корова	Взрослый	0.30%-0.66%	2.43-4.00	11

Таблица 1: Справочные значения для нормального соотношения массы сердца к массе тела и соотношения желудочков у животных. Кардиологические измерения для кошки, собаки, свиньи, овцы и коровы. Сокращения: BW = масса тела; LV = левый желудочек; S = межжелудочковая перегородка; RV = правый желудочек.

Discussion

При выполнении текущего протокола следует тщательно рассмотреть несколько критических шагов для получения последовательных результатов. У молодых животных сердечные измерения отличаются от измерений у взрослых (включая толщину стенки желудочков), и, как правило, сердце представляет большую долю массы тела^11,12. Степень гипертрофии желудочков можно количественно определить, применив общую весовую формулу, соотношение между левым желудочком и перегородкой делится на свободный вес правого желудочка, который в нормальных условиях должен составлять 2,8-4,0 у зрелых животных (табл. 1). Если это соотношение превышает 4,0, это указывает на гипертрофию левого желудочка, а если оно меньше 2,8, то указывает на гипертрофию правого желудочка ^4,11,12. Для получения значения камеры свободную стенку правого желудочка необходимо рассечь вдоль межжелудочковой стенки и отделить коронарную бороздку от правого предсердия. Рассечение левого желудочка из левого предсердия производится в атриовентрикулярном кольце⁴.

Сердце отделяется от тела путем разрезания крупных сосудов. Если участки крупных сосудов находятся слишком близко к основанию сердца, могут быть скомпрометированы несколько структур, в основном предсердия и ушные раковины. Чтобы облегчить процесс, необходимо осторожно потянуть сердце вентрально, чтобы правильно разделить крупные сосуды над основанием сердца. Вторым критическим шагом является распознавание морфологии crista terminalis, которая представляет собой дискретную анатомическую структуру, требующую детального структурного знания сердца. Узел SA должен быть тщательно собран и внедрен с особым вниманием к расположению образцов ткани внутри блоков во время гистологического процесса.

Модификация «четырехкамерной» методики заключалась в изменении схемы гистологической блокировки с одного блока на два. Стандартные размеры широко используемых гистологических кассет и адаптированная гистологическая процедура (включая ротационную станцию окрашивания микротомов) не подходят для размещения всего отдела сердца в одном блоке без искажения тканей. Хотя «четырехкамерная» методика облегчает исследование структуры камер сердца, она ограничивает исследование проводящей системы. Это особенно важно в тех случаях, когда задокументирована сердечная аритмия. Кроме того, учитывая, что «четырехкамерный» метод требует ткани, зафиксированной в NBF, несколько дополнительных исследований, таких как бактериология и молекулярная биология, могут быть в определенной степени скомпрометированы.

Когда речь идет о сердце кошки или собаки небольшого размера, на фиксированной ткани получается точный стандартный эхокардиографический план. Четырехкамерный вид полезен, особенно для размеров камеры, если есть различия в размерах желудочков или предсердий¹. В дополнение к преимуществам, связанным с идеальной суперпозицией брутто-обрезки, с теми, которые получены при клиническом обследовании эхокардиографией, эта методика представляет собой преимущество включения большинства ключевых компонентов сердца только в два гистологических блока.

Метод «приток-отток», описанный у свиней, был адаптирован из протоколов, используемых в сердцах людей, путем добавления этапа отбора проб коронарной артерии. Описанные в настоящее время протоколы рассечения сердца иллюстрируют стандартные точки для отбора проб. Кроме того, когда диссектор наблюдает или подозревает другие поражения, помимо тех, которые охватываются протоколом, дополнительные образцы должны быть собраны из областей, представляющих интерес.

При разработке существующих протоколов были изучены другие методы, такие как метод, включающий начальный продольный срез основных сердечных кривых¹² и метод «хлебной буханки»/короткоосевой техники ^9,11. Метод, включающий продольный срез основных сердечных кривых, является более простым протоколом, часто используемым в биомедицинском образовании¹². Техника короткоосевого сечения («техника хлебной буханки») может быть выполнена с одним коротким осевым сечением¹¹ или серией секций толщиной 1-2 см от вершины к основанию, оставляя атриовентрикулярный аппарат нетронутым⁹. Данная методика является наиболее подходящей, если диссектор подозревает патологии миокарда (в том числе воспалительные патологии и кардиомиопатии), но имеет недостаток поверхностного обследования клапанных компонентов⁹.

Обе эти техники легко осваиваются людьми с относительно базовыми знаниями анатомии сердца, но не имеют надежных точек для гистологической выборки и взвешивания каждого сердечного компонента. После продолжения этих методов последующая процедура уборки предполагает кропотливую работу по выявлению интересующих областей и получению постоянных образцов. На сердцах, рассеченных с помощью этих методов, раздельное взвешивание двух половинок требует усилий, чтобы иметь возможность рассчитать соотношение между ними. Метод короткой оси нуждается в дополнительных шагах по исследованию эндокарда и всех компонентов, расположенных у основания сердца. Кроме того, процедура сбора урожая по этим методам состоит из кропотливой работы по выявлению интересующих областей и получению постоянных образцов.

В этой рукописи представлены ключевые элементы некоторых стандартных протоколов рассечения сердца, подчеркивая как подходы к грубому исследованию, так и участки отбора проб, обычно используемые для гистопатологического исследования. Что касается будущего применения метода, основная цель представленного протокола состоит в том, чтобы предложить надежное руководство для рассечения сердца, которое может быть легко использовано во всех экспериментальных исследованиях, требующих детальной оценки сердца.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% saline solution	B. BRAUN MELSUNGEN AG	W04479004	For washing all the blood, and blood clots from the heart.
10% neutral buffered formalin (NBF)	Q Path	11699404	Materials for collecting histopathology samples.
Bone cutting forceps	HELEN SRL	LS109HV	Sturdy instrument for cutting bone.
Cutting board	Ambition	86304	For an easier manipulation, and cutting the organs.
Decalcifying solution	Thermo Scientific TBD-2	6764004	1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid.
Digital camera	Canon Inc.	PowerShot SX540 HS	For photographic, and videographic documentation.
Forceps	MKD-Medicale	15-430	Dissection instruments.
Histological cassettes	Q Path	720-2215	Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm
Knife	TEHNO FOOD COM SERV SRL	D2006/15	Sharp blade for cutting soft tissue.
Latex gloves	MKD-Medicale	SANTEX-S	Protection equipment.
Mask	MKD-Medicale	21221	Protection equipment.
Petri dishes	MKD-Medicale	0598-1V	Materials for collecting ancillary testing samples.
Plastic recipients	Corning Gosselin	TP200-02	Materials for collecting histopathology samples.
Scale	ESPERANZA	MEEKS008	For weighing the organs.
Scale	White Deals	72	For weighing the subjects.
Scalpel	MKD-Medicale	10322E	Sharp blade for cutting soft tissue.
Scissors	MKD-Medicale	13-260	Dissection instruments.
Scrub	MKD-Medicale	410100-52	Protection equipment.
Syringes	MKD-Medicale	10573EU	Materials for collecting ancillary testing samples.