Summary
בשל האנטומיה המורכבת, פרוטוקול דיסקציה וקציר הניתן לשחזור עקבי עבור דגימות לב יכול להיות מאתגר ליישום. כתב יד זה מציג את המרכיבים המרכזיים של כמה פרוטוקולים סטנדרטיים של דיסקציה לבבית, המדגישים הן את גישות הבדיקה הגסה והן את אתרי הדגימה המשמשים בדרך כלל לבדיקה היסטופתולוגית.
Abstract
הבדיקה והדגימה ברוטו הסטנדרטיים הם מרכיבים מרכזיים בשכפול ובהצלחה של מחקרים ניסיוניים במחלות לב וכלי דם שבוצעו בבעלי חיים גדולים. בהתחשב באנטומיה המורכבת של הלב, ההבדלים הבין-מיניים וסוגי התגובות המפצות והפתולוגיות, פרוטוקולים עקביים מאתגרים ליישום. השימוש בפרוטוקולי דיסקציה מרובים מותאם בדרך כלל לניסיונו של הפרוסקט, והעדפה אישית ממשיכה להיות מקור לשונות ניסיונית ובין-תחומית. כאן, המטרה היא להציג את המאפיינים האנטומיים העיקריים וציוני דרך, פרוטוקולי דיסקציה ותקני דגימה היסטולוגיים של הלב בכמה מינים נפוצים (כולל כלבים, חזירים, רועים וחתולים) כמודלים של מחלות לב וכלי דם.
שני פרוטוקולי בדיקה ברוטו סטנדרטיים מוצגים כאן. ראשית, שיטת הזרימה-החוצה, העוקבת אחר כיוון זרימת הדם הפיזיולוגי דרך הלב וכלי הדם הגדולים (המשמשת לעתים קרובות בכלבים, רועים וחזירים), ושנית, טכניקת הדיסקציה בת ארבעת התאים (המודגמת בחתולים). שתי הטכניקות יכולות להיות מותאמות לכל מין בנסיבות ניסיוניות מסוימות. פרוטוקולי הדגימה כוללים את כל תחומי העניין (צומת סינואטריאלי, חדרים, מחיצה בין-חדרית, אטריה, שסתומים ואבי העורקים), ואם הם מבוצעים כראוי, משפרים הן את יכולת השכפול והן את האמינות של מחקרים ניסיוניים.
Introduction
בשל האנטומיה המורכבת והקפדנות המוקדמת, שעלולות להפריע להערכת עובי דופן הלב, הבדיקה הגסה של הלב מאתגרת ונוטה למספר טעויות טכניות או פרשנות. זה מוגבר על ידי וריאציות מורפולוגיות interspecific ועל ידי העובדה כי פתולוגיות לב קליניות, גדולות רבות (כולל מקרים מוקדמים של מחלות לב כליליות, פיברוזיס, דלקת עורקים, עמילואידוזיס) אינם קשורים לכל שינוי גס, להיות, למעשה, פתולוגיות היסטולוגיות. דיסקציה מתוקננת ופרוטוקול קצירת דגימות היסטולוגית יכולים להביא עקביות בין משקיפים, ובמקביל, השוואה ושכפול של מחקרים ניסיוניים של מחלות לב וכלי דם.
הדגימות נאספו משני כלבים (Canis lupus familiaris) (בולדוג צרפתי זכר בן 3, ונקבה מעורבת בת 8), חתול (Felis catus) (ילד בן 6, זכר אירופי קצר שיער), חזיר בית (Sus scrofa domesticus) (בן שנה, זכר לבן גדול) ופרה (שור בוס) (בן חודשיים, נקבת הולשטיין). לכל אחד מהמינים הנבחרים יש שימוש מיוחד כמודל קרדיווסקולרי למחלה אחרת; לדוגמה, כלבים הם מודל מועדף למודלים של הפרעות קצב; חתולים מועדפים לקרדיומיופתיה היפרטרופית (HCM), שכן זהו המין עם השכיחות הגבוהה ביותר של HCM; חזירים משמשים מודל לאוטם שריר הלב חריף; ו ruminants משמשים כמודל לשכרות בשל חשיפתם לרעלים שניתן למצוא בקלות על כרי דשא11.
בכתב יד זה מוצגים פרוטוקול נמק אחד ושני פרוטוקולי דיסקציה של הלב, שנועדו לשפר את הבדיקה הגסה וההיסטולוגית של הלב במחלות לב וכלי דם ניסיוניות. הפרוטוקולים המתוארים פותחו על סמך מידע מספרי לימוד וטרינריים 1,2,4,5,6,7,8,9,10,11,12, ספרות כתבי עת 3,13,14, מסמכים רשמיים 15 וסמינרים מקוונים 16 ,17. הדגימות ששימשו במחקר זה נקטפו מ-cadavers שהוגשו למחלקת הפתולוגיה של USAMV Cluj-Napoca לאבחון שגרתי של נתיחה שלאחר המוות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול הניסוי קיבל הסכמה ביו-אתית (מס '311 משנת 2022) ואושר על ידי ועדת הביואתיקה של האוניברסיטה למדעי החקלאות והרפואה הווטרינרית קלוז'-נאפוקה, בהתאם הן לחקיקה הלאומית (חוק מס '43 משנת 2014) והן האירופית (הנחיית האיחוד האירופי מס' 63 משנת 2010). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. פרוטוקול נמק
הערה: מומלץ להשתמש באותו פרוטוקול נמק עבור כל המינים המוצגים בשל גישה קלה יותר אליו כאשר הוא מבוצע 2,12. השלבים הבאים מייצגים את הנמק המבוצע בכלב בגודל בינוני. התאם את השלבים בעת ביצוע נמק בנושאים שונים.
- שקלו את הנושא והניחו אותו על שולחן הנמק בצדו השמאלי (איור 1A). המשך לבדיקה החיצונית של הנושא (על ידי בדיקה ומישוש של cutis ו רירית, תוך ציון כל השינויים בצבע, עקביות, ונפח).
- השתמשו בסכין (או באזמל) ובצעו חתך של 7 ס"מ בבית השחי הימני (איור 1A).
- אתרו את הצומת הקוקסו-פמורלי (איור 1A,B). פתחו את הקפסולה בסכין. חותכים את הרצועה של ראש עצם הירך (איור 1B).
- השתמשו בסכין כדי להרחיב את חתך העור בבית השחי לסימפיזה המנדיבולרית ובאופן קאודלי לפרינאום (איור 1B).
- הסר את העור עם האזמל וחשוף את דופן בית החזה והבטן מקו האמצע הגחוני לרמה של תהליכים רוחביים בחוליות (איור 1B).
- עם האזמל והמלקחיים, ליצור דש דרך דופן הבטן, ventrocaudal לקשת costal ימין. פתחו את חלל הבטן בעזרת מספריים – עקבו אחר ההיבט הקאודאלי של ההיפוכונדריה הימנית (איור 1B).
- מרחיבים את החתך לאורך אזור הפראלומבר הימני עד לפסגה האיליאק החיצונית. לאחר מכן, להאריך את החתך עד החדרת הערווה של לינאה אלבה.
- בקצרה, לבחון את איברי הבטן באתרם (על ידי ציון כל השינויים בצבע, עקביות, נפח, ומיקום של האיברים).
- בעזרת האזמל והמלקחיים, נקבו את הסרעפת בנקודה הגבוהה ביותר (איור 1B).
- הזן את חלל החזה על ידי הסרת כלוב הצלעות הימני עם שני חלקים אורכיים באמצעות מלקחיים חיתוך עצם. חתך את הקטע הסחוסי parasternal של הצלעות. לאחר מכן, חתכו את המקטע הגבי של הצלעות, פרוקסימלי למפרקים הקוסטוברטליים (איור 1C).
- בחנו את הלב באתרו (איור 1C). שימו לב לגודל, למיקום, לצבע, לקשרים עם הרקמות הסמוכות, ועל ידי מישוש, כל שינוי בעקביות9.
הערה: אם קיימת פקקת או מחלת לב מולדת, יש לנתח את הלב באתרו (גישה זו מאפשרת בדיקה מלאה של כלי הדם הגדולים). - השתמש מספריים כדי לבחון ולפתוח את חלל קרום הלב עם חתך אורך מהבסיס אל קצה הלב. יש לבחון את חלל קרום הלב ואת האפיקרדיום (תוך שימת לב לשינויים בצבע, בעקביות ובנפח)12.
- שחררו את הלב עם מספריים, מניבים חלקים רוחביים של אבי העורקים, תא המטען הריאתי, ושני הוורידים. חותכים את הווריד הנבוב העליון לפחות 1 ס"מ מעל הכניסה לאטריום הימני כדי לשמר את crista terminalis11,13.
- בחנו את קווי המתאר החיצוניים של האיבר, את הופעת האפיקרדיום, את הופעת שריר הלב על ידי שקיפות האפיקרדיום ואת המראה החיצוני של כלי הדם הגדולים (איור 2A).
הערה: באופן כללי, הפתיחה והבדיקה של קרום הלב מציגות כמה הבדלים בין המינים. בדיקת חלל קרום הלב מתחילה בבדיקה והערכה חיצונית באמצעות שקיפות קרום הלב של התוכן הכולל של קרום הלב 1,2. אצל חתול או כלב, קרום הלב מכיל בדרך כלל כ-0.25 מ"ל/ק"ג של נוזל דק, צלול, שקוף עד צהוב בהיר9. אם יש כל effusions פתולוגי, הם צריכים להיאסף עם מזרק סטרילי או צינור vacutainer.
2. פרוטוקול דיסקציה
הערה: מספר טכניקות נמק משמשות ללב, שלכל אחת מהן מספר יתרונות. עבור פרוטוקול זה נבחרו שתיים מהטכניקות הנפוצות ביותר: 1) "שיטת הזרימה-החוצה", המאפשרת בדיקה טובה יותר של השסתומים והאנדוקרדיום והיא פרוטוקול המשמש את רוב המינים 2,11,12,16, ו-2) טכניקת "דיסקציה של ארבעה תאים"/"מישור אקוקרדיוגרפי", המשמשת בדרך כלל לחתולים או לכלבים קטנים1, 17.
- "שיטת זרימה יוצאת" לנתיחה לבבית 2,11,12,16
- מקמו את הלב עם פני הפרוזדור כלפי מעלה (איור 2A).
- השתמשו במספריים ובמלקחיים חסרי שיניים כדי לחתוך באופן נרחב מהווריד הנבוב הקאודאלי אל האטריום הימני (איור 2B). המשך את החתך לתוספת האוריקולרית הימנית כדי לחשוף את צומת crista terminalis/sinoatrial (צומת SA). בדוק את שסתום tricuspid מן הנוף הגבי.
- חתכו מקטע מהאטריום הימני עד לצומת שבין החדר הימני למחיצת הבין-חדרית (איור 2C). הצג את השסתום האטריובנטריקולרי הימני.
- חתך את הקיר החופשי של החדר הימני לאורך המחיצה הבין-חדרית. המשיכו את המקטע עד למקור הגזע הריאתי (איור 2C,D).
- בחנו ביסודיות את השסתומים האטריו-ונטריולריים הימניים, כולל הגידים הכורדיים, ואת השרירים הפפילריים (איור 2D). חותכים את הקורדייה.
- הניחו מלקחיים דרך תא המטען הריאתי וחתכו את תא המטען לאורכו (איור 2E). לבחון את דרכי היציאה הריאתיות, את מקור תא המטען הריאתי ואת השסתומים החצי-לונאריים.
- חתכו את האטריום השמאלי מהוורידים הריאתיים לקצה האוריקל השמאלי (איור 2F). בדוק את המסתם הביקוספיד (המיטרלי) מהראייה הגבית.
- הניחו את הלב כאשר המחיצה הבין-חדרית פונה כלפי מטה (איור 2F). בצע חתך גדול בדופן החופשית של החדר מבסיס החדר ועד לקצה הלב. הצג את השסתום האטריובנטריקולרי השמאלי לחלוטין.
- חותכים את גיד המיתרים של סף השסתום האטריובנטריקולרי השמאלי.
- הניחו מלקחיים דרך מערכת היציאה של החדר השמאלי והשתמשו בה כהנחיה לפתיחת אבי העורקים (איור 2G).
- השתמש בתמיסת מלח כדי להסיר את כל קרישי הדם. לאחר הסרת כל קרישי הדם, הערך והשווה את משקל הלב מול מסת הגוף או טבלאות משקל לב סטנדרטיות (טבלה 1)11,13.
- שוקלים את הלב.
- אם רק צומת ה-SA הוא נקודת העניין, לאחר בדיקת החדר השמאלי, מקם את כל הלב כולו ב-10% פורמלין בעל מאגר נייטרלי (NBF) למשך 24 שעות, וחתוך את האטריום הימני כדי לדגום את ה-crista terminalis.
הערה: בטכניקה זו, ניתן להעריך בקלות את החדרים השמאלי והימני. היחס בין עובי דופן החדר השמאלי והימני הוא 3:1, עם הבדלים קטנים לפי מינים וגזע; עבור לב העובר החייתי, היחס הוא 1:112.
3. פרוטוקול דגימה להיסטולוגיה16
- בעזרת אזמל, בצעו שני חתכים אורכיים מקבילים (במרחק של כ-5 מ"מ זה מזה) המערבים את האטריום הימני, את המסתם הטריקוספיד ואת הדופן החופשית של החדר הימני (איור 2I)
- בצעו שני חתכים מקבילים אורכיים (במרחק של כ-5 מ"מ זה מזה) המערבים את האטריום השמאלי, המסתם המיטרלי, השריר הפפילרי הגבי והחדר השמאלי (איור 2H).
- בתוך השליש העליון הגבי של הלב, חתך רוחבי את בסיס הלב בעקבות קו, כולל המחיצה הבין-חדרית, האטריום הימני, אבי העורקים, המסתם האאורטלי והמסתם הטריקוספידי (איור 2J).
- צרו שני חתכים מקבילים אורכיים המערבים את בסיס אבי העורקים ואת המחיצה הבין-חדרית (איור 2J).
- חתכו את האטריום הימני סביב ה-crista terminalis , וספקו מספר מקטעים מקבילים המכוונים באופן רוחבי על ציר האורך של הקריסטה (במרחק של כ-3-4 מ"מ זה מזה) כדי לקבל שש חתיכות של צומת ה-SA (איור 3, איור 4I ואיור 5H).
- לקצץ את הרקמות המתקבלות בקלטות היסטולוגיות.
הערה: פרוטוקול חסימה מומלץ: שלב 3.1.-בלוק היסטולוגי 1 (איור 6 מציג את השקופית המתקבלת מבלוק זה.), שלב 3.2.-בלוק היסטולוגי 2 (איור 7 מציג את השקופית המתקבלת מבלוק זה), שלב 3.4.-בלוק היסטולוגי 3 (איור 8 מציג את השקופית המתקבלת מבלוק זה), שלב 3.5.-בלוק היסטולוגי 4 (איור 9 מציג את השקופית המתקבלת מבלוק זה). - לטבול את הרקמות ב 10% NBF במשך 48 שעות לפחות.
4. דגימת עורקים כליליים 3,10,14
- השתמשו במלקחיים ובאזמל כדי לנתח את העורקים הכליליים מהחריץ הפרה-קונלי הלבבי (איור 4K). לתקן את העורק הכלילי לילה ב 10% NBF.
- במידת הצורך, יש להסיר את החישוב כראוי בתערובת של 1:1 של 8% חומצה פורמית וחומצה הידרוכלורית.
- בצע חתכים רוחביים מרובים במרווחים של 3 מ"מ. מניחים את החלקים בקלטת ולאחר מכן מכניסים את הקלטת ל-10% NBF עד להטמעה.
הערה: חזירים יכולים לשמש כמודל לב לבני אדם, במיוחד כשמדובר במחלת לב כלילית. לפיכך, דגימות משלימות ומקטעים היסטולוגיים של עורקים כליליים מומלצים 3,10,14.
5. טכניקת כריתת "ארבעת החדרים"/"מישור אקוקרדיוגרפי" של הלב 1,17
הערה: טכניקת הדיסקציה בת ארבעת התאים מורכבת מחתך מהבסיס אל קצה הלב כדי לקבל את התצוגה הסטנדרטית1. טכניקת "ארבעה תאים" מיושמת בצורה הטובה ביותר על רקמות קבועות.
- הכניסו את כל הלב ל-10% NBF למשך 48 שעות לפחות.
- לאחר שהלב מקובע ב-10% NBF במשך 48 שעות לפחות (איור 10A), הניחו שני מלקחיים ישרים חסרי שיניים, אחד דרך האטריום-אטריום-טריקוספיד השסתום הימני של הגולגולת, והשני דרך הווריד הריאתי-אטריום-מסתם מיטרלי-מיטרלי-חדר שמאלי (איור 10B).
- השתמשו ברווח שבין זרועות המלקחיים כהנחיה ללהב החיתוך מהבסיס ועד לקצה הלב (איור 10C). ספק מקטע אורך נוסף במרחק של כ-5 מ"מ מהמקטע המתואר בשלב 5.2. על קטע הלב, הכולל את אבי העורקים.
- עם חתך רוחבי, להפריד לחלוטין את בסיס הלב מן apex. מניחים כל מקטע רקמה בקלטת היסטולוגית.
הערה: פרוטוקול חסימה מומלץ: הבלוק ההיסטולוגי הלבבי 5 (איור 11A מראה את השקופית המתקבלת מבלוק זה), הבלוק ההיסטולוגי של בסיס הלב 6 (איור 11B מציג את השקופית המתקבלת מבלוק זה). - מניחים את הקסטות ב-10% NBF עד להטמעה. לתקן את כל דגימות הלב ב 10% NBF (יותר מ 10 פעמים נפח של רקמה), לעבד אותם באופן שגרתי בשעוות פרפין, חתך בעובי 4 מיקרומטר, וכתם עם כתם hematoxylin ו eosin (כתם H&E) בעקבות פרוטוקול10 שתואר קודם לכן.
הערה: אם יש חשד לדלקת שריר הלב, "יש לשמור על פיסת רקמת לב טרייה בתנאים סטריליים עם חומר כירורגי סטרילי ומיכל דגימה סטרילי למחקרים מיקרוביולוגיים ונגיפיים"13.
6. תיעוד מצולם
הערה: תיעוד הצילום הוא שלב אופציונלי בבדיקת נמק. עם זאת, צילום והקלטות וידאו חיוניים כדי שיהיה "תיעוד מדויק של אנטומיה נורמלית ולא תקינה"3.
- לתיעוד צילומי נכון, צלמו תמונות דיגיטליות תוך ביצוע "דיסקציה מתקדמת של רקמות הלב"13. עיין בהנחיות לתיעוד צילומי ותצלום15 מבט כללי קדמי ואחורי; פרוסת הלב; וכל הנגעים החשודים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה שימש להדמיית תכונות אנטומיות ולאיסוף דגימות לבדיקה היסטולוגית של הלב בארבעה מינים שונים (כלב, חתול, חזיר ופרה). פרוטוקול הנמק חזר על עצמו בכל אחד מהמינים שהוזכרו לעיל, אך הומחש רק בכלבים. פרוטוקול הנמק מתחיל בבדיקה חיצונית מקיפה של הגוף (איור 1A) (כולל העור, בלוטות הלימפה הניתנות לבדיקה והרירית החיצונית), מדידת המשקל הכולל, וניקוד המצב הכללי של החיה. לאחר הבדיקה החיצונית, הנמק ממשיך עם מעטפת חלקית של הגוף (מכוונת לבדיקה יסודית של השרירים התת-קרקעיים והשטחיים) ועם פתיחת חללי הגוף העיקריים (איור 1B-D).
חלל הבטן הוא בדרך כלל הראשון שנבדק (איור 1C), לאחר מכן בדיקה מקיפה באתרה של חלל הצפק ואיברי הבטן, לאחר מכן חתך של הסרעפת, ולבסוף הסרת ההמיטורקס הימני (איור 1D). בטכניקה זו, ניתן להשיג בדיקה טובה באתרה של איברי בית החזה (כולל חלל קרום הלב והלב), ובמקביל לאפשר הערכה נכונה של הקשרים של איברים אלה עם כלי הדם המקומיים, הלימפה, הרצועות והעצבים. הבדיקה של חלל קרום הלב מושגת על ידי חתך רחב של קרום הלב הקודקודי בעקבות ציר האורך של הלב, ואחריו הסרת הלב על ידי חתך כלי הדם הגדולים של הלב קרוב לפרנכימה הריאה. הבדיקה החיצונית של הלב מלווה בחיתוך חללי הלב, המאפשרת בדיקה מקיפה, ולבסוף, קציר נכון של דגימות הרקמה להיסטופתולוגיה. בקצרה מוצגים ההליך והתוצאות של שתי טכניקות ניתוח הלב, "זרימת הדם" (איור 2, איור 3, איור 4 ואיור 5) ו"ארבעת החדרים" (איור 10).
טכניקת "זרימת הדם" שימשה בלבם של כלבים, חזירים ורועים (איור 2, איור 4 ואיור 5). לאחר שהלב הוסר מהגוף, נצפתה התצורה החיצונית (איור 2A, איור 4A ואיור 5A). בעת ביצוע הדיסקציה, יש להבחין בתצורת הפרוזדורים, ה-crista terminalis, שהיא האלמנט המאקרוסקופי של הזיהוי עבור הצומת הסינואטריאלי (איור 2B, איור 4B ואיור 5B). לאחר המשך שלבי הפרוטוקול (איור 2B-G, איור 4B-G ואיור 5B-G), הדיסקציה הושלמה, וניתן להתחיל בפרוטוקול הקציר של ההיסטולוגיה (איור 2H-J, איור 4G-J ואיור 5H-K). לחלופין, ניתן גם לקצור את ה-crista terminalis לאחר קיבוע הלב (איור 3) ב-10% NBF. בהשוואה לכלבים, יש שלב נוסף שיש לבצע בלב החזירים - בציר העורק הכלילי (איור 4K).
לאחר הקציר, הדגימות תוקנו ב-10% NBF, עובדו באופן שגרתי והוטמעו בשעוות פרפין, ולבסוף נחתכו ב-4 מיקרומטר, והוכתמו על ידי H&E. השקופיות ההיסטולוגיות המתקבלות בטכניקה זו כוללות בדרך כלל את הדברים הבאים: 1) האפיקרדיום, שריר הלב והאנדוקרדיום של האטריום והחדר הימניים, המסתם הטריקוספיד והעורקים הכליליים עבור בלוק היסטולוגי 1 (איור 6); 2) האפיקרדיום, שריר הלב והאנדוקרדיום של האטריום והחדר השמאליים, המסתם המיטרלי, העורקים הכליליים ועצבי הלב לבלוק היסטולוגי 2 (איור 7); 3) שריר הלב, האנדוקרדיום של המחיצה הבין-חדרית, והאפיקרדיום של האטריום הימני, והשסתום הטריקוספידי לבלוק היסטולוגי 3 (איור 8); 4) מקטעים מרובים מצומת SA עבור בלוק היסטולוגי 4 (איור 9); 5) האפיקרדיום, שריר הלב והאנדוקרדיום של קצה הלב (חדרים שמאליים וימניים ומחיצת ביניים) עבור בלוק היסטולוגי 5 (איור 11A); ו-6) האפיקרדיום, שריר הלב והאנדוקרדיום של בסיס הלב (אטריה שמאלית וימנית, חדרים, מחיצה בין-חדרית, מסתמים אטריו-ונטרקולריים ועורקים כליליים) עבור בלוק היסטולוגי 6 (איור 11B).
איור 1: טכניקת נמק אצל כלב. (א) מיקום הנושא בצד שמאל; (B) פתיחת חלל הבטן; (ג) פתיחת חלל בית החזה; (D) בדיקת חלל בית החזה. 1-7 מציינים את מיקומם וסדרם של החתכים המומלצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: פרוטוקול דיסקציה ודגימה בלב הכלב. (A) תצורה חיצונית של הלב; (B) להתחיל מהקאווה הקאודלית ולחתוך את האטריום הימני, לפתוח את האטריום הימני ולהתבונן ב-crista terminalis; (C) לחתוך את החדר הימני לאורך הצומת עם המחיצה הבין-חדרית; להציג את שסתום tricuspid; (D) לאחר חיתוך ה-chordae tendineae, יש לבחון את החדר הימני ולהמשיך את החתך לאורך החריץ הפרקונלי; (ה) להעביר את המלקחיים דרך תא המטען הריאתי ולהשתמש בהם כדי להנחות את החתך; לבחון את היציאה הריאתית; (F) 1-לפתוח את האטריום השמאלי, 2-מהבסיס, לחתוך אל הפסגה; לבחון את המסתם המיטרלי ואת החדר השמאלי; (ז) להעביר את המלקחיים דרך אבי העורקים ולהשתמש בהם כדי להנחות את החתך; לבחון את אבי העורקים; (H) לבצע שני חתכים לאורך הלב השמאלי ולהניח את החלק האמצעי לתוך 10% NBF; (I) לעשות שני חתכים לאורך הלב הימני, למקם את החלק האמצעי לתוך 10% NBF, ולחתוך את crista terminalis; (J) חותכים את בסיס הלב, מבצעים שני חתכים לאורך היצירה, ומניחים את החתיכה האמצעית ב-10% NBF. קיצורים: SAN = צומת סינואטרי; NBF = פורמלין בעל מאגר נייטרלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: דגימה של הקריסטה טרמינליס מלב קבוע פורמלין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: פרוטוקול דיסקציה ודגימה בלב חזיר. (A) תצורה חיצונית של הלב; (B) להתחיל מהקאווה הקאודלית ולחתוך את האטריום הימני, לבחון את האטריום הימני, לאתר את crista terminalis, ולהתחיל לפתוח את החדר הימני; (C) לחתוך את החדר הימני לאורך הצומת עם המחיצה הבין-חדרית ולבחון את המסתם הטריקוספיד; (D) לאחר חיתוך ה-chordae tendineae, יש לבחון את החדר הימני, להניח את המלקחיים דרך תא המטען הריאתי ולהשתמש בהם כדי להנחות את החתך; (ה) לבחון את היציאה הריאתית; לאחר חתך האטריום השמאלי, לחתוך את החדר השמאלי מבסיס לקצה; (F) לבחון את המסתם המיטרלי ואת החדר השמאלי, ולחתוך את ה-chordae tendineae; מניחים מלקחיים דרך אבי העורקים ומשתמשים בהם כדי להנחות את החתך; (G) לבחון את אבי העורקים, לבצע שני חתכים לאורך הלב השמאלי, למקם את החלק האמצעי לתוך 10% NBF; (ח) לעשות שני חתכים לאורך הלב הימני; מקם את החלק האמצעי לתוך 10% NBF; (I) לקצץ את crista terminalis, למקם את היצירה ב 10% NBF; (J) לחתוך את בסיס הלב, לבצע שני חתכים לאורך היצירה, ולהניח את החתיכה האמצעית לתוך 10% NBF; (K) לקצץ את העורק הכלילי, לתקן אותו לילה, ולאחר מכן לבצע חתכים רוחביים מרובים במרווחים של 3 מ"מ. קיצור: NBF = פורמלין נייטרלי-חוצץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: פרוטוקול דיסקציה ודגימה בלב פרה. (A) תצורה חיצונית של הלב; (B) להתחיל מהקאווה הקאודלית ולחתוך את האטריום הימני, לבחון את האטריום הימני, לאתר את crista terminalis, ולהתחיל לפתוח את החדר הימני; (C) לחתוך את החדר הימני לאורך הצומת עם המחיצה הבין-חדרית, ולבחון את המסתם הטריקוספיד; (D) להמשיך את החתך במקביל לחריץ הפרקונלי, להעביר את המלקחיים דרך תא המטען הריאתי, ולהשתמש בהם כדי להנחות את החתך; (E) לבחון את היציאה הריאתית, להתחיל לחתוך את הוורידים הריאתיים ואת האטריום השמאלי, ולאחר מכן להמשיך לחתוך את החדר השמאלי מבסיס לקצה; (F) לבחון את המסתם המיטרלי ואת החדר השמאלי, ולחתוך את ה-chordae tendineae; (ז) להעביר את המלקחיים דרך אבי העורקים, להשתמש בהם כדי להנחות את החתך, ולבחון את אבי העורקים; (H) לחתוך את crista terminalis, ולמקם את היצירה ב 10% NBF; (I) לבצע שני חתכים לאורך הלב השמאלי, ולהניח את החלק האמצעי ב-10% NBF; (J) לבצע שני חתכים לאורך הלב הימני, ולהניח את החלק האמצעי ב-10% NBF; (K) לחתוך את בסיס הלב, לבצע שני חתכים לאורך החתיכה, ולהניח את החלק האמצעי ב 10% NBF. קיצור: NBF = פורמלין נייטרלי-חוצץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: בדיקה היסטולוגית של החדר הימני, האטריום הימני והמסתם הטריקוספיד בלב הכלב. הכתמת H&E. (A) דגימה היסטולוגית של החדר הימני, האטריום הימני והמסתם הטריקוספיד; (B) חדר ימין, אטריום ימני ומסתם טריקוספיד. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר; (C) חדר ימין, אטריום ימני ועורקים כליליים. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר; (D) אטריום ימני. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר. קיצורים: H&E = המטוקסילין ואאוזין; RV = חדר ימין; RA = אטריום ימני; Ts-V = שסתום טריקוספיד; CA = עורק כלילי; EnC = אנדוקרדיום; MC = שריר הלב; EpC = אפיקרדיום. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: בדיקה היסטולוגית של החדר השמאלי, האטריום השמאלי והמסתם המיטרלי בלב הכלב. הכתמת H&E. (A) דגימה היסטולוגית של החדר השמאלי, האטריום השמאלי והמסתם המיטרלי; (B) אטריום שמאלי. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר; (C) אטריום שמאלי, חדר שמאל, עורק כלילי ועצב. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר; (D) עורק כלילי, עצב. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: H&E = המטוקסילין ואאוזין; LA = אטריום שמאלי; LV = חדר שמאלי; Mt-V = מסתם מיטרלי; CA = עורק כלילי; EnC = אנדוקרדיום; MC = שריר הלב; EpC = אפיקרדיום; NV = עצב. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: בדיקה היסטולוגית של המחיצה הבין-חדרית, האטריום הימני והמסתם הטריקוספיד בלב כלב. צביעת H&E (A) מחיצה בין-חדרית, אטריום ימני ודגימה היסטולוגית של שסתום טריקוספיד; (B) מחיצה בין-חדרית, אטריום ימני ושסתום טריקוספיד. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר. קיצורים: H&E = המטוקסילין ואאוזין; IVS = מחיצה בין-חדרית; RA = אטריום ימני; שסתום טריקוספיד Ts-V. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 9: בדיקה היסטולוגית של הצומת הסינואטריאלי בלב כלב. הכתמת H&E. (A) מדגם היסטולוגי של crista terminalis; (B) צומת סינואטרלי הגדלה 4x. סרגלי קנה מידה = 500 מיקרומטר; (C) צומת סינואטרלי הגדלה פי 20. סרגלי קנה מידה = 100 מיקרומטר; (D) הגדלה של 40x צומת סינואטרי. סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר. קיצורים: H&E = המטוקסילין ואאוזין; צומת SA = צומת סינואטרי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 10: פרוטוקול דיסקציה על לב קבוע פורמלין של חתול. (A) תצורה חיצונית של הלב; (B) להעביר את המלקחיים דרך קאווה גולגולתית וורידים ריאתיים; המלקחיים מנחים את חתך האורך מבסיס לפסגה; (C) הנוף בן ארבעת התאים לאחר החיתוך. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 11: דגימות היסטולוגיות של לב של חתול. הכתמת H&E. (A) עיקרי המדגם ההיסטולוגי של הלב; (B) בסיס המדגם ההיסטולוגי של הלב. קיצורים: H&E = המטוקסילין ואאוזין; LV = חדר שמאלי; IVS = מחיצה בין-חדרית; RV = חדר ימין; LA = אטריום שמאלי; MV = שסתום מיטרלי; TS-V = שסתום טריקוספיד; RA = אטריום ימני. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
| מינים | גיל | ממוצע %BW | (LV + S)/RV | מספרי ציטוט |
| חתול | היילוד | 0.77% | - | 7 |
| חתול | מבוגר | 0.33%-0.46% | 2.94-4.17 | 8, 5, 11 |
| כלב | היילוד | 0.47%-0.76% | - | 8, 7 |
| כלב | מבוגר | 0.70%-0.85% | 2.39-5.12 | 8, 6, 11 |
| חזיר | מבוגר | 0.32%-0.48% | 2.38-3.84 | 11 |
| כבש | מבוגר | 0.17%-0.65% | 2.63-4.54 | 11 |
| פרה | מבוגר | 0.30%-0.66% | 2.43-4.00 | 11 |
טבלה 1: ערכי ייחוס ליחס משקל לב/משקל גוף תקין וליחס חדרים בבעלי חיים. מדידות לב עבור חתול, כלב, חזיר, כבשה ופרה. קיצורים: BW = משקל גוף; LV = חדר שמאלי; S = מחיצה בין-חדרית; RV = חדר ימין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בעת ביצוע הפרוטוקול הנוכחי, יש לשקול בזהירות מספר שלבים קריטיים לקבלת תוצאות עקביות. בבעלי חיים צעירים, מדידות הלב שונות מאלו של מבוגרים (כולל עובי דופן החדר), ובאופן כללי, הלב מייצג חלק גדול יותר ממשקל הגוף11,12. ניתן לכמת את מידת ההיפרטרופיה החדרית על ידי הפעלת נוסחת משקל כללית, היחס בין החדר השמאלי בתוספת מחיצה חלקי משקל החדר הימני החופשי, אשר, בתנאים רגילים, צריך להיות 2.8-4.0 בבעלי חיים בוגרים (טבלה 1). אם יחס זה עולה על 4.0, הוא מציין היפרטרופיה של החדר השמאלי, ואם הוא פחות מ -2.8, הוא מציין היפרטרופיה של החדר הימני 4,11,12. כדי לקבל את הערך של החדר, הקיר החופשי של החדר הימני חייב להיות מנותק לאורך הקיר interventricular ואת החריץ הכלילי להיות מופרד מן האטריום הימני. כריתת החדר השמאלי מהאטריום השמאלי נעשית בטבעת האטריובנטריקולרית4.
הלב מופרד מהגוף על ידי חתך כלי הדם הגדולים. אם החלקים של כלי הדם הגדולים קרובים מדי לבסיס הלב, כמה מבנים יכולים להיפגע, בעיקר אטריה ואת auricles. כדי להקל על התהליך, יש צורך למשוך בעדינות את הלב בגחון כדי לחתוך כראוי את כלי הדם הגדולים מעל בסיס הלב. שלב קריטי שני הוא הכרה במורפולוגיה של ה-crista terminalis, שהוא מבנה אנטומי בדיד הדורש ידע מבני מפורט של הלב. יש לקצור בזהירות את צומת ה- SA ולהטמיע אותו תוך התחשבות מיוחדת בסידור דגימות הרקמה בתוך הבלוקים במהלך התהליך ההיסטולוגי.
השינוי בטכניקת "ארבעת התאים" היה לשנות את ערכת החסימה ההיסטולוגית מבלוק אחד לשניים. הממדים הסטנדרטיים של קלטות היסטולוגיות הנמצאות בשימוש נרחב וההליך ההיסטולוגי המותאם (כולל תחנת צביעת המיקרוטום הסיבובית) אינם מתאימים להתאים את כל החלק של הלב בבלוק אחד ללא עיוות רקמות. למרות שטכניקת "ארבעת החדרים" מקלה על בדיקת מבנה חדרי הלב, היא מגבילה את הבדיקה של המערכת המוליכה. זה חשוב במיוחד במקרים בהם מתועדים הפרעות קצב לב. יתר על כן, בהתחשב בכך שטכניקת "ארבעת החדרים" דורשת רקמה קבועה ב- NBF, מספר בדיקות נוספות כגון בקטריולוגיה וביולוגיה מולקולרית יכולות להיפגע במידה מסוימת.
כשמדובר בלב של חתול או כלב בגודל קטן, תוכנית אקוקרדיוגרפית סטנדרטית מדויקת מתקבלת על רקמה קבועה. תצוגת ארבעת התאים מועילה, במיוחד עבור ממדי התא, אם יש וריאציות בגדלים חדריים או פרוזדורים1. בנוסף ליתרונות הקשורים לסופרפוזיציה המושלמת של זמירה ברוטו המתוכננת עם אלה המתקבלים במהלך בדיקה קלינית על ידי אקוקרדיוגרפיה, טכניקה זו מציגה את היתרון של הכללת רוב מרכיבי המפתח של הלב בשני בלוקים היסטולוגיים בלבד.
שיטת "זרימה-יציאה" המתוארת בחזירים הותאמה מפרוטוקולים המשמשים בלבם של בני אדם על ידי הוספת שלב דגימת העורק הכלילי. פרוטוקולי ניתוח הלב המתוארים כיום מדגימים נקודות סטנדרטיות לדגימה. בנוסף, כאשר הדיסקטור מתבונן או חושד בנגעים אחרים מלבד אלה המכוסים בפרוטוקול, יש לאסוף דגימות משלימות מתחומי העניין.
תוך כדי פיתוח הפרוטוקולים הנוכחיים, נחקרו שיטות אחרות, כגון השיטה הכוללת חיתוך אורכי ראשוני של עקומות הלבהעיקריות 12 וטכניקת "כיכר הלחם"/ציר קצר 9,11. הטכניקה הכוללת חיתוך אורכי של עקומות הלב העיקריות היא פרוטוקול פשוט יותר המשמש לעתים קרובות בחינוך ביו-רפואי12. טכניקת החתך הקצר ("טכניקת כיכר הלחם") יכולה להתבצע עם ציר קצר אחד11 או סדרה של קטעים בעובי 1-2 ס"מ מהפסגה לכיוון הבסיס, מה שמשאיר את המנגנון האטריובנטריקולרי שלם9. טכניקה זו היא המתאימה ביותר אם דיסקטור חושד פתולוגיות שריר הלב (כולל פתולוגיות דלקתיות וקרדיומיופתיות) אבל יש את החיסרון של בדיקה שטחית של המרכיבים valvular9.
שתי הטכניקות הללו נשלטות בקלות על ידי אנשים עם ידע בסיסי יחסית באנטומיה של הלב, אך חסרות נקודות חזקות לדגימה היסטולוגית ושקלול של כל מרכיב לבבי. לאחר המשך בשיטות אלה, הליך הקציר הבא כרוך בעבודה מייגעת כדי לזהות את תחומי העניין ולקבל דגימות קבועות. על הלבבות שנותחו בשיטות אלה, השקילה הנפרדת של שני החצאים דורשת מאמץ כדי להיות מסוגלים לחשב את היחס ביניהם. שיטת הציר הקצר זקוקה לצעדים נוספים לבדיקת האנדוקרדיום וכל המרכיבים הממוקמים בבסיס הלב. יתר על כן, הליך הקציר בעקבות שיטות אלה מורכב מעבודה מייגעת כדי לזהות את תחומי העניין ולקבל דגימות קבועות.
כתב יד זה מציג את המרכיבים המרכזיים של כמה פרוטוקולים סטנדרטיים של דיסקציה לבבית, המדגישים הן את גישות הבדיקה הגסה והן את אתרי הדגימה המשמשים בדרך כלל לבדיקה היסטופתולוגית. לגבי היישומים העתידיים של הטכניקה, המטרה העיקרית של הפרוטוקול המוצג היא להציע קו מנחה חזק לכריתת לב שניתן להשתמש בו בקלות בכל המחקרים הניסיוניים הדורשים הערכה לבבית מפורטת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.
Acknowledgments
ללא.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% saline solution | B. BRAUN MELSUNGEN AG | W04479004 | For washing all the blood, and blood clots from the heart. |
| 10% neutral buffered formalin (NBF) | Q Path | 11699404 | Materials for collecting histopathology samples. |
| Bone cutting forceps | HELEN SRL | LS109HV | Sturdy instrument for cutting bone. |
| Cutting board | Ambition | 86304 | For an easier manipulation, and cutting the organs. |
| Decalcifying solution | Thermo Scientific TBD-2 | 6764004 | 1:1 mixture of 8% formic acid and hydrochloric acid. |
| Digital camera | Canon Inc. | PowerShot SX540 HS | For photographic, and videographic documentation. |
| Forceps | MKD-Medicale | 15-430 | Dissection instruments. |
| Histological cassettes | Q Path | 720-2215 | Materials for collecting histopathology samples. Dimensions: 3 × 2.5 × 0.4 cm |
| Knife | TEHNO FOOD COM SERV SRL | D2006/15 | Sharp blade for cutting soft tissue. |
| Latex gloves | MKD-Medicale | SANTEX-S | Protection equipment. |
| Mask | MKD-Medicale | 21221 | Protection equipment. |
| Petri dishes | MKD-Medicale | 0598-1V | Materials for collecting ancillary testing samples. |
| Plastic recipients | Corning Gosselin | TP200-02 | Materials for collecting histopathology samples. |
| Scale | ESPERANZA | MEEKS008 | For weighing the organs. |
| Scale | White Deals | 72 | For weighing the subjects. |
| Scalpel | MKD-Medicale | 10322E | Sharp blade for cutting soft tissue. |
| Scissors | MKD-Medicale | 13-260 | Dissection instruments. |
| Scrub | MKD-Medicale | 410100-52 | Protection equipment. |
| Syringes | MKD-Medicale | 10573EU | Materials for collecting ancillary testing samples. |
References
- Ashworth, M. Pathology of Heart Disease in the Fetus, Infant and Child: Autopsy, Surgical and Molecular Pathology. , Cambridge University Press. Cambridge. (2019).
- Barone, R. Anatomie Comparée des Mammifères Domestiques: Angiologie. Vigot, , Lyon. (2011).
- Basso, C., et al. Guidelines for autopsy investigation of sudden cardiac death: 2017 update from the Association for European Cardiovascular Pathology. Virchows Archiv. 471 (6), 691-705 (2017).
- Bishop, S. P. Chapter 37 - Necropsy Techniques for the Heart and Great Vessels. Textbook of Canine and Feline Cardiology: Principles and Clinical Practice,.2nd ed. Fox, P. R., Sisson, D., Moïse, N. S. , W. B. Saunders. Philadelphia, PA. 846-848 (1999).
- Joseph, D. R. The ratio between the heart-weight and body weight in various animals. Journal of Experimental Medicine. 10 (4), 521-522 (1908).
- Keenan, C. M., Vidal, J. D. Standard morphologic evaluation of the heart in the laboratory dog and monkey. Toxicologic Pathology. 34 (1), 67-74 (2006).
- Latimer, H. B. Variability in body and organ weights in the newborn dog and cat compared with that in the adult. The Anatomical Record. 157 (3), 449-456 (1967).
- Lee, J. C., Taylor, F. N., Downing, S. E. A comparison of ventricular weights and geometry in newborn, young, and adult mammals. Journal of Applied Physiology. 38 (1), 147-150 (1975).
- McDonough, S. P., Southard, T. Necropsy Guide for Dogs, Cats, and Small Mammals. , John Wiley & Sons. 9 (2016).
- Prophet, E. B., Mills, B., Arrington, J. B., Sobin, L. H. Laboratory Methods in Histotechnology. , Armed Forces Institute of Pathology-American Registry of Pathology. Washington, DC. 29-58 (1992).
- Robinson, W. F., Robinson, N. A. Chapter 1 - Cardiovascular System. Jubb, Kennedy & Palmer's Pathology of Domestic Animals, 6th ed. Grant Maxie, M., Saunders, W. B. 3, 12-49 (2016).
- Tabaran, A. F. Autopsie et Medecine Legale: Guide de Travaux Pratiques. , Academic Press. 21-86 (2020).
- Autopsypathology.net. , Available from: http://autopsypathology.net/wpcontent/uploads/2016/02/rcpath_cardiacdeath_jul2015.pdf (2021).
- Pathology.ucla.edu. , Available from: http://pathology.ucla.edu/workfiles/Education/Residency%20Program/Gross%20Manual/Endomyocardial%20Biopsy%20(EMB).pdf (2021).
- Arbeitsgruppen Sudden Cardiac Death. , Available from: http://www.sgrm.ch/medizin/arbeitsgruppen/sudden-cardiac-death.html (2021).
- Toxpath.org. , Available from: https://www.toxpath.org/Trimming-N-Collection-Training.asp (2021).
- YouTube.com. , Available from: httpswwwyoutubecomwatchvxkJ2WGqi2Qw&t2494s (2021).
