Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Generering, high-throughput screening og biobanking af menneskeskabte pluripotente stamcelleafledte hjertesfæroider

Published: March 10, 2023 doi: 10.3791/64365
Automatic Translation
1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, *1, *1
1Utrecht Regenerative Medicine Center, Circulatory Health Laboratory, University Utrecht, Department of Cardiology, University Medical Center Utrecht, 2Amsterdam Cardiovascular Sciences, Department of Physiology, Amsterdam University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Præsenteret her er et sæt protokoller til generering og kryopræservering af hjertesfæroider (CS'er) fra menneskeinducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter dyrket i et multidimensionelt format med høj kapacitet. Denne tredimensionelle model fungerer som en robust platform til sygdomsmodellering, screeninger med høj kapacitet og opretholder sin funktionalitet efter kryopræservering.

Abstract

Human-induceret pluripotent stamcelle-afledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) er af afgørende betydning for human hjertesygdom modellering og terapi. Vi offentliggjorde for nylig en omkostningseffektiv strategi for den massive udvidelse af hiPSC-CM'er i to dimensioner (2D). To store begrænsninger er celle umodenhed og mangel på tredimensionelt (3D) arrangement og skalerbarhed i high-throughput screening (HTS) platforme. For at overvinde disse begrænsninger udgør de udvidede kardiomyocytter en ideel cellekilde til generering af 3D-hjertecellekultur og vævstekniske teknikker. Sidstnævnte har et stort potentiale på det kardiovaskulære område og giver mere avanceret og fysiologisk relevant HTS. Her beskriver vi en HTS-kompatibel arbejdsgang med nem skalerbarhed til generering, vedligeholdelse og optisk analyse af hjertesfæroider (CS'er) i et 96-brøndsformat. Disse små CS'er er afgørende for at udfylde hullet i nuværende in vitro-sygdomsmodeller og / eller generering til 3D-vævstekniske platforme. CS'erne præsenterer en meget struktureret morfologi, størrelse og cellulær sammensætning. Desuden viser hiPSC-CM'er, der dyrkes som CS'er, øget modning og flere funktionelle træk ved det menneskelige hjerte, såsom spontan calciumhåndtering og kontraktil aktivitet. Ved automatisering af hele arbejdsgangen, fra generering af CS'er til funktionel analyse, øger vi intra- og interbatchreproducerbarheden som demonstreret ved high-throughput (HT) billeddannelse og calciumhåndteringsanalyse. Den beskrevne protokol muliggør modellering af hjertesygdomme og vurdering af lægemiddel/terapeutiske virkninger på enkeltcelleniveau i et komplekst 3D-cellemiljø i en fuldautomatisk HTS-arbejdsgang. Derudover beskriver undersøgelsen en enkel procedure til langsigtet konservering og biobanking af helsfæroider, hvilket giver forskere mulighed for at skabe næste generations funktionelle vævsopbevaring. HTS kombineret med langtidsopbevaring vil bidrage væsentligt til translationel forskning på en lang række områder, herunder lægemiddelopdagelse og testning, regenerativ medicin og udvikling af personaliserede terapier.

Introduction

Opdagelsen af menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC'er) gav hidtil usete muligheder for at studere menneskelig udvikling og sygdom på celleniveau. I løbet af det sidste årti er der ved hjælp af udviklingslektioner etableret forskellige protokoller for at sikre effektiv differentiering af hiPSC'er i kardiomyocytter (CM'er)1,2,3,4. hiPSC-afledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er) kan tjene som en ressource til modellering af genetisk arvelige hjerte-kar-sygdomme (CVD'er), test af hjertesikkerhed for nye lægemidler og hjerteregenerative strategier 5,6,7,8. På trods af den rettede hjertedifferentiering af hiPSC'er forbliver ubestemte CM-numre en udfordring inden for hjerteområdet, da modne hiPSC-CM'er generelt er ikke-proliferative, og primære humane celler ikke er tilgængelige i store mængder.

For nylig beskrev vi, at samtidig Wnt-signalaktivering med kultur med lav celletæthed resulterede i et massivt proliferativt respons (op til 250 gange) af hiPSC-CM'er 9,10. Denne omkostningseffektive strategi for massiv udvidelse af hiPSC-CM'er via seriel passaging i kulturkolbeformat letter standardisering og kvalitetskontrol af et stort antal funktionelle hiPSC-CM'er. For at holde trit med efterspørgslen efter store partier hiPSC-CM'er fra forskellige donorer er biobanking af hiPSC-CM'er desuden blevet beskrevet10. Imidlertid er kardiomyocytmonolag, der er podet i disse standardkulturretter, ikke repræsentative for den komplekse 3D-struktur, der findes i hjertet. Desuden er hiPSC-CM'ernes umodenhed forblevet en hindring og har således ikke efterlignet den biologiske og fysiologiske fænotype i in vivo-kardiovaskulærmiljøet.

Nye 3D in vitro-modeller er blevet udviklet, hvor hiPSC-CM'er viser tættere fysiologisk adfærd såsom selvorganisering 11,12, ekstracellulær matrix (ECM) remodellering 13, forbedret modning 14,15,16 og synkroniseret sammentrækning17,18,19 . 3D-modeller er blevet brugt til lægemiddelopdagelse, test af lægemiddelkardiotoksicitet, sygdomsmodellering, regenerative terapier og endda de første kliniske forsøg 20,21,22,23,24. En af de mest anvendte modeller er det fibrinbaserede konstruerede hjertevæv (EHT), som udviser et vævslignende arrangement og hjertekontraktilitet13,17,25. Tidligere viste vi, at EHT'er genereret fra udvidede hiPSC-CM'er viste sammenlignelig kontraktilitet med dem fra uudvidede hiPSC-CM'er, hvilket demonstrerede kompromisløs cellulær funktionalitet efter ekspansion9. Selv om genereringen af EHT'er fra hiPSC-CM'er er veletableret, forventes der ikke desto mindre yderligere udvikling med hensyn til oprettelsen af en HT-vurderingsplatform. Her muliggør den hurtige generering af et stort antal selvaggregerende hjertesfæroider (CS'er) i 96-brøndformat en forbedring af 3D-betingelserne til HTS-formål (high-throughput screening).

Samlet set er fordelen ved CS'er som 3D-cellekultur deres høje reproducerbarhed og skalerbarhed. Især kan CS'er kombineret med robotprøvehåndtering standardisere og automatisere CS-kultur, lægemiddelbehandling og analyse af højt indhold20. Her beskriver vi optimerede protokoller til generering af CS'er af høj renhed og høj kvalitet, som effektivt kan kryopræserveres og screenes for hjertefunktion ved at udføre Ca2+ forbigående målinger ved hjælp af et optisk calciumoptagelses- og analysesystem. Denne model giver et simpelt, men kraftfuldt værktøj til at udføre skærme med høj kapacitet på hundreder til tusinder af sfæroider17,18.

Protocol

BEMÆRK: hiPSC-CM'er, der blev brugt i denne undersøgelse, blev genereret i henhold til tidligere beskrevne hiPSC-dyrknings- og CM-differentieringsprotokoller26,27. Som ekstraudstyr kan hiPSC-CM'erne udvides og kryopræserveres, som de for nylig blev offentliggjort, før CS-protokollen startes (afsnit 4)10.

1. Fremstilling af cellekulturmedier, opløsninger og alikvoter

  1. Forbered basalmedium
    1. Ligevægt penicillin-streptomycin og mediet (RPMI 1640) til stuetemperatur (RT) og sørg for, at det er optøet fuldstændigt. Bland 500 ml af mediet og 5 ml pen/strep. Opbevares ved 4 °C i op til 8 uger; ligevægt til 37 °C før brug.
  2. Forbered RPMI + B27
    1. Ligevægt B27 supplement og basal medium til RT. Sørg for at tø tillægget helt op. Bland 490 ml basalmedium og 10 ml 50x B27-tilskuddet. Opbevares ved 4 °C i op til 2 uger; ligevægt til 37 °C før brug.
  3. Klargøring af hiPSC-CM-genbelægningsmedier
    1. Tilføj Rho-associeret, oprullet spoleholdig proteinkinase (ROCK) hæmmer (2 μM slutkoncentration) og 10% knockout serum udskiftning (KSR) til RPMI + B27 medier. Tilføj ROCK-hæmmer direkte til RM-mediet efter behov. Opbevar ikke kulturmedier, når de er suppleret.
  4. Forbered CM-optøningsmedier
    1. Tilsæt en koncentration på 1:100 af celleoverlevelsestilskud (f.eks. Revitacell) og 20% KSR til RPMI + B27-medier og ekvilibrer til 37 °C før brug.
  5. Forbered modningstilskud
    1. Den tidligere beskrevne modningsmedium formel28 består af: 3 mM glucose, 10 mM L-lactat, 5 mg/ml vitamin B12, 0,82 mM biotin, 5 mM kreatinmonohydrat, 2 mM taurin, 2 mM L-carnitin, 0,5 mM ascorbinsyre, 1x NEAA, 0,5% (w/v) albumax, 1x B27 og 1% KOSR. For at forberede en fuld flaske (500 ml) modningstilskud skal du fjerne 65 ml fra en flaske DMEM uden glukose og supplere med 2,7 g glucose, 5,6 g L-lactat, 0,025 mg vitamin B12, 1 mg Biotin, 3,73 g kreatinmonohydrat, 1,25 g taurin, 1,975 g L-carnitin, 0,7125 g ascorbinsyre, 50 ml NEAA, 12,5 g albumax og 5 ml penicillin-streptomycin.
    2. Filtrer gennem en steril engangsfilterenhed med en 0,22 μm pore Polyethersulfon (PES) membran.
    3. Alikvote i 45 ml (til fremstilling af 500 ml modningsmedium) eller 4,5 ml (til fremstilling af 50 ml modningsmedium). Opbevares ved 20 °C i op til 6 måneder.
  6. Forbered modningsmedier
    1. Ligevægt B27-tilskuddet, knockout SR, penicillin-streptomycin, modningstilskuddet28 og DMEM-ikke-glukosemediet ved RT. Sørg for at tø tilskuddet helt op. Bland 435 ml DMEM intet glukosemedium med 10 ml 50x B27-tilskuddet, 5 ml penicillin-streptomycin, 5 ml knockout SR og 45 ml modningstilskud. Opbevares ved 4 °C i op til 2 uger; ligevægt ved 37 °C før brug.
  7. Forbered fluor lyst medium
    1. Ligevægt penicillin-streptomycin og DMEM fluorobrit medium ved RT. Sørg for, at tillægget er helt optøet. 500 ml DMEM-fluorbritsubstratet blandes med 5 ml penicillin-streptomycin. Opbevares ved 4 °C i op til 1 måned; ligevægt ved 37 °C før brug.
  8. Klargør den nonioniske vaskemiddelopløsning
    1. Bland 20% w/v nonionisk vaskemiddelpulver (f.eks. F-127) med PBS. Filtrer ved hjælp af et 0,22 μm filter og opbevar ved 4 °C i op til 6 måneder; ekvilibrer ved RT før brug.
  9. Forbered calciumfarvemedium
    1. Bland den nonioniske vaskemiddelopløsning (slutkoncentration på 0,04% v/v) og 0,1x calciumfarvestof (f.eks. Cal520 AM) i fluorlyst medium. I et 50 ml konisk rør tilsættes 10 μL Cal520 og 20 μL af den nonioniske vaskemiddelopløsning. Bland indtil det er helt opløst. Opbevar opløsningen i mørke, før du tilføjer til cellerne.

2. Forberedelse af buffere

  1. Forbered permeabiliserings- og blokeringsbuffer: Denne buffer indeholder 10 ml PBS, 5% wt/v BSA og 0,3% v/v Triton-X-100.
  2. Forbered flowcytometribufferen: Denne buffer indeholder 50 ml PBS, 1% wt / v BSA og 0,3% v / v Triton-X-100.
  3. Flowcytometrivaskebuffer: Denne buffer indeholder 50 ml PBS og 1% vægt/v BSA.
  4. Sfærisk vaskebuffer (SWB): Denne buffer indeholder 1 ml Triton-X-100, 2 ml 10% (w/v i DPBS) SDS og 2 g BSA i 1 liter PBS.
    BEMÆRK: SWB kan opbevares ved 4 °C i op til 2 uger.
  5. Forbered indlejringsopløsningen (ES): For at forberede 100 ml af indlejringsopløsningen blandes 50 ml glycerol med 9,09 ml dH2O, 1 ml Tris-buffer (1 M, pH 8,0) og 200 μL EDTA (0,5 M). Tilsæt 22,7 g fruktose og bland ved RT i mørke, indtil det er opløst. Når det er klart, tilsættes 22,2 g fructose og blandes, indtil det er opløst. Derefter tilsættes 15 g urinstof og blandes, indtil det er opløst (opbevares ved 4 °C i mørke).
  6. Forbered PBT (PBS med Tween-20) buffer. Denne buffer indeholder PBS/Tween-20 (0,1% v/v). For 1 liter PBS tilsættes 1 ml Tween-20.

3. Fremstilling af små molekyler

  1. Thiazovivin (ROCK-hæmmer) pulver rekonstitueres i 10 mM alikvoter à 50 μL i DMSO og opbevares ved -20 °C i op til 6 måneder. Beskyt mod lys.
  2. Forbered 2,5 mM alikvoter af 10 μL hver af Cal-520 AM i DMSO og opbevar dem ved -20 °C i op til 6 måneder. Beskyt mod lys.

4. Generering af hjertesfærisk

BEMÆRK: For større mængder CS'er skal du frø op til 1 million CM i en 6-brønds ultra-lav fastgørelsesplade med 2 ml hiPSC-CM-genbelægningsmedier. Denne undersøgelse brugte mindst 2.500 (2.5k CS) op til 20.000 (20k CS) hiPSC-CM'er pr. Brønd på en 96-brøndplade.

  1. For en plade med 96 brønde fremstilles en cellekultur, der indeholder mindst 2 x 106 human-inducerede pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter (hiPSC-CM'er)10.
  2. Når de dyrkede hiPSC-CM'er når sammenløb, tilsættes 0,1 ml /cm2 steril hjerteløsrivelsesopløsning (f.eks. Tryple) til hvert hul. Pladen inkuberes ved 37 °C i 15 min.
  3. Brug en 5 ml pipette til mekanisk at adskille cellerne ved at skylle med 2 ml varmt basalmedium for at fremstille en enkelt cellesuspension. Bekræft løsningen med et lyst feltmikroskop (4x forstørrelse); Celler vil se hvide ud og have en rund form.
  4. Overfør cellesuspensionen til et 15 ml konisk rør og centrifuger i 3 minutter ved 300 x g.
  5. Supernatanten suges til syn, og cellerne resuspenderes i 1 ml hiPSC-CM-genbelægningsmedier.
  6. Brug en 1.000 μL pipetspids til mekanisk at adskille cellepelleten. Opløsningen forekommer homogen efter tre eller fire blandinger. Tæl cellerne. Overfør den passende mængde celler i 100 μL af genbelægningsmediet til hver ultra-lav fastgørelsesbrønd med rundbundet 96 brønd.
  7. Placer pladen af CS'er på en orbitalryster ved 70 o / min i inkubatoren i 24 timer. Indstil inkubatorbetingelserne til 37 ° C, 5% CO2, 21%O2 og 90% fugtighed.
  8. Der suges 50 μL medium fra hvert hul, og der tilsættes 100 μL RPMI + B27 medium pr. hul i de første 48 timer.
    BEMÆRK: Opbevar altid 50 μL af mediet i 96-brøndpladen for at undgå utilsigtet aspiration og sfæroidbrud.
  9. Der suges 100 μL af substratet fra hvert hul, og der tilsættes 100 μL modningsmedium pr. hul. Vedligehold cellerne i modningsmediet og opdater mediet hver 2-3 dage.

5. Kryopræservering af CS'er

BEMÆRK: CS'er kan kryopræserveres til langtidsopbevaring. Kryopræservering kan udføres fra dag 3 efter generering af CS'er. CS'er kan kryopræserveres direkte i brøndene på en 96-brøndplade eller som en CS-suspension i kryovialer.

  1. Forafkøl pladen ved at lægge pladen på is i 10 min.
  2. Centrifuger kuglepladen i 3 minutter ved 70 x g.
  3. Supernatanten fjernes, indtil der er 50 μl tilbage, og der tilsættes 200 μl iskold hiPSC-frysemedium pr. hul.
    BEMÆRK: Hold CS-suspensionen på is under hele proceduren. I tilfælde af en 6-brønds plade med sfæroider fryses en brønd i et 500 μL frysemedium kryovialt.
  4. Forsegl pladen med pladeforseglingsfilm.
    BEMÆRK: 96-brøndpladen skal opbevares i en polystyrenkasse, eller når den ikke er tilgængelig, kan der fremstilles en siliciumform som beskrevet i trin 5.5.1.
  5. For at sikre ensartet varmeveksling mellem brøndpladen og fryseren skal du placere pladen forsigtigt i en polystyrenkasse eller i en siliciumform.
    1. For at forberede siliciumformen: Bland kraftigt to komponenter i siliciumelastomersættet i forholdet 10: 1. De-boble opløsningen ved hjælp af en vakuumpumpe i 15-20 min. Derefter støbes opløsningen inde i den nederste del af brøndpladen og debobles ved hjælp af en vakuumpumpe i 10 min. Anbring formen i en ovn og hærd ved 60 ° C i 8 timer for at opnå en halvfleksibel elastomer, der skrælles af pladen.
  6. Pladen fryses ved -80 °C i mindst 4 timer i polystyrenæsken eller den tilberedte siliciumform.
  7. Overfør pladen til en flydende nitrogentank eller en -150 °C fryser til langtidsopbevaring.

6. Optøning af hjertesfæroider

BEMÆRK: Optø ikke mere end én plade ad gangen for at sikre en hurtig optøningsproces.

  1. Forbered 20 ml 37 °C forvarmet basalmedium i et 50 ml konisk rør.
  2. Saml cellepladen med CS'er fra det flydende nitrogen og læg den i inkubatoren i 15 min. Indstil inkubatorbetingelserne til 37 ° C, 5% CO2, 21%O2 og 90% fugtighed.
  3. Supernatanten og cellepillerne fjernes, og hvert hul opslæmmes igen i et varmt basalmedium. Brug 200 μL medium pr. Brønd.
  4. Centrifuger i 3 min ved 70 x g.
  5. Gentag trin 6.3 og 6.4.
  6. Supernatanten fjernes, indtil cellepellet er tilbage, og der tilsættes 200 μL CM-optøningsmedium i hvert hul.
  7. Placer pladen af CS'er på en orbitalryster ved 70 o / min i en inkubator i 24 timer. Indstil inkubatorbetingelserne til 37 ° C, 5% CO2, 21%O2 og 90% fugtighed.
  8. Der suges 50 μL af substratet fra hvert hul, og der tilsættes 100 μL RPMI + B27 medium pr. hul i de første 48 timer.
  9. Der suges 100 μL af substratet fra hvert hul, og der tilsættes 100 μL modningsmedium pr. hul. Bevar cellerne i modningsmediet og opdater mediet hver 2-3 dage.

7. Vurdering af intracellulære Ca2+ transienter

BEMÆRK: CS'er er i kultur i alt 3 uger; 2 uger før frysning og 1 uge efter optøning. De 'friske' kontroller er aldersmatchede.

  1. Efter 1 uges kultur er de optøede CS'er optimale til calciumhåndtering optisk billeddannelse. Brug et calciumfarvestof (f.eks. Cal520AM) til at vurdere optagelsen og frigivelsen af Ca2+ fra cellerne.
  2. Behandl dem med 100 μL calciumfarvemedium pr. Brønd og inkuber i 60 minutter i inkubatoren. Indstil inkubatorbetingelserne til 37 ° C, 5% CO2, 21%O2 og 90% fugtighed.
    BEMÆRK: Cal520AM er lysfølsom. Udfør alle indlæsningsprocedurer og eksperimenter i mørket.
  3. Forbered calciumopkøbs- og analysesystemet.
    1. Tænd mikroskopet, og sørg for, at miljøkontrolindstillingen er tændt.
    2. Juster kameraets og indramningens blændedimensioner for at minimere baggrundsområdet.
      BEMÆRK: Her blev Leica Thunder DMi8-mikroskopet brugt; Andre mikroskopsystemer er også anvendelige, indtil de tillader en samplingshastighed over 30 billeder / sekund (FPS).
  4. Optag en video med en konstant strøm af 2-10 toppe inden for 10 sek., og scan hen over 96-brøndspladen, først bevægende til venstre og derefter nedad på en zig-zag måde for at dække hele pladen. Mål calciumsignalet ved hjælp af en 488 nm laser; Indstil kontrasten til en sort baggrund med et lysegrønt signal under calciumfrigivelse.
  5. Når du har erhvervet Ca2+ transienterne, skal du analysere dataene med fluorescenssporanalysesoftwaren (f.eks. CyteSeer, Vala Sciences) i henhold til producentens anvisninger.

8. Flowcytometrianalyser af dissocierede hjertesfæroider

BEMÆRK: I denne undersøgelse blev flowcytometri brugt til at bestemme levedygtigheden af CS'erne før og efter optøningsprocessen.

  1. Opsaml CS'erne i et 15 ml konisk rør ved hjælp af en 5 ml pipet for at undgå sfæroidskader og centrifuger i 3 minutter ved 70 x g. Opsug supernatanten og tilsæt 1 ml PBS.
  2. Centrifuger i 3 min ved 200 x g. Sug supernatanten op, og dissocier CS'erne ved at tilsætte 1 ml hjerteløsrivelsesopløsning (f.eks. tryple). Inkuber glasset ved 37 °C i 15 min.
  3. Brug en 5 ml pipette til mekanisk at adskille cellerne ved at skylle med 2 ml basalmedium, indtil enkeltceller kan ses, når de observeres under mikroskopet.
  4. Centrifuger i 3 min ved 200 x g.
  5. Supernatanten suges op, og CM'erne fastgøres med 200 μL 4% paraformaldehydopløsning (PFA) i 1x PBS. Inkuber i 10 minutter ved RT.
  6. Centrifuger i 3 min ved 200 x g. Opsug supernatanten og tilsæt 1 ml PBS.
    BEMÆRK: Pausepunkt: De faste hiPSC-CM'er kan opbevares ved 4 °C i op til 4 uger.
  7. Overfør cellesuspensionen til et FACS-glas og centrifuger i 3 minutter ved 200 x g. Supernatanten suges op, og 1 x 105 celler opsuges i 50 μl permeabiliseringsbuffer.
  8. Inkuber cellerne i 30 minutter ved 4 °C.
  9. For immunofluorescensflowcytometrianalyse udføres trin 8.9.1-8.9.4.
    1. Resuspender cellerne i flowcytometribufferen (50 μL) indeholdende α-actinin-antistoffet ved en fortynding på 1:300. I et andet FACS-rør resuspenderes 1 x 105 celler i flowcytometribufferen (50 μL) med den respektive isotypekontrol (f.eks. FITC-mus IgM, κ isotype [1:200 fortynding]). På samme måde resuspenderes 1 x 105 celler i 50 μL flowcytometribuffer for negativ kontrol.
    2. Inkuber cellerne i 30 minutter ved 4 °C.
    3. Der tilsættes 2,5 ml flowcytometribuffer, og cellerne centrifugeres ved 200 x g i 3 minutter ved 4 °C; Supernatanten kasseres, og dette vasketrin gentages to gange.
    4. Resuspender cellerne i 50 μL flowcytometribuffer med det sekundære antistof ged-anti-mus (1:300 fortynding).
      BEMÆRK: Placer røret i mørke, da den sekundære antistofopløsning er lysfølsom.
  10. For levedygtighedskontrol med propidiumiodid (PI) tilsættes 150 μL PI pr. prøve (1:1.000) og inkuberes i 15 min.
    BEMÆRK: Placer røret i mørke, da PI-opløsningen er lysfølsom.
  11. Juster portene i henhold til standardgatingstrategien som vist i supplerende figur 1 , og analyser cellerne med et flowcytometer.

9. Immunofluorescensfarvning af hele 3D-sfæroider

BEMÆRK: Denne protokol er baseret på protokollen for højopløselig 3D-billeddannelse af hele organoider ved immunfluorescerende mærkning, som tidligere blev offentliggjort29 og justeret for hjertesfæroider. Under proceduren kan alle pipetspidser og koniske rør belægges med 1% vægt/v BSA-PBS for at forhindre, at sfæroiderne klæber til plast. For at belægge materialerne dyppes ned i 1% BSA-PBS. Pas på ikke at beskadige sfæroiderne ved at bruge 5 ml pipet, undgå mekaniske forstyrrelser.

  1. Opsaml CS'erne i et 15 ml belagt rør med en 5 ml pipet. Sfæroiderne er synlige for øjet. Saml ~ 20-50 sfæroider pr. Antistofkombination. Der centrifugeres i 3 minutter ved 70 x g og suges til supernatanten.
  2. Sfæroider resuspenderes forsigtigt i 1 ml iskold 4% paraformaldehydopløsning (PFA) i 1x PBS ved hjælp af en belagt 1 ml spids.
  3. Fastgør ved 4 °C i 45 min. Efter 20 minutter resuspenderes sfæroiderne forsigtigt med en belagt 1 ml spids. Dette udjævner fiksering blandt alle sfæroider.
  4. Tilsæt 10 ml iskold PBS til røret og bland forsigtigt ved at vende røret. Inkuber i 10 minutter ved 4 °C og drej ned ved 70 x g i 3 min.
    BEMÆRK: Fra dette trin og fremefter er belægning af spidser og koniske rør generelt ikke nødvendig, da CS'er ikke klæber til spidsen efter fiksering.
  5. Bloker CS'erne ved at resuspendere pelleten i iskold SWB (200 μL SWB pr. Brønd) og overfør sfæroiderne til en 24-brønds suspensionskulturplade.
    BEMÆRK: CS'er fra en stor pellet kan opdeles over flere brønde for at udføre forskellige farvninger. Brug ~ 20-50 CS'er pr. Antistofkombination.
  6. Der inkuberes ved 4 °C i mindst 15 minutter.
  7. Der tilsættes 200 μL af SWB i et tomt hul for at tjene som referencebrønd.
    BEMÆRK: Til immunfluorescerende farvning kan 48- eller 96-brøndplader også bruges til at reducere antistofbrug. Farvnings- og vaskeresultaterne kan dog reduceres på grund af det mindre volumen pr. Brønd.
  8. Lad sfæroiderne sætte sig i bunden af pladen ved at lade pladen vippe i en vinkel på 45° i 5 min.
  9. SWB fjernes, og CS'erne efterlades i 200 μL af SWB (brug referenceboksen til at estimere det minimale volumen på 200 μL).
  10. Der tilsættes 200 μL SWB med de primære antistoffer 2x koncentreret (f.eks. ɑ-actinin [1:200] og Troponin T [1:200]) og inkuberes natten over ved 4 °C under vuggen/omrystning (40 omdr./min. på en vandret ryster).
  11. Den næste dag tilsættes 1 ml SWB til hvert hul.
  12. Lad kugleformerne sætte sig i bunden af pladen ved at lade pladen stå i en vinkel på 45° i 5 minutter.
  13. Fjern SWB'en, og lad 200 μL blive i pladen. Tilsæt 1 ml SWB og vask i 2 timer med langsom rocking/shaking.
  14. Gentag trin 9.12 og 9.13 to gange mere.
  15. Lad CS'erne sætte sig i bunden af pladen ved at lade pladen vippe ved 45° i 5 min. Fjern SWB'en, og efterlad 200 μL i hvert hul
  16. Der tilsættes 200 μL SWB med sekundære antistoffer, konjugerede antistoffer og farvestoffer 2x koncentreret (f.eks. DAPI [1 μg/ml], mus-AF488 [1:500], kanin-AF568 [1:500]), og inkuberes natten over ved 4 °C i mørke, mens du langsomt vugger/ryster.
  17. Næste dag gentages trin 9.12 og 9.13 to gange mere.
  18. Overfør forsigtigt CS'erne til et 1,5 ml rør og drej ned ved 70 x g i 3 minutter.
  19. Fjern så meget af SWB som muligt ved pipettering uden at forstyrre CS'erne.
  20. Der tilsættes indlejringsopløsningen (ES; mindst 50 μL ved RT) ved hjælp af en 200 μL spids med enden afskåret og resuspenderes forsigtigt for at forhindre bobledannelse og inkuberes ved RT i 20 min.
  21. I mellemtiden skal du oprette en firkantet beholder på et glasglas med enten neglelak eller silikoneforseglingsmiddel.
  22. Skær enden af en 200 μL spids af, og overfør CS'erne i ES til midten af den firkantede beholder.
  23. Placer en firkantet dæksel ovenpå. For at reducere luftbobler skal du først placere den ene side af dæksedlen, derefter langsomt sænke dæksedlen fra den ene side til den anden, indtil der ikke er fanget luft under overfladen, og derefter slippe dæksedlen.
  24. Tryk forsigtigt på alle kanter af dækslet for at forsegle det med neglelakken eller silikoneforseglingsmidlet.
  25. Forlad rutsjebanen natten over på RT. Næste dag er diaset klar til billeddannelse.
    BEMÆRK: Optisk rensning af ES kan forårsage mindre vævskrympning. Dette kan dog ikke påvirke CS'ernes overordnede morfologi. Farvningsproceduren kan sættes på pause her ved at opbevare diasene ved 4 °C (i mindst 1 uge) eller ved -20 °C (i mindst 6 måneder).

Representative Results

Protokollen vist i figur 1A beskriver genereringen af CS'er fra tidligere udvidede hiPSC-CM'er. CS'erne får en 3D-struktur på dag 1 efter såning i ultralave fastgørelsesplader med rundbund og kan dyrkes i op til 6 uger (figur 1B). Som vurderet ved immunofluorescensfarvning udtrykte størstedelen af cellerne i 3 uger gamle CS'er sarkomeriske proteiner såsom α-actinin og troponin T og viste regelmæssig sarkomerorganisation (figur 1C). Til kvantificering af α-actininpositive celler blev flowcytometrianalyse udført. I overensstemmelse med immunofluorescensresultaterne viste flowcytometridataene sammenlignelige høje niveauer af α-actinin i både dag 0 (76,9% ± 16,6%) og 3 uger gamle CS'er (71,1% ± 22,7%) (figur 1D), hvilket indikerer en konstant og meget ren cellulær sammensætning under dyrkning. Der var en øget ekspression af hjertegenerne for kryds (GJA1, JPH2 og PKP2), desmosomer (DES) og mitokondrier (ATP5A) i hiPSC-CM-afledte sfæroider (dag 42) versus hiPSC-CM'er dyrket i 2D i 90 dage (figur 1E). Ekspressionen af disse gener er et kendetegn ved celle-celle interaktion og modning30.

Derefter blev CS'ernes funktionelle egenskaber, nemlig slaghastighed og Ca2+-håndtering, vurderet på forskellige tidspunkter (figur 2). Calciumtransiente parametre såsom stigningstid, spidsbelastningstid, henfaldstid og calciumtransient varighed (CTD90) blev evalueret som angivet i figur 2A,B. Procentdelen af at slå CS'er er den samme i de første 3 uger efter generationen, men faldt signifikant i uge 6 (Wk6) CS'er (figur 2C). Slagfrekvensen blev signifikant reduceret ved Wk3 sammenlignet med Wk1 og, svarende til procentdelen af slag-CS'er, faldt dramatisk ved Wk6 (figur 2D). Ved Wk6 blev CS-forringelse observeret, hvilket kan forklare faldet i både slagfrekvensen og antallet af slag-CS'er. Måling af calciumtransiente parametre indikerede en signifikant højere topværdi ved Wk2 (figur 2E), mens stigningstid, henfaldstid og CTD90 blev signifikant øget ved Wk3 sammenlignet med Wk1 (figur 2F-H ). Samlet set viser disse resultater, at hiPSC-CM-afledte sfæroider er funktionelt optimale omkring uge 2 og 3 efter generation.

Figur 3 viser effekten af sfærisk størrelse på slagfrekvensen og calciumhåndteringen. CS'er blev genereret ved såning af 2,5 x 10 4, 5 x 10 4, 10 x 10 4 og 20 x 10 4 hiPSC-CM'er i en brønd på en 96-brøndplade til i alt 24 CS'er / brønde pr. Tilstand (figur 3A). Som forventet steg sfæroidstørrelsen, da antallet af anvendte celler steg, fra 178 ± 36 μm til 351 ± 65 μm (figur 3A, højre panel). Ca2+ transienter blev målt i 3 uger gamle CS'er ved de fire forskellige såtætheder (figur 3B). Målinger af at slå CS'er viste, at kun ca. 50% af de mindre størrelse-CS'er (2.5K- og 5K-CS'er) slog, mens procentdelen af større størrelsesbankende CS'er (10K- og 20K-CS'er) var signifikant højere (ca. 85%) (figur 3C). En lignende slaghastighed (ca. 28 bpm) blev vist ved 5K-, 10K- og 20K-CS'er, hvilket var signifikant højere sammenlignet med 2.5K-CS'er (figur 3D). Topværdierne for calciumbilleder var ens under alle testede forhold (figur 3E), men stigningstiden (figur 3F), henfaldstiden (figur 3G) og CTD90 (figur 3H) blev signifikant øget i større størrelses-CS'er (10K- og 20K-CS'er) sammenlignet med de mindre (2,5K- og 5K-CS'er). Samlet set viser disse resultater, at hiPSC-CM-afledte sfæroider er optimale til screening af calciumhåndtering, når der anvendes en såtæthed mellem 10K- og 20K hiPSC-CM'er / brønd.

Dernæst evaluerede vi kryopræserveringens indvirkning på CS' levedygtighed og funktion. Før analysen blev optøede CS'er opretholdt i kultur i 1 uge (figur 4A). Som det fremgår af både flowcytometri (figur 4B) og Calcein-AM (figur 4C) cellelevedygtighedstest, påvirkede kryopræservering ikke cellelevedygtigheden inden for CS'erne. Derudover viste optøede CS'er lignende ekspressionsniveauer af sarkomeriske proteiner sammenlignet med de friske aldersmatchede CS'er (figur 4D). Disse data indikerer, at CS'er effektivt kan kryopræserveres til efterfølgende hjertefunktionsanalyse og screening med høj kapacitet.

Endelig blev slagaktiviteten og Ca2+-håndteringen målt i både friske og kryopræserverede CS'er (figur 5). Procentdelen af at slå CS'er blev målt på forskellige tidspunkter efter optøning henholdsvis ved 2, 5 og 7 dage. Mens de fleste af de friske CS'er viste slagaktivitet over tid, havde de kryopræserverede CS'er tydeligvis brug for op til 1 uges dyrkning for at genvinde deres slagaktivitet (figur 5B). Der var ingen signifikant ændring i slåraten for optøede CS'er versus friske; Der blev imidlertid ikke observeret nogen spontan slagaktivitet i nogle frosne CS'er (figur 5C). Selv om topværdierne blev signifikant reduceret i frosne/optøede CS'er sammenlignet med friske (figur 5D), blev der ikke observeret signifikante ændringer i stigningstid, henfaldstid og CTD90 for frosne/optøede CS'er sammenlignet med friske CS'er (figur 5E-G). Disse data indikerer, at det efter optøning er vigtigt at lade CS'erne komme sig i inkubatoren i mindst 1 uge, før de måler slagaktivitet og Ca2+ forbigående.

Samlet set viser disse resultater, at kryopræservering af hiPSC-CM-afledte sfæroider bevarer kardiomyocytlevedygtigheden, den sarkomeriske struktur og deres funktionelle egenskaber såsom spontan slagaktivitet og calciumhåndtering. Således repræsenterer hiPSC-CM-afledte sfæroider en passende model til nøjagtigt at rekapitulere hjerteelektrofysiologi in vitro.

Figure 1
Figur 1: Generering af hjertesfæroider . (A) Skematisk repræsentation af Wnt-baseret rettet hjertedifferentiering, den efterfølgende udvidelse af hiPSC-CM'er og generering af CS'er. Oprettet med biorender.com. (B) Bright-field billeder på forskellige tidspunkter af CS dyrkning. Vægtstang, 200 μm. Wk repræsenterer uge. C) Repræsentative immunfluorescensbilleder for hjertesarkomeriske proteiner α-actinin og troponin T i 3 uger gamle CS'er. Immunofluorescens: Hoechst (blå), α-actinin (grøn) og troponin T (rød). Vægtstang, 200 μm. Det zoomede flettede billede til højre viser sarkomerorganisationen. Skalabjælke, 50 μm. (D) Flowcytometrikvantificering af α-actinin-positive celler før (dag 0) og 3 uger efter dannelsen af CS'er. (n = 14-23 pr. Tilstand. E) RT-qPCR udført på hiPSC-CM'er dyrket i 90 dage (2D) og sfæroidprøver dyrket i 42 dage for at fastslå ekspressionsniveauer af forskellige hjertegener relateret til cellekryds, mellemliggende filamenter og mitokondrier. (n = 1-3 partier). Data repræsenteres som gennemsnit ± SD. NS (ikke-signifikant) beregnet ved en uparret t-test. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Slaghastighed og calciumhåndtering i CS'er i forskellige uger efter generering. (A) Eksempler på calciumtransiente parametre beregnet af Vala sciences-analysealgoritmen i Cyteseer Software. B) Repræsentative calciumtransientspor og timelapse-billeder af CS'erne på forskellige tidspunkter (uger) efter generationen. Skalabjælke, 200 μm. (C) Tidsforløbskvantificering af spontan slagaktivitet udtrykkes som procentdelen af slag-CS'er. (D) Slagfrekvens for CS'er i dyrkningstiden. (E-H) Kvantificering af calciumtransienterne, der viser topværdi, stigningstid, henfaldstid og CTD90. De viste data er gennemsnitlige ± SD. Biologiske replikater = tre, tekniske replikater = henholdsvis 38, 50, 66 og 7. *p < 0,05, ****p < 0,001; envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-sammenligningstest. Forkortelser; CTD = calcium forbigående varighed, Wk = uge, CS'er = humane hjertesfæroider. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Slaghastighed og calciumhåndtering i CS'er genereret ved hjælp af forskellige cellesåningstætheder. (A) Bright-field imaging (venstre) og størrelsesmålinger (højre) af CS'er genereret ved hjælp af forskellige antal hiPSC-CM'er. Skalabjælke, 200 μm. (B) Repræsentative calciumtransientspor og time-lapse-billeder af 2,5K-20K-CS'erne. (C,D) Slå procent og slå sats på 2.5K-20K-CS'er. (E-H) Topværdi, stigningstid, henfaldstid og CTD90 i 2.5K-20K-CS'er. Data er gennemsnitlige ± SD. Biologiske replikater = tre, tekniske replikater = 28-39. *p < 0,05, ****p < 0,001; envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-sammenligningstest. Forkortelser: CTD = calcium transient varighed, Wk = uge, k = x 1.000 celler, CS'er = hjertesfæroider. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4. Effekt af kryopræservering på hjertesfæroiders levedygtighed og struktur. (A) Skematisk repræsentation af CS-generering, efterfølgende biobank og optøning. (B) Flowcytometricellelevedygtighedstest i både friske og kryopræserverede CS'er. Som en positiv kontrol blev der anvendt en behandling med 10% Triton-X opløsning i 5 min. (n = 4 pr. betingelse). Data er repræsenteret som gennemsnit ± SD. ** **p < 0,001; envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-sammenligningstest. (C) Calcein-AM-cellelevedygtighedstest i friske versus optøede CS'er efter 7 dages dyrkning (n = 15-17 pr. tilstand, *** *p < 0,001, ved parret t-test; skalastang, 200 μm). D) Repræsentativ bright-field (venstre) og immunofluorescensfarvning for α-actinin og troponin T-ekspression i friske og optøede CS'er. Immunofluorescens: Hoechst (blå), α-actinin (grøn) og troponin T (rød). De flettede billeder til højre viser sarkomerstriber i CS'erne. Skalabjælke, 50 μm. Forkortelser: X = optøningsdag efter eget valg, PI = propidiumiodid, Cal-AM = calcein-AM, EthD-I = Ethidium Homodimer I. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Calciumtransienter i friske versus optøede CS'er. (A) Repræsentative calciumtransientspor og timelapse-billeder af CS'erne før kryopræservering og 1 uge efter optøning. (B) Slagprocent af friske og frosne/optøede hjertesfæroider. Søjler repræsenterer individuelle eksperimenter. (C) Slagrate for friske og frosne/optøede hjertesfæroider. (D-G) Kvantificering af calciumtransiente parametre: topværdi, stigningstid, henfaldstid og CTD90. Data er gennemsnitlige ± SD. *p < 0,05, ****p < 0,001; envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post hoc multiple-sammenligningstest. Forkortelser; CTD = calcium forbigående varighed, CS'er = hjertesfæroider. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur 1: Repræsentative gatingstrategier til flowcytometrianalyse. (A) Repræsentativ gating-strategi for α-actininpositive hiPSC-CM'er i en ren population versus negativ kontrol og isotypekontrol. Antallet af α-actinin-positive analyserede celler er 25 x 105. Forkortelser; SSC = sidespredning, PI+ = propidiumiodid positiv. (B) Repræsentativ gating-strategi for rentabilitetsanalysen i både frisk, optøet, positiv kontrol (Triton-X) og negativ kontrol (ufarvet). Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Opdagelse af hjertemedicin hæmmes af en afhængighed af ikke-menneskelige dyre- og cellulære modeller med utilstrækkelig gennemstrømning og fysiologisk troskab til nøjagtigt at udføre aflæsninger. hiPSC-CM-biologi kombineret med HT-instrumentering og fysiologiske sonder har potentialet til at genindføre humane modeller i de tidligste stadier af hjertesygdomsmodellering og lægemiddelopdagelse. Vi udviklede en 3D-metode til generering af hjertevæv, der producerer funktionelle CS'er af høj kvalitet til en optimal hjertesygdomsmodellering og lægemiddelscreeningsplatform. Derudover giver kombinationen af sfæroidteknologien i 3D-bioreaktorsystemer til industriel EV-produktion mulighed for et nødvendigt skridt mod klinisk oversættelse af EV-baseret terapi. Metoden beskrevet her er afhængig af flere afgørende faktorer og er en variant af eksisterende protokoller 9,10,28,29. Disse metoder omfatter: 1) generering af 3D-vævskonstruktioner, 2) det optimale celleantal og timing før screeningen, 3) forbedring af instrumenternes følsomhed og høje gennemstrømningskapacitet og 4) at kunne fryse sfæroiderne før enhver funktionel analyse. I modsætning til tidligere beskrevne protokoller beskriver den foreslåede protokol generering af op til 1.500 sfæroider om dagen og egnetheden til HTS. Konventionel analyse af hundrede forbindelser over 6 x 0,5 logdoser til 10 replikater ved hjælp af eksisterende 96-brønds calciumbilleddannelsessystemer eller 24-godt multiplekset konstrueret hjertevæv kræver ca. 500 millioner til 3 milliarder hiPSC-CM'er31,32. Den foreslåede anvendelse gør hjertescreeninger billigere og tidseffektive sammenlignet med de konventionelle systemer, da pladerne med 96 brønde kun krævede 10% af såtætheden sammenlignet med den beskrevne metode. Sammenlignet med tidligere protokoller, såsom hængedråbemetoden, muliggør genereringen af sfæroider ved selvaggregering i ultralave fastgørelsesplader desuden automatiseret billeddannelse af enkelt mikrovæv af høj kvalitet33.

Denne lille 3D-model efterligner den biologiske og fysiologiske fænotype i in vivo kardiovaskulært miljø. Som tidligere påvist øges calciumtransienter dramatisk i 3D-hjertevævskonstruktioner sammenlignet med 2D-enkeltlagscellekulturer34.

Dernæst fandt vi, at såtætheden og korrekt dyrkningstid også er kritiske faktorer for en vellykket CS-screening. Tætheden af 10K-20K hiPSC-CM'er pr. sfæroid og screening mellem uge 2-3 efter generation var optimal, mens for små eller for gamle sfæroider viser forstyrret calciumhåndtering (figur 2 og figur 3). Derfor er det vigtigt at opretholde såtætheder så konsistente som muligt, da størrelsen påvirker de funktionelle parametre. Selvom denne optiske metode giver gode resultater for levende 3D-kulturer som et helt væv, er det udfordrende at indhente data inden for større sfæroider på (sub-) cellulært niveau uden at stole på tidskrævende histologimetoder. For nylig er der offentliggjort flere tilgange, der brugte "optisk clearing", som muliggør erhvervelse af hele 3D-sfæroider med mulighed for enkeltcellekvantificering af markører. Her tilpassede vi en 3-dages protokol fra CS-høst til billedanalyse, som er optimeret til 3D-billeddannelse ved hjælp af konfokalmikroskopi29 (figur 1C og figur 4D).

Endelig, med stigningen i 3D-hjertevævsapplikationer og kommercielle applikationer, stiger efterspørgslen efter langtidsopbevaring og patientspecifik biobank fra forskellige donorer. Kryopræservering er en effektiv strategi til at generere HTS-plader fra flere batcher over tid. Frysning af hiPSC-CM'er er beskrevet tidligere og adskiller sig ikke fra andre dyrkede celletyper 10,35,36. For nylig er tilgange til frysning af plader med 2D-celler blevet beskrevet37. Her fandt vi, at PSC-kryopræserveringssættet er den mest optimale tilstand sammenlignet med tre andre (data ikke vist) og brugte dette medium til effektiv frysning af sfæroider. Efter kryopræservering forbliver levedygtigheden høj (figur 4B, C), men CS'ernes elektrofysiologiske egenskaber påvirkes, og der kræves en inkubationsperiode efter optøning. Faktisk viste CS'er 1 uge efter optøning spontan slagaktivitet og calciumhåndtering. Det er imidlertid blevet beskrevet, at friske og genvundne hiPSC-CM'er ikke altid udviser identiske molekylære og fysiologiske egenskaber38. Denne begrænsning skal overvejes, når kryopræserverede hiPSC-CM'er anvendes til vurdering af lægemiddelinducerede hjerteaflæsninger. Selvom vi effektivt modulerer antallet af celler pr. sfæroid og den optimale timing af calciumtransient billeddannelse, kunne hjertesfæroiderne forbedres ved at blande hiPSC-afledte kardiomyocytceller med endotelceller, fibroblaster, cellecellekrydsninger og ekstracellulære matricer, såsom chitosan, kollagen IV, fibronectin, matrigel eller laminin, der efterligner in vivo-hjertemiljøet 39, 40. Samlet set foreslår vi en trinvis protokol til effektivt at generere CS'er, der er egnede til downstream-applikationer såsom sygdomsmodellering og HT-lægemiddelscreening.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende VALA-videnskaberne for Cyteseer-softwarepakken og optimering af den automatiserede 3D-calciumanalyse. Vi ønsker at anerkende tilskud fra PLN Foundation (RM). P.A.D. og F.S. støttes af CUREPLaN Leducq. J.P.G.S. støttes af H2020-EVICARE (#725229) fra Det Europæiske Forskningsråd (ERC). J.W.B. støttes af UMC Utrecht Clinical Fellowship, Netherlands Heart Institute Fellowship og CVON-Dosis young talent grant; Nederlandske Heart Foundation (CVON-Dosis 2014-40). N.C. støttes af gravitationsprogrammet "Materials Driven Regeneration" af den nederlandske organisation for videnskabelig forskning (RegmedXB #024.003.013) og Marie Skłodowska-Curie-aktionerne (tilskudsaftale RESCUE #801540). V.S.-P. støttes af Alliance Fund (UMCU, UU, TU/e). A.v.M. er støttet af det EU-finansierede projekt BRAVE (H2020, ID:874827)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 wells suspenion plate  Corning  3738
96 wells Ultra-Low Attachment Multiple Well Plate Corning CLS3474-24EA
Albumax Thermo Fisher Scientific 11020021
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) antibody Sigma-Aldrich A7811 Dilution: 1:200
Anti-Cardiac Troponin T antibody (ab45932) Abcam ab45932 Dilution: 1:200
Ascorbic acid  Sigma-Aldrich A8960
B-27 supplement  Thermo Fisher Scientific 17504-044
Biotin Sigma-Aldrich B4639
Bovine serum albumin fraction V (BSA) Roche 10735086001
Cal-520, AM  Abcam ab171868
Confocal microscope Leica  DMi8 
Confocal microscope software  Leica  Las X
Conical tubes 15 mL Greiner Bio-One 5618-8271
Creatine monohydrate  Sigma-Aldrich C3630
DAPI  Thermo Fisher Scientific D3571 Concentration: 1 µg/mL
DMEM no glucose  Thermo Fisher Scientific 11966025
EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020
Fructose  Sigma-Aldrich 76050771.05
Glucose Sigma-Aldrich G7021
Glycerol Boom 76050771.05
Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 Invitrogen A11029 Dilution: 1:500
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 Invitrogen A11011 Dilution: 1:500
Horizontal shaker IKA 4003000
Human induced pluripotent stem cell lines (Stanford Cardiovascular Institute (S-CVI) Biobank) CVI-273 (control 1)
Human induced pluripotent stem cell lines Germany  141 (control 2) 144 (control 3)
Hydrochloric acid (HCl)  Ajax Firechem 265.2.5L-PL 10 M stock solution, corrosive
Isotype control, FITC mouse IgM κ isotype BD 556652
KnockOut Serum Replacement  Thermo Fisher Scientific 10828 Protect from light
L-carnitine Sigma-Aldrich C0283
Myocyte calcium and contractility system Leica  Thunder, DMi8
Non essential amino acids (NEAA) Thermo Fisher Scientific 11140
Paraformaldehyde solution 4% in 1x PBS, pH 7.0–7.6 Santa Cruz SC281692 Hazardous
PBS, pH 7.4 Thermo Fisher Scientific 10010023
Penicillin/streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140
PES Membrane Vacuum Filter system Corning  431097
PI/RNase Staining Solution Invitrogen F10797 Dilution: 1:1000
Pluronic F-127 Sigma-Aldrich P2443
PSC Cryopreservation Kit Thermo Fisher Scientific A2644601
RevitaCell Thermo Fisher Scientific A2644501
RPMI 1640 medium  Thermo Fisher Scientific 11875
Silicone Elastomer Kit SYLGARD 184
Sodium dodecyl sulfate solution (10%) Sigma-Aldrich 71736
Sodium L-Lactate Sigma-Aldrich 71718
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Tris Fisher  Scientific  11486631
Triton X-100 Merck X100-1L Hazardous
Trypan blue solution, 0.4% Thermo Fisher Scientific 15250061
TrypLE Select Enzyme (10x) Thermo Fisher Scientific A1217701
Tween-20  Sigma-Aldrich P1379
Urea  Sigma-Aldrich 51456
Vitamin B12 Sigma-Aldrich V6629
Y-27632 dihydrochloride (Rho-kinase inhibitor) Tocris  1254 Protect from light

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Burridge, P. W., et al. Chemically defined and small molecule-based generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  2. Kattman, S. J., et al. Stage-specific optimization of activin/nodal and BMP signaling promotes cardiac differentiation of mouse and human pluripotent stem cell lines. Cell Stem Cell. 8 (2), 228-240 (2011).
  3. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  4. Paige, S. L., et al. Endogenous Wnt/beta-catenin signaling is required for cardiac differentiation in human embryonic stem cells. PLoS One. 5 (6), 11134 (2010).
  5. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  6. Ahmed, R. E., et al. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 19 (8), 178 (2020).
  7. Liu, C., et al. Generating 3D human cardiac constructs from pluripotent stem cells. EBioMedicine. 76, 103813 (2022).
  8. Musunuru, K., et al. Induced pluripotent stem cells for cardiovascular disease modeling and precision medicine: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation: Genomic and Precision Medicine. 11 (1), 000043 (2018).
  9. Buikema, J. W., et al. Wnt activation and reduced cell-cell contact synergistically induce massive expansion of functional human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 27 (1), 50-63 (2020).
  10. Maas, R. G. C., et al. Massive expansion and cryopreservation of functional human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell STAR Protocols. 2 (1), 100334 (2021).
  11. Tremblay, C., et al. A new construction technique for tissue-engineered heart valves using the self-assembly method. Tissue Engineering Part C: Methods. 20 (11), 905-915 (2014).
  12. Lewis-Israeli, Y. R., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12 (1), 5142 (2021).
  13. Goldfracht, I., et al. Engineered heart tissue models from hiPSC-derived cardiomyocytes and cardiac ECM for disease modeling and drug testing applications. Acta Biomaterialia. 1 (92), 145-159 (2019).
  14. Fleischer, S., et al. Comprehensive human stem cell differentiation in a 2D and 3D mode to cardiomyocytes for long-term cultivation and multiparametric monitoring on a multimodal microelectrode array setup. Biosensors and Bioelectronics. 126, 624-631 (2019).
  15. Branco, M. A., et al. Transcriptomic analysis of 3D cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells reveals faster cardiomyocyte maturation compared to 2D culture. Science Reports. 9 (1), 9229 (2019).
  16. Ergir, E., et al. Generation and maturation of human iPSC-derived cardiac organoids in long term culture. bioRxiv. , (2022).
  17. Lemoine, M. D., et al. Human iPSC-derived cardiomyocytes cultured in 3D engineered heart tissue show physiological upstroke velocity and sodium current density. Scienctific Reports. 7 (1), 5464 (2017).
  18. Kofron, C. M., et al. A predictive in vitro risk assessment platform for pro-arrhythmic toxicity using human 3D cardiac microtissues. Science Reports. 11 (1), 10228 (2021).
  19. Giacomelli, E., et al. Human-iPSC-derived cardiac stromal cells enhance maturation in 3D cardiac microtissues and reveal non-cardiomyocyte contributions to heart disease. Cell Stem Cell. 26 (6), 862-879 (2020).
  20. Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
  21. Tenreiro, M. F., et al. Next generation of heart regenerative therapies: progress and promise of cardiac tissue engineering. npj Regenerative Medicine. 6 (1), 30 (2021).
  22. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circulation Research. 107 (1), 35-44 (2010).
  23. McDermott-Roe, C., et al. Investigation of a dilated cardiomyopathy-associated variant in BAG3 using genome-edited iPSC-derived cardiomyocytes. Journal of Clinical Investigation Insight. 4 (22), 128799 (2019).
  24. National Library of Medicine (U.S.). Safety and efficacy of induced pluripotent stem cell-derived engineered human myocardium as biological ventricular assist tissue in terminal heart failure. National Library of Medicine. , Identifier NCT04396899 (2020).
  25. Ronaldson-Bouchard, K., et al. Advanced maturation of human cardiac tissue grown from pluripotent stem cells. Nature. 556 (7700), 239-243 (2018).
  26. Oh, J. G., et al. Generation of ventricular-like HiPSC-derived cardiomyocytes and high-quality cell preparations for calcium handling characterization. Journal of Visualized Experiments. 155, 60135 (2020).
  27. Lian, X., et al. Directed cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells by modulating Wnt/β-catenin signaling under fully defined conditions. Nature Protocols. 8 (1), 162-175 (2013).
  28. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  29. van Ineveld, R. L., et al. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
  30. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: New phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  31. Ding, B., et al. Three-dimensional renal organoids from whole kidney cells: Generation, optimization, and potential application in nephrotoxicology in vitro. Cell Transplantation. 29, 963689719897066 (2020).
  32. Denning, C., et al. Cardiomyocytes from human pluripotent stem cells: From laboratory curiosity to industrial biomedical platform. Biochimica Biophysica Acta. 1863, 1728-1748 (2016).
  33. Amaral, R. L. F., et al. Comparative analysis of 3D bladder tumor spheroids obtained by forced floating and hanging drop methods for drug screening. Frontiers in Physiology. 8, 605 (2017).
  34. Daily, N. J., et al. Improving cardiac action potential measurements: 2D and 3D cell culture. Journal of Bioengineering and Biomedical Science. 5 (3), 168 (2015).
  35. Preininger, M. K., et al. Cryopreservation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: Strategies, challenges, and future directions. Advances in Experimental Medicine and Biology. 951, 123-135 (2016).
  36. Kim, Y. Y., et al. Cryopreservation of human embryonic stem cells derived-cardiomyocytes induced by BMP2 in serum-free condition. Reproductive Science. 18 (3), 252-360 (2011).
  37. Daily, M. I., et al. Cryopreservation of primary cultures of mammalian somatic cells in 96-well plates benefits from control of ice nucleation. Cryobiology. 93, 62-69 (2020).
  38. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  39. Yeh, H. -Y., et al. The calcium-dependent regulation of spheroid formation and cardiomyogenic differentiation for MSCs on chitosan membranes. Biomaterials. 33 (35), 8943-8954 (2012).
  40. Scalise, M., et al. From spheroids to organoids: The next generation of model systems of human cardiac regeneration in a dish. International Journal of Molecular Sciences. 22 (24), 13180 (2021).

Tags

Bioengineering nr. 193
Generering, high-throughput screening og biobanking af menneskeskabte pluripotente stamcelleafledte hjertesfæroider
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Maas, R. G. C., Beekink, T.,… More

Maas, R. G. C., Beekink, T., Chirico, N., Snijders Blok, C. J. B., Dokter, I., Sampaio-Pinto, V., van Mil, A., Doevendans, P. A., Buikema, J. W., Sluijter, J. P. G., Stillitano, F. Generation, High-Throughput Screening, and Biobanking of Human-Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiac Spheroids. J. Vis. Exp. (193), e64365, doi:10.3791/64365 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter