Summary
이 기사는 유전자 코드 확장(GCE) 부위 특이적 표지를 사용하여 살모넬라균 분비 이펙터에 라벨을 붙이고 직접 확률적 광학 재구성 현미경(dSTORM)을 사용하여 HeLa 세포에서 분비된 단백질의 세포 내 국소화를 이미지화하는 간단하고 명확한 프로토콜을 제공합니다
Abstract
유형 3 분비 시스템(T3SSs)은 그람 음성 박테리아가 진핵 숙주 세포의 세포질에 직접 이펙터 단백질 배터리를 주입할 수 있도록 합니다. 진입 시 주입된 이펙터 단백질은 진핵 생물 신호 전달 경로를 협력적으로 조절하고 세포 기능을 재프로그래밍하여 박테리아 진입 및 생존을 가능하게 합니다. 감염의 맥락에서 이러한 분비된 이펙터 단백질을 모니터링하고 국소화하는 것은 숙주-병원체 상호작용의 동적 인터페이스를 정의하기 위한 발자국을 제공합니다. 그러나 숙주 세포의 구조/기능을 방해하지 않고 박테리아 단백질을 표지하고 이미징하는 것은 기술적으로 어렵습니다.
형광 융합 단백질을 구성하는 것은 융합 단백질이 분비 장치를 방해하여 분비되지 않기 때문에 이 문제를 해결하지 못합니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해 우리는 최근 유전자 코드 확장(GCE)을 사용하여 박테리아 분비 이펙터 및 기타 라벨링하기 어려운 단백질의 부위 특이적 형광 라벨링 방법을 채택했습니다. 이 논문은 GCE 부위를 사용하여 살모넬라 분비 이펙터를 라벨링하는 완전한 단계별 프로토콜을 제공한 다음 직접 확률적 광학 재구성 현미경(dSTORM)을 사용하여 HeLa 세포에서 분비된 단백질의 세포내 국소화를 이미징하는 지침을 제공합니다
최근 연구 결과에 따르면 GCE를 통한 비표준 아미노산(ncAA)의 통합에 이어 테트라진 함유 염료를 사용한 생체 직교 표지는 박테리아 분비 단백질의 선택적 표지 및 시각화 및 숙주에서의 후속 이미지 분석을 위한 실행 가능한 기술입니다. 이 기사의 목표는 박테리아와 바이러스의 다양한 생물학적 과정과 숙주-병원체 상호 작용을 연구하기 위해 GCE를 사용하여 초고해상도 이미징을 수행하는 데 관심이 있는 조사자가 사용할 수 있는 간단하고 명확한 프로토콜을 제공하는 것입니다.
Introduction
박테리아 감염은 오랫동안 인체 건강에 심각한 위험으로 간주되어 왔습니다. 병원체는 숙주 면역 반응을 회피하고 감염을 확립하기 위해 다양한 박테리아 독성 인자(이펙터 단백질이라고 함)뿐만 아니라 고도로 진화되고 매우 강력하며 복잡한 방어 시스템을 사용합니다 1,2. 그러나, 이러한 시스템의 기초가 되는 분자 메커니즘과 개별 이펙터 단백질의 역할은 병인 동안 숙주 세포에서 중요한 단백질 성분 및 이펙터를 직접 따르기 위한 적절한 접근법의 부족으로 인해 여전히 거의 알려지지 않았습니다.
한 가지 전형적인 예는 급성 위장염을 유발하는 Salmonella enterica serovar Typhimurium입니다. 살모넬라균 Typhimurium은 유형 3 분비 시스템 (T3SS)을 사용하여 다양한 이펙터 단백질을 숙주 세포에 직접 주입합니다. 살모넬라균은 숙주 세포에 들어가자마자 살모넬라균 함유 액포(SCV)라고 하는 산성 막 결합 구획에 존재합니다.3,4. SCV의 산 pH는 살모넬라 병원성 섬 2(SPI-2)로 인코딩된 T3SS를 활성화하고 액포막을 가로질러 20개 이상의 이펙터 단백질의 발리를 숙주 세포질 5,6,7,8로 전위시킵니다. 숙주 내부에서, 이펙터 단백질의 이러한 복잡한 칵테일은 숙주 세포 신호 전달 경로를 조정하여 살모넬라 유도 필라멘트(SIF)라고 하는 미세소관을 따라 SCV에서 확장된 매우 역동적이고 복잡한 관형 막 구조를 형성하여 살모넬라균이 숙주 세포 내에서 생존하고 복제할 수 있도록 합니다9,10,11.
박테리아 이펙터 국소화를 시각화, 추적 및 모니터링하고 숙주 세포 내부의 트래피킹 및 상호 작용을 조사하는 방법은 박테리아 발병을 뒷받침하는 메커니즘에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다. 숙주 세포 내에서 살모넬라균 분비 T3SS 이펙터 단백질의 표지 및 국소화는 기술적 과제임이 입증되었습니다12,13; 그럼에도 불구하고 유전적으로 암호화된 형광 단백질의 개발은 살아있는 시스템 내에서 단백질을 연구하고 시각화하는 우리의 능력을 변화시켰습니다. 그러나 형광 단백질의 크기(~25-30 kDa)15는 종종 관심 단백질의 크기와 비슷하거나 더 큽니다(POI; 예: SsaP의 경우 13.65 kDa, SifA의 경우 37.4 kDa). 실제로, 이펙터의 형광 단백질 표지는 종종 표지된 이펙터의 분비를 차단하고 T3SS14를 방해합니다.
또한, 형광 단백질은 덜 안정적이고, 광표백 전에 적은 수의 광자를 방출하여, 초해상도 현미경 기술(16,17,18), 특히 광활성화 국소화 현미경(PALM), STORM 및 자극 방출 고갈(STED) 현미경에서의 사용을 제한한다. 유기 형광 염료의 광물리적 특성은 형광 단백질의 광물리적 특성보다 우수하지만, CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 및 HA-Tags 24,25와 같은 방법/기술은 번역 후 변형 또는 트래피킹을 방해하여 관심 있는 이펙터 단백질의 구조-기능을 손상시킬 수 있는 추가 단백질 또는 펩타이드 부속물을 필요로 합니다. 필요한 단백질 변형을 최소화하는 대체 방법은 GCE를 통한 번역 중에 ncAA를 POI에 통합하는 것입니다. ncAA는 형광성이거나 클릭 화학 12,13,26,27,28을 통해 형광으로 만들 수 있습니다.
GCE를 사용하면 작고 기능적인 생체 직교 그룹(예: 아자이드, 사이클로프로펜 또는 사이클로옥틴 그룹)을 가진 ncAA를 표적 단백질의 거의 모든 위치에 도입할 수 있습니다. 이 전략에서, 천연 코돈은 POI의 유전자의 특정 위치에서 호박 (TAG) 정지 코돈과 같은 희귀 코돈으로 스왑된다. 변형된 단백질은 직교 아미노아실-tRNA 합성효소/tRNA 쌍과 함께 세포에서 연속적으로 발현됩니다. tRNA 합성효소 활성 부위는 하나의 특정 ncAA만을 수용하도록 설계되며, 이는 호박색 코돈을 인식하는 tRNA의 3'-말단에 공유 결합됩니다. ncAA는 단순히 성장 배지에 도입되지만 세포에 흡수되어 아미노아실-tRNA 합성효소(aaRS)가 직교 tRNA에 연결할 수 있는 세포질에 도달해야 합니다. 그런 다음 지정된 위치의 POI에 통합됩니다(그림 1 참조)12. 따라서, GCE는 케톤, 아자이드, 알킨, 시클로옥틴, 트랜스시클로옥텐, 테트라진, 노르보넨, α, β-불포화 아미드 및 비시클로[6.1.0]-노닌과 같은 과다한 생체 직교 반응성 그룹의 부위 특이적 통합을 가능하게 하여 잠재적으로 기존의 단백질 표지 방법 12,26,27,28의 한계를 극복합니다.
초고해상도 이미징 기술의 최근 새로운 트렌드는 분자 수준에서 생물학적 구조를 조사할 수 있는 새로운 길을 열었습니다. 특히, 단일 분자, 국소화 기반, 초분해능 기술인 STORM은 세포 구조를 ~20-30nm까지 시각화하는 데 매우 유용한 도구가 되었으며, 한 번에 한 분자씩 생물학적 과정을 조사할 수 있어 기존의 앙상블 평균 연구에서는 아직 알려지지 않은 세포 내 분자의 역할을 발견할 수 있습니다13 . 단일 분자 및 초분해능 기술에는 최상의 분해능을 위해 밝고 광안정성이 있는 유기 형광단이 있는 작은 태그가 필요합니다. 우리는 최근에 GCE가 초고해상도 이미징12에 적합한 프로브를 통합하는 데 사용될 수 있음을 입증했습니다.
세포에서 단백질 표지를 위한 최선의 선택 중 두 가지는 바이사이클로[6.1.0] 노니넬리신(BCN) 및 트랜스-사이클로옥텐-라이신(TCO, 그림 1에 표시됨)이며, 이는 tRNA/합성효소 쌍(여기서는 tRNA Pyl/PylRS AF라고 함)의 변이체를 사용하여 유전적으로 암호화될 수 있으며, 여기서Pyl은 피롤리신을 나타내고AF는 자연적으로 피롤리신12를 암호화하는 Methanosarcina mazei에서 파생된 합리적으로 설계된 이중 돌연변이(Y306A, Y384F)를 나타냅니다. 29,30,31. 균주 촉진 역 전자 수요 Diels-Alder 고리 첨가 (SPIEDAC) 반응을 통해 이러한 아미노산은 테트라 진 접합체와 화학 선택적으로 반응합니다 (그림 1) 12,30,31. 이러한 고리첨가 반응은 매우 빠르고 살아있는 세포와 호환됩니다. 이들은 또한 적절한 형광단이 테트라진 잔기 12,26,32로 기능화되는 경우 형광성일 수 있다. 이 논문은 GCE를 사용하여 숙주 세포로 전달되는 박테리아 이펙터의 역학을 모니터링한 후 dSTORM을 사용하여 HeLa 세포에서 분비된 단백질의 세포 내 국소화를 모니터링하기 위한 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 결과는 GCE를 통한 ncAA의 통합에 이어 형광 생성 테트라진 함유 염료와의 클릭 반응이 선택적 라벨링, 분비된 단백질의 시각화 및 숙주에서의 후속 세포 내 국소화를 위한 다양한 방법을 나타낸다는 것을 나타냅니다. 그러나 여기에 설명 된 모든 구성 요소와 절차는 GCE 시스템이 다른 생물학적 질문을 조사하도록 조정할 수 있도록 조정하거나 대체 할 수 있습니다.
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Protocol
1. 플라스미드 구성
- POI를 발현하는 유전자를 대장균 BL21(DE3)에서 POI를 발현하는 발현 플라스미드(예: pET28a-sseJ 10TAG)로 클로닝합니다. 이 단계는 돌연변이체가 기능적인지 결정하는 것을 용이하게 합니다.
- 숙주 세포에서 살모넬라 분비 이펙터의 시각화를 위해, 이전 보고서 7,12,24에 설명된 바와 같이, 그의 천연 프로모터의 제어 하에 표적 POI SseJ를 발현하는 발현 플라스미드 (pWSK29-sseJ-HA)를 구축한다. 부위 지정 돌연변이 유발을 사용하여 페닐알라닌-10의 코돈을 SseJ(pWSK29-sseJ 10TAG-HA)의 호박색 코돈(TAG)으로 대체하여 AAT-TAG-ACT 모티프 33,34를 보장합니다.
- 위의 플라스미드 외에도 트랜스-사이클로옥트-2-엔-L-라이신(TCO*A)을 POI에 유전적으로 통합하기 위해 플라스미드 pEVOL에 암호화된 진화된 tRNA/합성효소 쌍(tRNAPyl/PylRS AF) 유전자를 포함하는 다른 발현 플라스미드(pEVOL-PylRS-AF)31를 사용합니다.
참고: 플라스미드 및 클로닝 프로토콜에 대한 상세한 설명은 이전 보고서30,31에 기재되어 있다. - 시중에서 판매되는 플라스미드 준비 키트를 사용하여 고품질 플라스미드 DNA를 얻을 수 있습니다. 정제된 DNA의 경우 최적의 260/280 비율은 ~1.8입니다. 필요한 경우 1% 아가로스 겔 전기영동을 사용하여 DNA 순도를 확인합니다.
2. 세균 배양 준비
- 돌연변이체가 대장균에서 기능적인지 테스트하기 위해 이중 형질전환체를 얻는 단계
- BL21 컴피턴트 셀을 -80°C에서 꺼내 약 20-30분 동안 얼음에서 해동합니다.
- 1.5mL 미세원심분리기 튜브에서 각 플라스미드 1–5μL(~50ng의 pEVOL-PylRS-AF 및 pET28a-sseJ 10TAG)를 화학적으로 유능한 BL21 세포 200μL와 혼합합니다. 유능한 세포와 플라스미드 혼합물을 부드럽게 혼합합니다. 얼음에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 마이크로 원심분리기 튜브를 42°C 수조에서 45초 동안 열충격을 가합니다. 튜브를 다시 얼음 위에 2분 동안 올려 놓습니다.
- 따뜻한 LB 배지 1mL를 미세 원심분리기 튜브에 넣고 혼합물을 15mL 원뿔형 튜브로 빠르게 옮깁니다. 세포를 37°C에서 250rpm의 진탕기에서 1시간 동안 배양합니다. 형질전환된 세포의 일부 또는 전부를 적절한 항생제가 함유된 LB 한천 플레이트에 플레이트한다. 플레이트를 37°C에서 밤새 인큐베이션한다.
참고: 이 프로토콜에서는 pEVOL-PylRS-AF 및 pET28a-sseJ 10TAG를 각각 선택하기 위해 35μg/mL 클로람페니콜과 50μg/mL 카나마이신을 사용했습니다. 변환 단계에서 음성 및 양성 대조군을 사용하여 성공적인 변환을 평가합니다.
- 숙주 세포에서 살모넬라균 분비 이펙터의 시각화를 위해 돌연변이를 살모넬라균으로 옮깁니다.
- 냉장된 미세원심분리기 튜브에 pEVOL-PylRS-AF 및 pWSK29-sseJ 10TAG를 각각 2–3μL의 전기적격 살모넬라 티피무리움 균주 14028s에 추가합니다. 혼합물을 피펫으로 부드럽게 섞는다.
- 전기천공 혼합물을 냉각된(0.2cm 전극 간격) 큐벳으로 옮기고; electroporation 설정을 2.5kV, 200 Ω, 25μF로 설정합니다. 큐벳을 전기 천공 챔버 내부에 놓습니다. 챔버 전극이 마이크로 펄서 큐벳과 단단히 접촉하는지 확인하십시오.
- 신호음이 울릴 때까지 펄스 버튼을 길게 누릅니다.
- 즉시 따뜻한 LB 배지 1mL를 큐벳에 추가합니다. 전체 내용물을 15mL 원뿔형 튜브에 옮깁니다. 세포를 37°C에서 250rpm으로 1시간 동안 진탕하면서 배양합니다.
- 살모넬라균의 전기천공 혼합물의 일부 또는 전부를 적절한 항생제가 들어 있는 LB 한천 플레이트에 플레이트합니다. 플레이트를 37°C에서 밤새 인큐베이션한다.
참고: 이 프로토콜에서는 각각 pEVOL-PylRS-AF 및 pWSK29-sseJ 10TAG의 선택에 35μg/mL 클로람페니콜과 100μg/mL 암피실린을 사용했습니다.
- 문화 준비
- 살모넬라균 또는 대장균의 단일 콜로니를 적절한 항생제가 포함된 LB 배지 5mL에 접종합니다. 37°C에서 하룻밤 동안 250rpm으로 진탕합니다.
3. ncAA 함유 단백질의 발현 및 형광 표지
- 대장균에서 ncAA 함유 단백질의 발현
- 1차 배양액 100μL를 35μg/mL 클로람페니콜 및 50μg/mL 카나마이신을 함유한 LB 배지 5mL(1:50 희석)에 옮긴 다음 OD600 이 0.4-0.6에 도달할 때까지 250rpm으로 진탕하면서 37°C에서 배양합니다.
- 1 mM TCO*A 원액(10 mL; 표 1).
- 배양액이 OD600 = 0.4–0.6에 도달하면 LB 배지를 1mM TCO*A, 35μg/mL 클로람페니콜 및 50μg/mL 카나마이신을 함유한 신선한 LB로 교체합니다.
참고: 또는 5.4.2단계에 설명된 대로 TCO*A 원액을 준비할 수 있습니다. - 1 mM IPTG, 0.2% 아라비노스의 존재 하에서 단백질 발현을 유도하고 34°C, 250 rpm에서 밤새 흔들어 줍니다. 박테리아 세포를 11,000 × g에서 5 분 동안 원심 분리하여 수확합니다. 상청액을 제거하고 추가 사용이 있을 때까지 펠릿을 -20°C에서 동결시킨다.
- 대조 실험의 경우 동일한 실험을 반복하되 ncAA가 없는 상태에서 ncAA 함유 단백질을 발현합니다. 대장균에서 ncAA 함유 단백질의 시험관 내 형광 표지의 경우 3.3단계에 설명된 세부 절차를 따르십시오.
- 살모넬라균에서 ncAA 함유 단백질의 발현
- 1차 배양액 100μL를 35μg/mL 클로람페니콜과 100μg/mL 암피실린을 함유한 5mL의 LB 배지(1:50 희석)에 옮긴 다음 OD600 이 0.6에 도달할 때까지 250rpm으로 진탕하면서 37°C에서 배양합니다.
- 표 1에 기재된 바와 같이 변형된 N-최소 배지(MgM, pH 5.6)를 준비한다.
- LB 배지를 1mM TCO*A가 보충된 변형된 N-최소 배지(MgM)로 교체합니다(표 1). 박테리아를 34°C에서 30분 동안 성장시킵니다. 그런 다음 0.2% 아라비노스, 25mg/mL 클로람페니콜 및 100mg/mL 암피실린을 추가하고 250rpm에서 진탕하면서 6시간 동안 세포를 성장시킵니다.
- 6시간 후, ncAA가 없는 신선한 MgM(pH 5.6) 배지(표 1)로 30분 간격으로 박테리아를 4배 세척합니다. 세척 단계에서 실온에서 15분 동안 972× g을 사용합니다.
- 박테리아를 원심분리하고, 1x PBS 완충액에 재현탁하고, 암실에서 4°C에서 1시간 동안 배양하여 과도한 ncAA를 제거합니다. 1시간 후, 박테리아를 3,000× g, 4°C에서 15분 동안 원심분리하고 추가 사용을 위해 보관합니다.
- 대조 실험의 경우, ncAA가 없는 상태에서 ncAA 함유 단백질을 발현하여 동일한 실험을 반복합니다.
- 살모넬라 티피무리움(Salmonella Typhimurium)에서 ncAA 함유 단백질의 시험관 내 형광 표지
- TCO*A(3.2단계부터)가 없거나 존재하는 상태에서 SseJ-F10TCO-HA를 발현하는 살모넬라 세포를 1x PBS에 재현탁합니다. PBS에서 OD600 을 4로 조정합니다. 어두운 곳에서 37°C에서 20μM Janelia Fluor 646-tetrazine(JF646-Tz) 또는 20μM BDP-Fl-tetrazine(DMSO의 5mM 원액)으로 세포를 배양하고 250rpm에서 1-2시간 동안 흔들어 줍니다.
- 세포를 펠렛화하고, 5% DMSO 및 0.2% Pluronic F-127을 함유한 PBS로 3-4x 세척하고, 5% DMSO를 함유한 PBS에 재현탁하고, 어둠 속에서 4°C에서 밤새 배양합니다. 2x PBS로 다시 1x 세척하십시오. 세척 단계에서, 972 × g을 실온에서 15분 동안 사용한다.
- 컨포칼 현미경을 사용하여 세포를 즉시 이미지화하거나 PBS에 1.5% 파라포름알데히드(PFA)로 30-45분 동안 실온에서 30-45분 동안 고정합니다.
- 고정된 세포를 PBS로 2x 세척하고 마지막으로 PBS 중의 50 mMNH4Cl에서 15분 동안 세척하여 과량의 PFA를 제거하였다. 세포를 PBS에 재현탁하고 4°C에서 3-4일 이상 보관하지 마십시오. 섹션 6에 설명된 대로 컨포칼 현미경을 사용하여 박테리아를 이미지화합니다.
4. ncAA 함유 단백질의 생화학적 특성 분석
- 세포 용해
- 용해 완충액(표 1)에서 섹션 3.1의 세포를 재현탁하고 실온에서 30분 이상 배양합니다. 혼합물을 얼음에서 15분 동안 식힙니다.
참고: 용해 완충액과 사용된 세포 중량 의 비율을 1:10으로 유지하십시오. - 얼음 위에 있는 동안 부유된 세포를 초음파 처리합니다. 초음파 처리기를 사용하여 설정 7에서 최소 6x, 1분 간격으로 30초 동안 펄스합니다(재료 표 참조).
- 세포 용해물을 20,500 × g, 4°C에서 15분 동안 스핀다운합니다(4°C를 유지하는 것이 중요함). 상청액을 새 튜브로 옮기고 펠릿을 버립니다.
- 용해 완충액(표 1)에서 섹션 3.1의 세포를 재현탁하고 실온에서 30분 이상 배양합니다. 혼합물을 얼음에서 15분 동안 식힙니다.
- SDS-PAGE 분석
- 5x SDS 로딩 염료를 준비합니다(표 1). 5 μL의 SDS 겔 로딩 버퍼를 13 μL의 세포 용해물에 추가합니다. 95°C에서 10분 동안 2mL 튜브에서 소듐 도데실 설페이트(SDS) 샘플 버퍼로 단백질을 변성시키고, 혼합물을 2,000× g 에서 50초 동안 원심분리하고, 12% SDS 폴리아크릴아미드 겔에 로드합니다.
- 겔 카세트를 조립하고 겔 전기 영동 장치에 넣고 전기 영동 장치를 전원 공급 장치에 연결합니다. 실행 중인 완충액을 붓고 분자량 마커와 단백질 샘플을 로드한 다음 브로모페놀이 분해 젤의 바닥에 도달할 때까지 100V에서 젤을 실행합니다.
참고: -20°C에서 보관된 용해물은 각 동결-해동 주기 후에 품질이 떨어지는 경향이 있으므로 즉시 분석을 시작하십시오. - 쿠마시 블루 단백질 염색으로 젤을 얼룩지게 합니다.
5. HeLa 세포에서 살모넬라 분비 이펙터 SseJ-F10TCO-HA의 생체 직교 표지
- 페니실린-스트렙토마이신(1x)에 10%(v/v) FBS가 보충된 고포도당(4.5g/L) Dulbecco's modified eagle 배지(DMEM)에서 HeLa 세포를 37°C, 5%CO2 및 95% 습도에서 배양 및 유지합니다.
- 감염 1일 전에 박테리아를 배양합니다. pEVOL-PylRS-AF 및 pWSK29-sseJ 10TAG를 함유한 단일 콜로니를 항생제 함유 표준 LB 배지 5mL에 37°C에서 하룻밤 동안 250rpm으로 진탕하여 접종합니다.
- 감염 1 일 전에 HeLa 세포를 시드합니다. 세포 밀도의 현미경 검사에 의해 결정된 바와 같이 ~80% 밀도로 HeLa 세포가 들어 있는 조직 배양 플라스크(T-75)를 취합니다. 따뜻한 PBS로 세포를 세척하십시오. 37°C, 5%CO2에서 5분 동안 따뜻한 0.25% 트립신/EDTA 3mL로 세포를 분리합니다.
- 2mL의 DMEM(+ 10% FBS)을 사용하여 트립신을 켄칭합니다. 세포를 재현탁한 후 플라스크의 전체 내용물을 15mL 튜브에 옮깁니다. 1,000 × g 에서 5분 동안 세포를 회전시킵니다. 튜브에서 상청액을 꺼냅니다. 예열된 성장 배지에 HeLa 세포 펠릿을 재현탁합니다.
- 혈구계를 사용하여 현탁액을 검사하고 존재하는 세포를 세십시오. 희석된 세포 스톡을 1 × 105 cells/mL로 준비합니다. 8웰 챔버 슬라이드에서 500μL의 DMEM + 10% FBS 성장 배지에서 웰당 0.5 ×10 5개의 HeLa 세포를 시드합니다. 챔버 슬라이드를 37°C, 5%CO2, 95% 습도의 인큐베이터에서 24시간 동안 보관한다.
- 세균 감염
- pEVOL-PylRS-AF 및 pWSK29-sseJ 10TAG를 함유한 계대배양 살모넬라 14028s, 100μL의 하룻밤 세균 배양(5.2단계부터)을 35μg/mL 클로람페니콜 및 100μg/mL 암피실린을 포함하는 LB 배지 3mL(1:30 희석)에 희석한 다음 37°C에서 250rpm으로 5-7시간 동안 진탕하여 배양합니다.
참고: 이 단계에서 배양은 후기 지수 단계에 도달하고 박테리아는 매우 침습적입니다. - 100mM TCO*A 원액과 전체 배지를 준비합니다(표 1).
- HeLa 세포 감염을 시작하려면 인큐베이터에서 HeLa 세포를 꺼내고 예열된 DPBS로 세포를 세척한 후 각 웰에 500μL의 신선한 DMEM(+10% FBS)을 추가합니다. 감염이 시작될 때까지 챔버 슬라이드를CO2 인큐베이터에 다시 놓습니다.
- 5-7시간의 배양 후, 살모넬라 배양물을 OD600 = 0.2 1mL의 DMEM 성장 배지(~3 × 108 cfu/mL)로 희석합니다. 감염 다중도(MOI)가 100이 되도록 챔버 슬라이드의 각 웰에 필요한 양의 살모넬라 접종물을 추가합니다.
- 감염된 세포를CO2 인큐베이터에서 30분 동안 인큐베이션한다. 예열된 DPBS로 세포를 3배 세척하여 세포외 살모넬라균을 제거합니다. 이 시점을 감염 후 0시간으로 설정합니다. 1시간 동안 100μg/mL 겐타마이신이 포함된 500μL의 완전한 배지(표 1)를 추가합니다. 1시간 후, 세포를 DPBS로 3배 세척한다. 500 μL의 완전 배지를 추가합니다 (단계 5.4.2; 표 1) 챔버 슬라이드의 각 웰에 0.2% 아라비노스, 10μg/mL 겐타마이신을 보충합니다.
- 대조 실험에서 TCO*A 없이 HeLa 세포의 유사한 감염을 수행합니다.
- 챔버 슬라이드를CO2 인큐베이터에서 10시간 동안 인큐베이션한다.
- pEVOL-PylRS-AF 및 pWSK29-sseJ 10TAG를 함유한 계대배양 살모넬라 14028s, 100μL의 하룻밤 세균 배양(5.2단계부터)을 35μg/mL 클로람페니콜 및 100μg/mL 암피실린을 포함하는 LB 배지 3mL(1:30 희석)에 희석한 다음 37°C에서 250rpm으로 5-7시간 동안 진탕하여 배양합니다.
- 살아있는 세포에서 화학 물질 기반 라벨링을 클릭합니다.
- 박테리아에 감염된 세포에 라벨을 붙입니다. TCO*A 없이 전체 배지를 예열합니다(표 1).
- 감염 후 10시간 후, 전체 배지를 TCO*A가 없는 새로운 완전 배지로 교체하고 예열된 DPBS로 각각 30분 간격으로 HeLa 세포를 4배 세척한 다음 새로운 완전 배지(TCO*A 없음)를 세척합니다.
- DMSO 중의 0.5 mM 염료-테트라진 원액을 준비한다.
참고: 숙주 세포에서 살모넬라균 분비 이펙터를 라벨링하기 위해 두 가지 프로토콜이 제시됩니다. 프로토콜 1의 경우, 최종 작업 용액이 2μM가 되도록 소 우유에서 1% 카제인 나트륨 염을 함유하는 1x PBS에 JF646-Tz 스톡을 희석하여 염료 혼합물을 준비합니다. 프로토콜 2의 경우 따뜻한 완전 배지(FBS 및 TCO*A 제외)를 준비하고 2μM JF646-Tz를 추가합니다. 각 라벨링 세션에 대해 이 염료 혼합물을 신선하게 만드십시오. 가능하면 어둠 속에서 작업하십시오(후드 및/또는 방의 조명을 어둡게 함). - 감염 후 12시간 후, 세포에서 배지를 흡인합니다. 예열 된 DPBS 2x 또는 3x로 세포를 세척하십시오. 웰의 한 그룹에서, 프로토콜 1에 기술된 염료 용액 혼합물 500 μL를 추가하고, 동일한 챔버 슬라이드의 또 다른 그룹에서, 단계 5.5.3에서 언급된 프로토콜 2에 기술된 염료 용액 혼합물 500 μL를 첨가하고 그 후에 참고한다. 챔버 슬라이드를 1.5-2시간 동안 CO2 인큐베이터에 다시 놓습니다.
- 감염 후 13.5-14시간 후, 예열된 DPBS로 HeLa 세포를 2배 헹굽니다. 500 μL의 신선한 DMEM(FBS로 보충)을 추가합니다. 챔버 슬라이드를 30분 동안 인큐베이터에 다시 넣습니다. 예열된 DPBS로 세포를 세척한 후 30분 간격으로 신선한 DMEM을 4배 세척합니다.
- 감염 후 16시간에 각 웰에 4% PFA 200μL를 첨가하고 실온에서 암실에서 10분 동안 배양하여 HeLa 세포를 PFA로 고정합니다. PFA를 흡인하고, PBS로 3x 헹구고, 세포를 어두운 곳에서 4°C의 PBS에 보관합니다.
알림: PFA는 독성이 강한 화학 물질입니다. 흡입과 피부 및 눈 접촉을 피하십시오. 취급 시 보호 장비를 착용하십시오. 라벨이 부착된 샘플이 빛에 노출되는 것을 방지하려면 세포 배양 후드의 조명을 끕니다.
- HA 태그 단백질의 면역염색
- PBS를 흡인하고 블로킹 용액으로 한 번 헹굽니다(표 1).
- 고정된 HeLa 세포를 PBS 기반 1차 항체 용액(표 1)과 함께 실온에서 암실에서 1시간 동안 배양한다. 토끼 항-HA 1차 항체를 사용하여 분비된 SseJ를 염색합니다(1:500 희석).
- 1시간 후, 0.5mL의 0.1% Tween-20/1x PBS로 세포를 2배 부드럽게 세척합니다. Tween/PBS 용액으로 세척하는 동안 세포를 0.5mL의 0.1% Tween20/1x PBS와 함께 5분 동안 3배 배양합니다.
- 2차 항체 당나귀 항토끼 555 1:500을 2차 항체 용액에 희석하고 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 배양한다.
- 1시간 후, 0.5mL의 0.1% Tween-20/1x PBS로 세포를 2배 부드럽게 세척하고 0.5mL의 0.1% Tween20/1x PBS로 5분 동안 2x 배양합니다.
- 세포를 0.5mL의 1x PBS로 3배 세척하고 암실에서 4°C에서 보관합니다.
참고: 고정 세포는 4°C의 PBS에서 2주 동안 보관할 수 있습니다. 면역 염색은 마지막 순간에 수행해야합니다.
6. 컨포칼 이미징
- 스피닝 디스크(SD) 또는 STED 현미경과 같은 컨포칼 현미경을 사용합니다.
- 스캔 모드(XYZ), 스캔 속도(400Hz), 해상도(512 x 512), 배율(100x) 및 Z 스태킹과 같은 이미지 획득 설정을 조정합니다.
- DAPI, BDP-Tz 및 JF646 테트라진에 대해 올바른 여기/방출 필터를 사용하십시오.
참고: 이 프로토콜의 경우 펄스 백색광 레이저가 장착된 STED 현미경 시스템에서 컨포칼 이미징을 수행하여 470-670nm 범위의 여기와 405nm, 405nm 및 405nm의 여기용 UV 647nm 다이오드 레이저를 선택할 수 있습니다. 적절한 방출 범위는 공초점 시스템의 프리즘 기반 조정 가능한 다중 대역 스펙트럼 감지와 함께 내장된 음향 광학 빔 스플리터를 사용하여 설정되었습니다. - 100×/1.4 오일 이멀젼 대물렌즈를 사용하여 이미지를 획득합니다.
7. 초고해상도(dSTORM) 이미징
- 열 평형을 허용하기 위해 이미징하기 3시간 전에 현미경을 켭니다(이미징이 그 전에 시작되면 드리프트가 발생할 가능성이 더 높음). 카메라를 -70°C로 냉각합니다.
- 한편, 새로운 GLOX-BME 이미징 버퍼를 준비합니다(표 1).
- 세포를 현미경으로 가져옵니다. 현미경 s에 이미징 챔버를 놓습니다.tage 샘플 홀더. 홀더에서 샘플이 평평하고 안전한지 확인하십시오. 갓 만든 GLOX-BME 이미징 버퍼 0.4mL로 웰의 배지를 교체합니다.
- 올바른 레이저 라인과 필터 세트를 설정하십시오. 레이저 출력을 ~1mW로 줄여 관심 있는 HeLa 세포를 식별합니다. 647nm의 낮은 레이저 밀도로 샘플을 비추면서 초점면과 레이저 빔 각도를 조정합니다(이 경우 HILO가 SBR(Signal-to-Background)을 증가시키므로 가파른 경사각[HILO]이 제안됨). HILO 조명 각도를 조정합니다.
참고: 이 프로토콜에서는 TIRF 대물렌즈(100x Apo TIRF 오일 이멀젼 대물렌즈, NA 1.49)가 장착된 도립 에피형광 현미경( 재료 표 참조)을 사용하여 Alexa Fluor 647 채널에서 SseJ의 초해상도 이미징을 획득했습니다. 형광은 μManager를 통해 제어된 EMCCD 카메라로 검출되었습니다. - 프리앰프 게인을 3으로 설정하고 μManager에서 프레임 전송을 활성화합니다. 이전 보고서 35에서 설명한 대로 dSTORM 측정에서 더 높은 감도를 위해 EM-gain을 200으로 설정합니다.
- dSTORM 이미징 전에 대상 구조의 기준 회절 제한 이미지를 캡처합니다. 레이저를 최대 출력으로 켜서 형광단을 어두운 상태로 전환합니다.
주: JF646 형광단이 이전에 기술된 바와 같이, 647nm 여기광의 연속적인 조명에 의해 우세하게 어두운 상태로 변형되었을 때, JF646 형광단의 개별적이고 빠르게 깜박이는 분자가 관찰되었다. - 점멸 이벤트가 시공간에서 분리되는 적절한 수준으로 레이저 강도를 조정하고 노출 시간을 30ms로 설정한 후 획득을 시작합니다. 10,000–30,000 프레임을 획득합니다.
알림: 깜박임을 최적화하려면 레이저 강도를 변경해야 합니다. 너무 많은 이벤트(겹치는 깜박이는 입자)가 감지되는 경우 레이저 강도를 높이는 것이 좋습니다. 이상적인 길이는 샘플의 품질에 따라 다르지만 ~10,000프레임은 식별 가능한 특징을 보여야 합니다.
8. dSTORM의 이미지 재구성
- 이미지 분석에 적합한 소프트웨어를 사용하십시오.
참고: 사용 가능한 많은 오픈 소스 이미지 재구성 프로그램 중 하나인 ThunderSTORM은 아래에 간략하게 설명되어 있습니다. - ImageJ를 열고 원시 데이터를 가져옵니다. ThunderSTORM 플러그인을 열고 장치에 해당하는 카메라 설정을 구성합니다.
- 해석 실행으로 이동하여 이미지 필터링(평균 필터의 차이), 위치 파악 방법(로컬 최대값) 및 분자의 하위 픽셀 위치 파악(통합 가우스 PSF)과 같은 적절한 설정을 지정합니다. 확인을 클릭하여 이미지 재구성을 시작합니다.
알림: 필요한 경우 ThunderSTORM에서 매개변수를 설정하기 위한 자세한 지침이 이미 설명되어 있습니다37.
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Representative Results
이 프로토콜 논문은 그림 1과 같이 살모넬라균 분비 이펙터의 부위별 형광 라벨링 및 시각화를 위한 GCE 기반 방법을 설명합니다. 트랜스사이클로옥텐 생체직교기(TCO) 및 형광 염료를 담지한 ncAA의 화학 구조는 도 1A에 나타내었다. SseJ 표지는 GCE 기술을 통해 직교 아미노아실-tRNA 합성효소/tRNA 쌍을 사용하여 호박색 정지 코돈(그림 1B 참조)에서 생체 직교 ncAA의 유전적 통합에 의해 달성되었습니다. 형광단(JF646-Tz 또는 BDP-Tz)을 포함하는 테트라진으로 TCO 표지 이펙터를 처리하면 숙주 감염 후 여러 시간 후에 전위된 살모넬라 분비 이펙터를 관찰할 수 있는 대체 단백질 표지 전략이 제공되었습니다(그림 1B, C). 우리는 가능한 아미노산 잔기를 식별하고 표면 접근성과 SseJ 기능성 잔기에 대한 기존 지식을 기반으로 ncAA 포함을 위해 SseJ의 위치 10을 선택하는 것으로 시작했습니다. 이전 구조 데이터 및 표면 노출 예측은 특정 위치를 선택하는 데 도움이 될 수 있습니다.
POI를 암호화하는 유전자 내에 호박색 코돈을 배치하면 TCO 통합의 효능에 영향을 미칩니다. 그 결과, 최적의 통합 효율을 위해 POI 유전자의 다양한 위치에 호박색 코돈을 갖는 일련의 돌연변이를 생성하고 분석해야 합니다. 호박 코돈 위치의 선택은 경험적이다. 일반적으로, 변경된 잔기는 POI 기능에 필수적이지 않아야 하고, 번역 후 변형이 없어야 하며, 형광 프로브에 접근할 수 있어야 합니다. 발현 플라스미드는 POI의 네이티브 카피 수를 모방할 수 있도록 낮은 카피 수여야 합니다. 코돈 맥락은 ncAA가 직교 tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 시스템에 의해 얼마나 효과적으로 통합되는지에 영향을 미칩니다. AAT-TAG-ACT가 직교 tRNA의 선호되는 맥락인 반면, sseJ의 페닐알라닌-10의 위치는 TAG로 변경되어 ncAA의 가장 효과적인 통합을 가능하게 하는 AAT-TAG-ACT 맥락을 보장합니다. 먼저, 우리는 sseJ를 발현하기 위해 높은 복제 수 플라스미드를 사용하여 돌연변이가 대장균에서 기능적인지 여부를 테스트했습니다. SDS-PAGE에 의해 입증된 바와 같이, SseJ-F10TCO-HA 돌연변이 발현은 TCO*A의 존재 및 상응하는 최적 tRNA/aaRS에 의존하였다(그림 2A). SseJ-F10FCO-HA는 대장균에서 SPIEDAC 클릭 화학을 사용하여 JF646-Tz로 표지되었습니다. 시험관 내에서 대장균에서 SseJ-F10TCO-HA의 선택적 형광 표지를 형광 현미경 분석으로 확인했습니다(그림 2B). GCE를 사용하여 TCO*A는 sseJ의 호박색 코돈에 부위 특이적으로 통합되었습니다. tRNAPyl/PylRS AF 시스템을 사용하여 ncAA의 게놈 비표적 통합을 직접 식별하려는 시도는 그 존재에 대한 증거를 생성하지 못했습니다. 그러나, 본 명세서에 인용된 이전에 보고된 논문12,29에 문서화된 바와 같이, pEVOL 플라스미드의 효율성, 특이성, off-target incorporation 정도 및 독성을 평가하기 위해 인-겔 형광, 웨스턴 블롯, 형광 융합 단백질, 시험관 내 형광 표지 및 기타 방법을 사용하는 것이 좋습니다.
sseJ에서 억제된 TAG가 기능적이라는 것을 확인한 후, 우리는 sseJ-F10TCO-HA를 네이티브 프로모터와 함께 낮은 복제 수 플라스미드 pWSK29에 클로닝하여 형광 라벨링 및 시각화를 위한 AAT-TAG-ACT 모티프를 보장했습니다. 살모넬라균 세포에서 SseJ-F10TCO-HA의 시험관 내 선택적 표지는 형광 현미경을 사용하여 확인되었습니다(그림 3). 그런 다음 TCO*A가 없거나 존재하는 상태에서 p sseJ-HA 또는 psseJ 10TAG-HA로 보완된 야생형 살모넬라 균주로 HeLa 세포를 감염시켜 TCO가 포함된SseJ가 숙주 세포로 전위될 수 있는지 여부를 확인했습니다. 감염된 HeLa 세포를 PFA로 고정하고 감염 후 16시간 후에 항-HA 항체로 면역염색하여 SseJ로 장식된 SIF를 강조했습니다. 도 4C에 나타낸 바와 같이, SseJ-F10TCO-HA는 명백하게 분비되었고, SseJ-의존성 SIF가 형성되었으며, 이들은 야생형 감염 세포에서 관찰된 것과 유사하게 보였다(도 4A). 그러나 TCO*A가 없는 경우 SseJ 의존성 SIF는 관찰되지 않았습니다(그림 4B). 이러한 관찰은 GCE를 사용한 sseJ-F10TCO-HA의 발현이 SseJ 의존성 SIF를 구출했음을 입증했습니다. 또한 결과는 SseJ-F10TCO-HA가 살모넬라균에 대한 완전한 기능적 독성 인자임을 나타냅니다.
GCE 표지된 SseJ가 기능적이고 분비되는 것을 확인한 후, SPIEDAC 반응을 사용하여 HeLa 세포에서 JF646-Tz로 SseJ-F10TCO-HA를 표지했습니다. 이를 위해 TCO*A가 있는 상태에서 p sseJ-F10TCO-HA로 보완된 야생형 살모넬라균으로 HeLa 세포를 감염시켰습니다. 프로토콜 섹션 5에 설명된 두 가지 대체 프로토콜을 사용하여 JF646-Tz로 표지한 후, 세포를 광범위하게 세척하여 과잉 염료를 제거하고, PFA로 고정하고, 항-HA 항체로 면역염색하여 분비된 SseJ-F10TCO-HA를 시각화했습니다. HeLa 세포의 세포질로 분비된 SseJ-F10TCO-HA는 JF646-Tz(그림 5A, B, 빨간색)로 표지되었고 HA-태그(녹색)와 명확하게 동시 국소화되었습니다. 두 표지가 서로 겹친다는 관찰 (하나는 형광 염료, 다른 하나는 면역 염색에 의해 표지됨)은 GCE 표지의 특이성을 더욱 강조합니다.
이러한 HeLa 세포에서 관찰된 형광 신호가 분비된 이펙터 SseJ에만 특이적인지 확인하기 위해 TCO*A 및 pEVOL-PylRS-AF가 있는 상태에서 야생형 살모넬라균 (psseJ-HA 운반)으로 세포를 감염시켰습니다. 클릭 염료를 사용하여 HeLa 세포에 배경 표지가 있는지 여부를 관찰했습니다. SseJ는 세포 내 또는 비특이적 형광 신호 없이 숙주 세포의 세포질로 방출되었으며(그림 5C), 형광 신호가 SseJ에 특이적임을 입증합니다. ncAA가 호박색 코돈에 특이적으로 혼입되어 있고 분비된 SseJ가 클릭 반응을 통해 숙주 세포에서 시각화될 수 있음을 확인한 후, 다음 목표는 HeLa 세포에서 분비된 SseJ의 초해상도 이미지를 생성하는 것이었습니다(그림 6). 그림 6에서 우리는 GCE의 힘과 JF646 염료의 사용을 통해 HeLa 세포에서 살모넬라 분비 이펙터 SseJ의 부위 특이적 초해상도 이미지를 생성하는 방법을 보여줍니다.
그림 1: SPI-2 이펙터의 부위별 형광 라벨링 방식. (A) TCO*A 및 JF-646-테트라진. (B) 회로도는 SPI-2 이펙터에 ncAA를 통합하는 것을 보여줍니다. 박테리아 세포에는 이펙터 POI(보라색)와 직교 억제 tRNA(빨간색)/아미노아실 합성효소(녹색) 쌍에 대한 유전자를 포함하는 플라스미드가 도입됩니다. 천연 코돈은 허용 위치에서 이펙터 유전자 서열에서 호박색(TAG, 빨간색) 정지 코돈으로 교환됩니다. ncAA (진한 빨간색 원)는 단순히 성장 배지에 도입됩니다. 그런 다음 세포에 의해 픽업되어 세포질에 도달하여 아미노아실-tRNA합성효소(aaRS)에 의해 직교 tRNA에 연결됩니다. CUA 안티코돈을 갖는 ncAA-아실화 tRNA는 이펙터 mRNA(보라색)의 상보적 호박색 코돈의 결과로 리보솜 기계로 들어가 부착된 ncAA를 이펙터에 통합합니다. ncAA는 이펙터 부위의 전장 폴리펩티드 사슬에 의해 운반되고, 이는 기능적 이펙터 단백질로 접히고 조립됩니다. 새로 생성된 이펙터는 T3SS를 통해 숙주 세포 내로 전위된다. 외부에서 공급되는 형광단을 사용하여 ncAA와 통합된 분비된 SPI-2 이펙터를 라벨링할 수 있습니다. (C) 형광 테트라진 염료를 사용한 무구리 클릭 반응 방식. SPIEDAC 클릭 반응을 통해 POI(SseJ)에 통합된 변형된 알켄 그룹이 있는 ncAA는 테트라진 결합 염료(JF646-Tz)와 반응합니다. 형광 생성 테트라진 결합 염료 JF646-Tz는 성공적인 라벨링 후에만 형광성(빨간색)이 됩니다. 약어: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; ncAA = 비-표준 아미노산; T3SS = 유형 3 분비 시스템; SPI-2 = 살모넬라 병원성 섬 2; POI = 관심 단백질; SPIEDAC = 변형 촉진 역 전자 수요 Diels-Alder 고리 첨가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: TCO*A는 대장균에서 발현되는 SseJ-F10TCO-HA에 부위 특이적으로 통합됩니다 . (A) Coomassie-stained SDS-PAGE는 TCO*A가 SseJ-F10TCO-HA(빨간색 화살표로 표시됨) in E. coli에 선택적으로 통합되었음을 확인합니다. (B) 1mM TCO*A의 부재(위) 또는 존재(아래)에서 형광 현미경으로 분석한 대장 균에서 SseJ-F10TCO-HA의 발현. TCO*A의 부재 또는 존재 하에 SseJ-F10TCO-HA를 발현하는 대장균 세포는 BDP-Fl-tetrazine과 함께 배양되고 BDP 형광(녹색)에 대해 이미지화됩니다. SseJ 형광(녹색)은 TCO*A 라벨이 부착된 경우에만 관찰됩니다. 상단 패널에 배경 형광이 없다는 점에 유의하십시오. 스케일 바 = 2 μm. 약어: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; BF = 명시야; HA = 히알루론산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: TCO*A는 살모넬라균에서 발현되는 SseJ-F10TCO-HA에 부위 특이적으로 통합됩니다. 형광 현미경은 1mM TCO*A의 부재(위) 또는 존재(아래)에서 살모넬라균에서 SseJ-F10TCO-HA의 발현을 검사하는 데 사용됩니다. SseJ F10TCO-HA를 발현하는 살모넬라균은 JF646-Tz로 처리되고 TCO*A의 존재 또는 부재 하에 JF646 형광(자홍색)에 대해 이미지화됩니다. SseJ(자홍색)의 형광은 TCO*A가 존재할 때만 검출됩니다. 스케일 바 = 2 μm. 약어: TCO*A = trans-cyclooct-2-en-L-Lysine; BF = 명시야; HA = 히알루론산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 분비된 SseJ-J10TCO-HA는 기능적입니다. (A) HeLa 세포는 16시간 동안p sseJ-HA를 보유하는 살모넬라균에 감염되고, 고정되고, 항-HA 항체(빨간색), LPS(녹색) 및 DAPI(파란색)로 면역염색됩니다. 예상한 바와 같이, SseJ-의존성 SIFs의 형성이 감염된 세포에서 관찰된다. (B) TCO*A가 없는 경우 호박색 코돈은 억제되지 않으며 감염된 HeLa 세포에는 SseJ 의존성 SIF가 없습니다. HeLa 세포는 TCO*A가 없는 상태에서 SseJ-F10TCO-HA를 발현하는 살모넬라균에 16시간 동안 감염되고, 고정되고, 항-HA 항체(빨간색), LPS(녹색) 및 DAPI(파란색)로 면역염색됩니다. (C) TCO*A의 존재 하에서 SseJ 의존성 SIF가 관찰됩니다. 400μM TCO*A의 존재 하에 SseJ-F10TCO-HA를 발현하는 살모넬라균으로 감염된 HeLa 세포를 고정하고 항-HA 항체 SseJ(빨간색), LPS(녹색) 및 DAPI(파란색)로 면역염색합니다. 좌측 패널에서 SseJ-의존성 SIF가 관찰되어, GCE를 이용한 sseJ-F10TCO-HA의 발현에 의해 SseJ가 구출되었음을 명확하게 나타낸다. 스케일 바 = 10 μm. 약어: HA = 히알루론산; LPS = 지질다당류; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; TCO*A = 트랜스-사이클로옥트-2-엔-L-라이신; SIF = 살모넬라균 유도 필라멘트; GCE = 유전자 코드 확장. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: JF646-Tz 염료를 사용한 SseJ의 표지 특이성. (A) HeLa 세포는 400μM TCO*A의 존재 하에 SseJ-F10TCO-HA를 발현하는 살모넬라균에 감염됩니다. TCO 태그가 부착된 분비된 SseJ-F10TCO-HA는 소 우유에서 추출한 1% 카제인 나트륨 염을 함유한 1x PBS에 2μM JF646-Tz로 표지하고, 광범위하게 세척, 고정 및 항-HA 항체로 면역염색하여 분비된 SseJ(녹색)를 시각화합니다. SseJ-F10TCO-HA는 분비되고 JF646-Tz 염료(빨간색, 왼쪽 패널)로 표지됩니다. GCE(빨간색) 및 HA(녹색)를 통해 레이블이 지정된 SseJ는 명확하게 공동 국소화됩니다(오른쪽 패널). (B) 약간 다른 표지 프로토콜을 사용하여 TCO 태그가 부착된 분비된 SseJ-F10TCO-HA도 완전 배지 DMEM(FBS 없음)에서 2μM JF646-Tz로 표지하고, 광범위하게 세척하고, 고정하고, 항-HA 면역형광 염색을 실시합니다. 분비된 SseJ-F10TCO-HA는 JF646-Tz 염료(빨간색, 왼쪽 패널)로 표지되고 HA(녹색)와 함께 국소화됩니다. (C) 형광 신호가 다른 SPI-2 방출 단백질의 산물이 아니라 SseJ에 고유하다는 것을 추가로 확인하기 위해 HeLa 세포는 ncAA (TCO*A)의 존재 하에 psseJ-HA 및 pEVOL-PylRS-AF를 운반하는 야생형 살모넬라균에 감염됩니다. 감염 후 16시간 후, 감염된 HeLa 세포를 완전 배지(FBS 및 TCO*A 제외)에서 2μM JF646-Tz로 처리하고 새로운 성장 배지를 사용하여 과잉 염료를 완전히 제거합니다. HeLa 세포는 PFA를 고정하고 SseJ(녹색)에 대해 면역염색하기 전에 PBS로 철저히 세척합니다. 좌측 패널(JF646-Tz)에서 가시적인 배경 형광 신호의 부족은 숙주 세포 내에서 비표적 표지가 거의 발생하지 않았음을 나타낸다. 스케일 바 = 10 μm. 약어: HA = 히알루론산; PBS = 인산염 완충 식염수; FBS = 소 태아 혈청; DAPI = 4',6-디아미디노-2-페닐인돌; TCO*A = 트랜스-사이클로옥트-2-엔-L-라이신; SIF = 살모넬라균 유도 필라멘트; GCE = 유전자 코드 확장; SPI-2 = 살모넬라 병원성 섬 2; BF = 명시야. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: HeLa 세포에서 GCE 표지 SseJ의 초고해상도 이미징. HeLa 세포는 400μM TCO*A의 존재 하에 SseJ-F10TCO-HA를 발현하는 살모넬라균 에 감염됩니다. TCO 태그가 부착된 분비된 SseJ-F10TCO-HA는 프로토콜에 설명된 대로 생리학적 조건에서 2μM JF646-Tz로 표지된 다음 광범위하게 세척됩니다. 이미지는 Nikon N-STORM을 사용하여 획득합니다. (A) 관찰 중인 HeLa 세포의 명시야 이미지. 스케일 바 = 10 μm. (B) TCO*A 및 JF-646으로 표지된 분비된 SseJ의 회절 제한, 광시야 이미지. 스케일 바 = 10 μm. (C) SseJ 데코레이팅된 SIF의 해당 dSTORM 이미지. 스케일 바 = 10 μm. C(i) 삽입은 박스형 영역에서 초분해능 SseJ의 확대 보기를 보여줍니다. 스케일 바 = 1 μm. 약어: HA = 히알루론산; TCO*A = 트랜스-사이클로옥트-2-엔-L-라이신; SIF = 살모넬라균 유도 필라멘트; GCE = 유전자 코드 확장; WF = 광시야; BF = 명시야. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
표 1. 솔루션. 이 표의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
본원에 기재된 접근법은 감염 후 박테리아 T3SS에 의해 숙주 세포 내로 주입된 이펙터 단백질의 정확한 위치를 추적하기 위해 사용되었다. T3SS는 살모넬라균, 시겔라균 및 예르시니아와 같은 세포내 병원체에 의해 사용되어 독성 성분을 숙주로 운반합니다. 초고해상도 이미징 기술의 개발로 이전에는 상상할 수 없었던 해상도12,13,24에서 독성 인자를 시각화할 수 있게 되었습니다. 그러나 특정 표지 제약으로 인해 광활성 단백질 융합체가 T3SS 기공을 차단하고 분비되지 않기 때문에 보다 심층적인 조사가 불가능했습니다. 또한, 클러스터링 아티팩트 및 잘못된 분석은 일부 융합 단백질의 클러스터 또는 응집적 경향으로 인해 발생할 수 있습니다.
일부 예에서, 융합 단백질은 또한 이전에 PAmCherry-SsaP12,13으로 관찰된 바와 같이 절단된다. 이러한 모든 제약은 GCE에 의해 극복되며, 이를 통해 POI의 부위별 형광 라벨링이 가능합니다. 또한 풍부하지 않은 단백질을 시각화 할 수 있습니다12,13. 직교 tRNA/아미노아실-tRNA 합성효소 시스템을 사용한 ncAA 통합의 효율성에 영향을 미칠 수 있는 여러 요인이 있지만 코돈 맥락이 가장 중요한 것으로 보입니다. 직교 tRNA는 바람직한 코돈 맥락이 AATTAGACT33일 때 ncAA를 가장 효율적으로 통합합니다. 그림 5에서 우리는 HA-tag의 면역염색과 비교하여 GCE와 부위 특이적 형광단(배경 부재)으로 인한 선명한 라벨링을 비교할 수 있습니다.
결과적으로 연구자들은 여기에 설명된 방법을 사용하여 병원체, 공생 박테리아 및 진핵 숙주에서 POI를 시각화할 수 있습니다. 요컨대, 유전적으로 암호화된 ncAA는 기존 방법이 실패할 때 이펙터 단백질 라벨링에 대한 대체 접근 방식을 제공합니다. 그러나 이 방법의 한 가지 주요 한계는 형광 표지의 효율성에 영향을 미칠 수 있는 막 투과성, 분포 및 유지와 같은 형광단의 고유한 화학적 특성입니다. 형광 ncAA는 클릭 반응(click reactions)12을 피할 수 있는 대안이지만, 이들은 이광자 현미경을 통해서만 시각화할 수 있다. 독자는 본원에 인용된 세포막 투과성/불투과성 염료의 목록을 참조한다 12,38,39,40,41.
결론적으로, 우리는 생물학적 기능을 손상시키지 않으면서 형광성 형광단과 함께 ncAA를 유전적으로 암호화하여 살모넬라 분비 이펙터 SseJ를 부위 특이적으로 표지하고 시각화했습니다. JF646-Tz로 SseJ를 표지하는 것은 매우 특이적이었고, 초고해상도 이미징을 추가로 사용하여 숙주 세포 내부의 분비된 이펙터를 시각화할 수 있습니다. 따라서, dSTORM 호환 염료 및 유전자 코드 확장을 사용한 박테리아 이펙터의 형광 표지는 회절 한계 미만의 분해능에서 숙주 세포에서 박테리아 분비 이펙터의 세포 내 공간 국소화를 허용했습니다. 이 라벨링 플랫폼은 생세포 이미징 단일 입자 추적과 호환되기 때문에 당사의 방법을 통해 전례 없는 수준의 시간 및 공간 분해능으로 T3SS 시스템의 이펙터 단백질을 분석할 수 있어 박테리아 병인에 대한 분자 이해를 향상시킬 수 있습니다.
열악한 ncAA 통합 효율 및 유기 형광단의 광물리학적 제약과 같은 특정 한계가 있지만, 우리는 이 접근법이 부족하더라도 연구자들이 숙주 세포 내에서 분비된 이펙터를 관찰하고 국소화하는 데 도움이 될 수 있음을 입증했습니다12,13. 우리는 이 기술의 적응이 감염 동안 박테리아에 의해 생성되는 다른 이펙터 단백질에 대한 이미징 및 연구를 위한 새롭고 흥미로운 기회를 열 것으로 기대합니다. 이 방법은 또한 바이러스 라벨링에 쉽게 적용되어 광범위한 유용성을 보여줍니다.
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Disclosures
저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 텍사스 주 갤버스턴에 있는 텍사스 대학교 의과대학 지부의 창업 자금과 L.J.K.에 대한 텍사스 STAR 어워드의 지원을 받았습니다. 플라스미드 pEVOL-PylRS-AF에 대해 Edward Lemke 교수(유럽 분자 생물학 연구소, 독일 하이델베르크)에게 감사드립니다. 그림 1 의 이미지는 BioRender를 사용하여 생성되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris/Glycine SDS running buffer | BIO-RAD | 1610732 | |
| Ammonium chloride | Fischer Scientific | A661-500 | |
| Ammonium sulphate | Fischer Scientific | BP212R-1 | |
| Ampicillin Sodium | Sigma-Aldrich | A0166 | 5 g |
| Antibiotic-Antimycotic (100x) | ThermiFischer Scientific | 15240096 | |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | 500 g |
| Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) | Beckman Coulter | ||
| Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
| BDP-FL-tetrazine | Lumiprobe (USA) | 2.14E+02 | |
| β-mercaptoethanol | Millipore | 444203 | 250 mL |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503 | 500 g |
| Casein | Sigma-Aldrich | C8654 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C1919 | |
| Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A) | SiChem GmbH | SC-8008 | Size: 500 mg |
| DAPI (Hoechst33342) | Invitrogen | H3570 | |
| DeNovix DS-11+ Spectrophotometer | DeNovix | ||
| DMEM* | Corning | 10-013-CV | * Used for maintaining HeLa Cell |
| DMEM** | Gibco | 11965-092 | **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4. |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | 250 g |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody | Invitrogen | A-31572 | |
| DPBS, 1x | Corning | 21-031-CV | |
| E. coli strain BL21 (DE3) | Novagen (Madison, WI) | ||
| EMCCD Camera | Andor | iXon Ultra 897-BV | |
| Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Fischer | 10082147 | |
| Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm) | Fischer Scientific | 97203 | Pack of 100 |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | BIO-RAD | 1652660 | |
| Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | 10 mL |
| Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x | Fischer Scientific | 25-030-081 | |
| Glucose oxidase | Sigma-Aldrich | G7141-50KU | |
| Glycerol | Fischer Scientific | BF229-4 | |
| HeLa cells | ATTC | CCL-2 | |
| HEPES Buffer | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Hydrocloric acid | Fischer Scientific | A144-212 | |
| ImageJ | Image processing and analysis: http://rsbweb.nih.gov/ij | ||
| IntantBlue | Expedeon | ISB1L | Coomassie-based stain |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Sigma-Aldrich | I5502 | |
| Janelia Fluoro 646-tetrazine | Tocris Bioscience | 7279 | |
| Kanamycin | Sigma-Aldrich | 60615 | 5 g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500 g |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L6876 | |
| μManager (v. 1.4.2) | https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release | ||
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | 250 g |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2086 | 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Nikon N-STORM | Nikon Instruments Inc. | https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution | |
| Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks | ThermiFischer Scientific | 156499 | |
| Omnipur Casamino Acid | Calbiochem | 2240 | 500 g |
| Paraformaldehhyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| PBS (10x) | Roche | 11666789001 | |
| Penicillin-Streptomycin Solution (100x) | GenDEPOT | CA005-010 | 100 mL |
| pEVOL-PylRS-AF | For plasmid construction and map see following references 1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81. 2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70. |
||
| Plasmid Mini-prep Kit | Qiagen | 27106 | |
| plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. | ||
| plasmid pWSK29-sseJ-HA | Ref.: elife. 2021, 10, e67789. Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/ | ||
| Pluronic F-127 | Millipore | 540025 | Protein grade, 10% Solution |
| Potassium phosphate monobasic | Fischer Scientific | P285-500 | |
| Potassium sulphate | Acros Organic | 424220250 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem | Sigma-Aldrich | 539131 | 100x Solution |
| Rabbit anti-HA primary antibody | Sigma-Aldrich | H6908 | |
| S. enterica. serovar Typhimurium 14028s | Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116. | ||
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036-50G-F | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Sodium hydroxide | Fischer Scientific | SS255-1 | |
| Sodium Pyruvate (100 mM), 100x | Corning | 25-060-C1 | 100 mL |
| Sonic Dismembrator Model 100 | Fischer Scientific | 24932 | |
| STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/ | |
| ThunderSTORM | https://zitmen.github.io/thunderstorm/ | ||
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Trypsin-EDTA (1x), 0.25% | GenDEPOT | CA014-010 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | 100 mL |
| X-well tissue culture chamber slides | SARSTEDT | 94.6190.802 |
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