Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Superupplösningsavbildning av bakteriella utsöndrade proteiner med hjälp av genetisk kodexpansion

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64382
Automatic Translation
1, 1
1Biochemistry & Molecular Biology, University of Texas Medical Branch

Summary

Denna artikel ger ett enkelt och tydligt protokoll för att märka Salmonella-utsöndrade effektorer med hjälp av genetisk kodutvidgning (GCE) platsspecifikt och avbilda den subcellulära lokaliseringen av utsöndrade proteiner i HeLa-celler med hjälp av direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM)

Abstract

Typ tre sekretionssystem (T3SS) gör det möjligt för gramnegativa bakterier att injicera ett batteri av effektorproteiner direkt i cytosolen hos eukaryota värdceller. Vid inträde modulerar de injicerade effektorproteinerna tillsammans eukaryota signalvägar och omprogrammerar cellulära funktioner, vilket möjliggör bakterieinträde och överlevnad. Övervakning och lokalisering av dessa utsöndrade effektorproteiner i samband med infektioner ger ett fotavtryck för att definiera det dynamiska gränssnittet för värd-patogeninteraktioner. Att märka och avbilda bakterieproteiner i värdceller utan att störa deras struktur / funktion är dock tekniskt utmanande.

Att konstruera fluorescerande fusionsproteiner löser inte detta problem, eftersom fusionsproteinerna fastnar i sekretionsapparaten och därmed inte utsöndras. För att övervinna dessa hinder använde vi nyligen en metod för platsspecifik fluorescerande märkning av bakteriella utsöndrade effektorer, liksom andra svårmärkta proteiner, med hjälp av genetisk kodexpansion (GCE). Detta dokument ger ett komplett steg-för-steg-protokoll för att märka Salmonella-utsöndrade effektorer med GCE-platsspecifikt, följt av anvisningar för avbildning av den subcellulära lokaliseringen av utsöndrade proteiner i HeLa-celler med hjälp av direkt stokastisk optisk rekonstruktionsmikroskopi (dSTORM)

Nya fynd tyder på att införlivandet av icke-kanoniska aminosyror (ncAA) via GCE, följt av bio-ortogonal märkning med tetrazininnehållande färgämnen, är en livskraftig teknik för selektiv märkning och visualisering av bakteriella utsöndrade proteiner och efterföljande bildanalys i värden. Målet med denna artikel är att tillhandahålla ett enkelt och tydligt protokoll som kan användas av utredare som är intresserade av att genomföra superupplösningsavbildning med GCE för att studera olika biologiska processer i bakterier och virus samt värd-patogeninteraktioner.

Introduction

Bakteriella infektioner har länge betraktats som en allvarlig fara för människors hälsa. Patogener använder högt utvecklade, extremt kraftfulla och invecklade försvarssystem, liksom en mängd olika bakteriella virulensfaktorer (kallade effektorproteiner) för att undvika värdimmunsvar och etablera infektioner 1,2. De molekylära mekanismerna bakom dessa system och rollen för enskilda effektorproteiner är dock fortfarande till stor del okända på grund av bristen på lämpliga metoder för att direkt följa de avgörande proteinkomponenterna och effektorerna i värdceller under patogenes.

Ett typiskt exempel är Salmonella enterica serovar Typhimurium, som orsakar akut gastroenterit. Salmonella Typhimurium använder typ tre sekretionssystem (T3SS) för att injicera en mängd olika effektorproteiner direkt i värdceller. Så snart Salmonella kommer in i värdcellen finns den i ett surt membranbundet fack, kallat Salmonella-innehållande vakuol (SCV)3,4. SCV: s sura pH aktiverar Salmonella pathogenicity island 2 (SPI-2)-kodad T3SS och translokerar en volley av 20 eller fler effektorproteiner över det vakuolära membranet till värdcytosolen 5,6,7,8. Inuti värden manipulerar dessa komplexa cocktails av effektorproteiner koordinerat värdcellens signalvägar, vilket resulterar i bildandet av mycket dynamiska, komplexa rörformiga membranstrukturer utsträckta från SCV längs mikrotubuli, benämnda Salmonella-inducerade filament (SIF), som gör det möjligt för Salmonella att överleva och replikera inom värdcellerna9,10,11.

Metoder för att visualisera, spåra och övervaka lokaliseringar av bakteriella effektorer och undersöka deras handel och interaktioner inuti värdceller ger kritisk inblick i mekanismerna som ligger till grund för bakteriell patogenes. Märkning och lokalisering av Salmonella-utsöndrade T3SS-effektorproteiner inuti värdceller har visat sig vara en teknisk utmaning12,13; Ändå har utvecklingen av genetiskt kodade fluorescerande proteiner förändrat vår förmåga att studera och visualisera proteiner inom levande system. Storleken på fluorescerande proteiner (~ 25-30 kDa)15 är emellertid ofta jämförbar med eller till och med större än den för proteinet av intresse (POI; t.ex. 13,65 kDa för SsaP, 37,4 kDa för SifA). Faktum är att fluorescerande proteinmärkning av effektorer ofta blockerar utsöndringen av den märkta effektorn och fastnar T3SS14.

Dessutom är fluorescerande proteiner mindre stabila och avger ett lågt antal fotoner före fotoblekning, vilket begränsar deras användning i superupplösningsmikroskopiska tekniker16,17,18, särskilt i fotoaktiveringslokaliseringsmikroskopi (PALM), STORM och stimulerad emissionsutarmning (STED) mikroskopi. Medan de fotofysiska egenskaperna hos organiska fluorescerande färgämnen är överlägsna de hos fluorescerande proteiner, kräver metoder/tekniker som CLIP/SNAP19,20, Split-GFP 21, ReAsH/FlAsH 22,23 och HA-Tags 24,25 ytterligare ett protein- eller peptidbihang som kan försämra strukturfunktionen hos effektorproteinet av intresse genom att störa posttranslationell modifiering eller handel. En alternativ metod som minimerar nödvändig proteinmodifiering innefattar införlivande av ncAA i en POI under översättning genom GCE. NCAAs är antingen fluorescerande eller kan göras fluorescerande via klickkemi 12,13,26,27,28.

Med hjälp av GCE kan ncAA med små, funktionella, bioortogonala grupper (såsom en azid-, cyklopropen- eller cyklooktyngrupp) introduceras på nästan vilken plats som helst i ett målprotein. I denna strategi byts ett naturligt kodon ut mot ett sällsynt kodon, såsom ett bärnsten (TAG) stoppkodon vid en angiven position i POI-genen. Det modifierade proteinet uttrycks därefter i celler tillsammans med ett ortogonalt aminoacyl-tRNA-syntetas/tRNA-par. Det aktiva stället för tRNA-syntetas är utformat för att endast ta emot en viss ncAA, som sedan är kovalent fäst vid 3'-änden av tRNA som känner igen bärnstenskodonet. NCAA införs helt enkelt i tillväxtmediet, men det måste tas upp av cellen och nå cytosolen där aminoacyl-tRNA-syntetas (aaRS) kan länka det till det ortogonala tRNA; Den införlivas sedan i intressepunkten på den angivna platsen (se figur 1)12. Således möjliggör GCE platsspecifik införlivande av en uppsjö av bio-ortogonala reaktiva grupper såsom keton, azid, alkyn, cyklooktyn, transcyklookten, tetrazin, norbonen, α, β-omättad amid och bicyklo [6.1.0]-nonyn i en POI, vilket potentiellt kan övervinna begränsningarna för konventionella proteinmärkningsmetoder 12,26,27,28.

De senaste framväxande trenderna inom superupplösningsavbildningstekniker har öppnat nya vägar för att undersöka biologiska strukturer på molekylär nivå. I synnerhet har STORM, en enmolekylär, lokaliseringsbaserad, superupplösningsteknik, blivit ett ovärderligt verktyg för att visualisera cellulära strukturer ner till ~ 20-30 nm och kan undersöka biologiska processer en molekyl i taget och därigenom upptäcka rollerna för intracellulära molekyler som ännu är okända i traditionella ensemble-genomsnittliga studier13 . Enmolekyl- och superupplösningstekniker kräver en liten tagg med ljusa, fotostabila organiska fluoroforer för bästa upplösning. Vi visade nyligen att GCE kan användas för att införliva lämpliga prober för superupplösningsavbildning12.

Två av de bästa valen för proteinmärkning i celler är bicyklisk [6.1.0] nonynelysin (BCN) och transcyklookten-lysin (TCO; visas i figur 1), som kan kodas genetiskt med hjälp av en variant av tRNA / syntetasparet (här benämnt tRNA Pyl / PylRS AF), därPyl representerar pyrrolysin, ochAF representerar en rationellt utformad dubbelmutant (Y306A, Y384F) härledd från Methanosarcina mazei som naturligt kodar för pyrrolysin12, 29,30,31. Genom den stamfrämjade inversa elektronbehovsreaktionen Diels-Alder cycloaddition (SPIEDAC) reagerar dessa aminosyror kemoselektivt med tetrazinkonjugat (figur 1) 12,30,31. Sådana cykloadditionsreaktioner är exceptionellt snabba och kompatibla med levande celler; De kan också vara fluorogena om en lämplig fluorofor funktionaliseras med tetrazindelen12,26,32. Detta dokument presenterar ett optimerat protokoll för övervakning av dynamiken hos bakteriella effektorer som levereras till värdceller med GCE, följt av subcellulär lokalisering av utsöndrade proteiner i HeLa-celler med dSTORM. Resultaten indikerar att inkorporering av en ncAA via GCE, följt av en klickreaktion med fluorogena tetrazinbärande färgämnen, representerar en mångsidig metod för selektiv märkning, visualisering av utsöndrade proteiner och efterföljande subcellulär lokalisering i värden. Alla komponenter och procedurer som beskrivs här kan dock justeras eller ersättas så att GCE-systemet kan anpassas för att undersöka andra biologiska frågor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmidkonstruktion

  1. Klona genen som uttrycker POI till en expressionsplasmid (t.ex. pET28a-sseJ 10TAG) som uttrycker POI i E. coli BL21 (DE3). Detta steg underlättar för att bestämma att mutanterna är funktionella.
  2. För visualisering av Salmonella-utsöndrade effektorer i värdceller, konstruera en expressionsplasmid (pWSK29-sseJ-HA) som uttrycker mål-POI SseJ under kontroll av dess ursprungliga promotor, som beskrivits i tidigare rapporter 7,12,24. Använd platsriktad mutagenes, ersätt kodonet för fenylalanin-10 med ett bärnstenskodon (TAG) i SseJ (pWSK29-sseJ 10TAG-HA), vilket säkerställer AAT-TAG-ACT-motivet 33,34.
  3. Förutom ovanstående plasmider, för genetisk inkorporering av transcyklookt-2-en-L-lysin (TCO * A) i en POI, använd en annan expressionsplasmid (pEVOL-PylRS-AF)31 som innehåller det utvecklade tRNA / syntetasparet (tRNAPyl / PylRS AF ) gener kodade i plasmiden pEVOL.
    OBS: Detaljerade beskrivningar av plasmiden och kloningsprotokollen beskrivs i föregående rapport30,31.
  4. Använd kommersiellt tillgängliga plasmidberedningssatser för att erhålla plasmid-DNA av hög kvalitet. För renat DNA är det optimala 260/280-förhållandet ~ 1,8. Kontrollera DNA-renheten med 1% agarosgelelektrofores, om det behövs.

2. Beredning av bakteriekultur

  1. Erhålla dubbla transformanter för att testa att mutanten är funktionell i E. coli
    1. Ta ut BL21-kompetenta celler från -80 °C och tina på is i cirka 20–30 minuter.
    2. Blanda 1–5 μL av varje plasmid (~50 ng pEVOL-PylRS-AF och pET28a-sseJ 10TAG) med 200 μL kemiskt kompetenta BL21-celler i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Blanda de kompetenta cellerna och plasmidblandningen försiktigt; Inkubera i 30 minuter på is.
    3. Värmechocka mikrocentrifugröret i ett vattenbad på 42 °C i 45 sekunder. Sätt tillbaka rören på is i 2 minuter.
    4. Tillsätt 1 ml varmt LB-medium till mikrocentrifugröret och överför snabbt blandningen till ett 15 ml koniskt rör. Inkubera cellerna vid 37 °C i en skakapparat vid 250 rpm i 1 timme. Platta någon del eller alla transformerade celler på LB-agarplattor som innehåller lämpliga antibiotika. Inkubera plattorna vid 37 °C över natten.
      OBS: I detta protokoll användes 35 μg/ml kloramfenikol och 50 μg/ml kanamycin för att välja pEVOL-PylRS-AF respektive pET28a-sseJ 10TAG. I omvandlingssteget utvärderar du den lyckade omvandlingen med hjälp av negativa och positiva kontroller.
  2. Överför mutanten till Salmonella för visualisering av Salmonella-utsöndrade effektorer i värdceller:
    1. Tillsätt 2–3 μL vardera av pEVOL-PylRS-AF och pWSK29-sseJ 10TAG till 40–60 μL elektrokompetent Salmonella Typhimurium stam 14028s i ett kylt mikrocentrifugrör. Blanda blandningen försiktigt med en pipett.
    2. Överför elektroporeringsblandningen till en kyld (0,2 cm elektrodgap) kyvett; ställ in elektroporeringsinställningarna på 2,5 kV, 200 Ω, 25 μF. Placera kyvetten inuti elektroporeringskammaren. Se till att kammarelektroden har fast kontakt med mikropulserkyvetten.
    3. Håll pulsknappen intryckt tills den piper.
    4. Tillsätt omedelbart 1 ml varmt LB-medium i kyvetten. Överför hela innehållet till ett 15 ml koniskt rör. Inkubera cellerna vid 37 °C genom skakning vid 250 rpm i 1 timme.
    5. Platta någon del eller hela elektroporeringsblandningen av Salmonella på en LB-agarplatta som innehåller lämpliga antibiotika. Inkubera plattorna vid 37 °C över natten.
      OBS: I detta protokoll användes 35 μg/ml kloramfenikol och 100 μg/ml ampicillin för val av pEVOL-PylRS-AF respektive pWSK29-sseJ 10TAG.
  3. Kultur förberedelse
    1. Inokulera en enda koloni av Salmonella eller E. coli i 5 ml LB-medium innehållande lämpliga antibiotika. Odla över natten vid 37 °C, skaka vid 250 rpm.

3. Uttryck och fluorescerande märkning av ncAA-bärande proteiner

  1. Uttryck av ncAA-bärande proteiner i E. coli
    1. Överför 100 μl primärkultur till 5 ml LB-medium (spädning 1:50) innehållande 35 μg/ml kloramfenikol och 50 μg/ml kanamycin, följt av inkubation vid 37 °C med skakning vid 250 rpm tills OD600 når 0,4–0,6.
    2. Bered 1 mM TCO*A stamlösning (10 ml; Tabell 1).
    3. När kulturerna når OD600 = 0,4–0,6, ersätt LB-mediet med färskt LB innehållande 1 mM TCO * A, 35 μg / ml kloramfenikol och 50 μg / ml kanamycin.
      Alternativt kan stamlösning av TCO*A beredas enligt beskrivningen i steg 5.4.2.
    4. Inducera proteinuttryck i närvaro av 1 mM IPTG, 0,2% arabinos och skaka över natten vid 34 °C, 250 rpm. Skörda bakteriecellerna genom centrifugering i 5 minuter vid 11 000 × g. Ta bort supernatanten och frys pelleten vid -20 °C tills den används igen.
    5. För ett kontrollexperiment, upprepa samma experiment men uttryck de ncAA-bärande proteinerna i frånvaro av ncAA. För in vitro fluorescerande märkning av ncAA-bärande proteiner i E. coli, följ den detaljerade proceduren som beskrivs i steg 3.3.
  2. Uttryck av ncAA-bärande proteiner i Salmonella
    1. Överför 100 μl primärkultur till 5 ml LB-medium (spädning 1:50) innehållande 35 μg/ml kloramfenikol och 100 μg/ml ampicillin, följt av inkubation vid 37 °C med skakning vid 250 rpm tills OD600 når 0,6.
    2. Bered modifierat N-minimalt medium (MgM, pH 5,6) enligt beskrivningen i tabell 1.
    3. Ersätt LB-mediet med modifierat N-minimalt medium (MgM) kompletterat med 1 mM TCO*A (tabell 1). Odla bakterierna vid 34 °C i 30 minuter. Tillsätt sedan 0,2% arabinos, 25 mg / ml kloramfenikol och 100 mg / ml ampicillin och odla cellerna i ytterligare 6 timmar, skaka vid 250 rpm.
    4. Efter 6 timmar, tvätta bakterierna 4x under ett intervall på 30 min, med färskt MgM (pH 5,6) medium (tabell 1) utan ncAA. Använd 972 × g i 15 minuter vid rumstemperatur i tvättstegen.
    5. Centrifugera bakterierna, resuspendera i 1x PBS-buffert och inkubera i 1 timme vid 4 °C i mörker för att avlägsna överskott av ncAA. Efter 1 timme, centrifugera bakterierna vid 3 000 × g, 4 °C i 15 minuter och förvara dem för vidare användning.
    6. För ett kontrollexperiment, upprepa samma experiment genom att uttrycka ncAA-bärande proteiner i frånvaro av ncAA.
  3. In vitro fluorescensmärkning av ncAA-bärande proteiner i Salmonella Typhimurium
    1. Resuspendera salmonellaceller som uttrycker SseJ-F10TCO-HA i frånvaro eller närvaro av TCO*A (från steg 3.2) i 1x PBS. Justera OD600 till 4 i PBS. Inkubera cellerna med 20 μM Janelia Fluor 646-tetrazin (JF646-Tz) eller 20 μM BDP-Fl-tetrazin (5 mM stamlösningar i DMSO) vid 37 °C i mörker och skaka i 1–2 timmar vid 250 rpm.
    2. Pellet cellerna, tvätta 3-4x med PBS innehållande 5% DMSO och 0,2% Pluronic F-127, resuspendera i PBS innehållande 5% DMSO och inkubera över natten vid 4 ° C i mörkret. Tvätta 2x igen med 1x PBS. Använd 972 × g i 15 minuter vid rumstemperatur i tvättstegen.
    3. Avbilda cellerna omedelbart med ett konfokalmikroskop eller fixera dem med 1,5% paraformaldehyd (PFA) i PBS i 30–45 minuter vid rumstemperatur i mörkret.
    4. Tvätta de fasta cellerna 2x med PBS och slutligen i 50 mM NH4Cl i PBS i 15 minuter för att avlägsna överskott av PFA. Resuspendera cellerna i PBS och förvara vid 4 °C i högst 3–4 dagar. Avbildar bakterierna med konfokalmikroskopi enligt beskrivningen i avsnitt 6.

4. Biokemisk karakterisering av ncAA-bärande proteiner

  1. Celllys
    1. Suspendera cellerna på nytt från avsnitt 3.1 i lysbuffert (tabell 1) och inkubera i rumstemperatur i mer än 30 minuter. Kyl blandningen på is i 15 min.
      OBS: Håll förhållandet mellan lysbuffert och cellvikt som används till 1:10.
    2. Sonicate de återsuspenderade cellerna medan du fortfarande är på is. Puls i 30 s vid inställning 7 minst 6x, med 1 min luckor, med hjälp av en sonicator (se materialtabellen).
    3. Snurra ner celllysatet vid 20 500 × g, 4 °C i 15 minuter (det är viktigt att bibehålla 4 °C). Överför supernatanten till ett nytt rör och kassera pelleten.
  2. SDS-PAGE analys
    1. Förbered 5x SDS-laddningsfärg (tabell 1). Tillsätt 5 μL SDS-gelladdningsbuffert till 13 μL celllysat. Denaturera proteinerna med natriumdodecylsulfat (SDS) provbuffert i ett 2 ml rör vid 95 °C i 10 minuter, centrifugera blandningen vid 2 000 × g i 50 sekunder och fyll på en 12 % SDS-polyakrylamidgel.
    2. Montera gelkassetten, placera den i en gelelektroforesapparat och anslut elektroforesapparaten till en elektrisk strömförsörjning. Häll den rinnande bufferten, ladda molekylviktmarkörerna och proteinproverna och kör gelen vid 100 V tills bromfenolen når botten av den upplösande gelen.
      OBS: Börja analysen omedelbart, eftersom lysater lagrade vid -20 °C tenderar att förlora kvalitet efter varje frys-tina cykel.
    3. Färga gelén med Coomassie blå proteinfläck.

5. Bio-ortogonal märkning av Salmonella-utsöndrad effektor SseJ-F10TCO-HA i HeLa-celler

  1. Odla och bibehålla HeLa-celler vid 37 °C, 5%CO2 och 95% luftfuktighet i ett högt glukos (4,5 g / L) Dulbeccos modifierade örnmedium (DMEM), kompletterat med 10% (v / v) FBS förutom penicillin-streptomycin (1x).
  2. Odlingsbakterier 1 dag före infektion. Inokulera en enda koloni av Salmonella 14028s som innehåller pEVOL-PylRS-AF och pWSK29-sseJ 10TAG i 5 ml antibiotikainnehållande standard LB-buljong över natten vid 37 °C, skaka vid 250 rpm.
  3. Frö HeLa-celler 1 dag före infektion. Ta en vävnadsodlingskolv (T-75) som innehåller HeLa-celler vid ~ 80% sammanflöde, bestämd genom mikroskopisk undersökning av celldensiteten. Tvätta cellerna med varm PBS. Lossa cellerna med 3 ml varmt 0,25% trypsin / EDTA i 5 minuter vid 37 ° C, 5% CO2.
    1. Släck trypsinet med 2 ml DMEM (+ 10% FBS). Överför hela kolvens innehåll till ett 15 ml rör efter återsuspendering av cellerna. Snurra ner cellerna vid 1 000 × g i 5 minuter. Ta ut supernatanten ur röret. Återsuspendera HeLa-cellpelleten i förvärmt tillväxtmedium.
    2. Använd en hemocytometer för att undersöka suspensionen och räkna de närvarande cellerna. Bered ett utspätt cellmaterial vid 1 × 105 celler/ml. Frö 0,5 × 105 HeLa-celler per brunn i 500 μL DMEM + 10% FBS-tillväxtmedium i ett åtta-brunnskammarglas. Håll kammarglaset i en inkubator vid 37 °C, 5%CO2, 95% luftfuktighet i 24 timmar.
  4. Bakteriell infektion
    1. Subkultur Salmonella 14028s som innehåller pEVOL-PylRS-AF och pWSK29-sseJ 10TAG, genom utspädning av 100 μL bakteriekultur över natten (från steg 5.2) till 3 ml LB-medium (1:30 spädning) innehållande 35 μg/ml kloramfenikol och 100 μg/ml ampicillin, följt av inkubation vid 37 °C med skakningvid 250 rpm i 5–7 timmar.
      OBS: Under denna fas når kulturerna den sena exponentiella fasen, och bakterierna är mycket invasiva.
    2. Bered 100 mM TCO*A-stamlösning och kompletta medier (tabell 1).
    3. För att initiera HeLa-cellinfektionen, ta ut HeLa-cellerna från inkubatorn och tvätta cellerna med förvärmd DPBS innan du tillsätter 500 μL färsk DMEM (+10% FBS) till varje brunn. Placera kammaren glida tillbaka i CO2-inkubatorn tills infektionen börjar.
    4. Efter 5–7 timmars inkubation späds salmonellakulturen till OD600 = 0,2 i 1 ml DMEM-tillväxtmedium (~3 × 108 cfu/ml). Tillsätt de erforderliga mängderna av Salmonella-inokulatet i varje brunn i kammarglaset så att infektionsmultipliciteten (MOI) är 100.
    5. Inkubera de infekterade cellerna i en CO2-inkubator i 30 minuter. Tvätta cellerna 3x med förvärmd DPBS för att avlägsna extracellulär Salmonella. Ställ in denna tidpunkt på 0 timmar efter infektion. Tillsätt 500 μl komplett medium (tabell 1) innehållande 100 μg/ml gentamicin i 1 timme. Tvätta cellerna 3x med DPBS efter 1 timme. Tillsätt 500 μl av hela mediet (från steg 5.4.2; Tabell 1) kompletterat med 0,2% arabinos, 10 μg/ml gentamicin till varje brunn på kammarglaset.
    6. I ett kontrollexperiment utför liknande infektioner av HeLa-celler utan TCO*A.
    7. Inkubera kammarglaset i 10 timmar i CO 2-inkubatorn.
  5. Klicka på kemibaserad märkning i levande celler
    1. Fortsätt att märka de bakterieinfekterade cellerna. Förvärm hela mediet utan TCO*A (tabell 1).
    2. Efter 10 timmar efter infektion, ersätt hela mediet med nytt komplett medium utan TCO*A och tvätta HeLa-cellerna 4x under ett intervall på 30 minuter vardera med förvärmt DPBS, följt av färskt komplett medium (utan TCO*A).
    3. Bered en 0,5 mM stamlösning av färgtetrazin i DMSO.
      OBS: För märkning av Salmonella-utsöndrade effektorer i värdceller presenteras två protokoll. För protokoll 1, bereds färgämnesblandningen genom att späda JF646-Tz-stam i 1x PBS innehållande 1% kaseinnatriumsalt från bovin mjölk så att den slutliga arbetslösningen är 2 μM. För protokoll 2, förbered varmt komplett medium (utan FBS och TCO * A) och tillsätt 2 μM JF646-Tz. Gör denna färgämnesblandning färsk för varje märkningssession. Arbeta i mörker om möjligt (dämpa lamporna i huven och/eller rummet).
    4. Efter 12 timmar efter infektion, aspirera bort mediet från cellerna. Tvätta cellen med förvärmd DPBS 2x eller 3x. Tillsätt 500 μl av den färglösningsblandning som beskrivs i protokoll 1 i en grupp brunnar och tillsätt 500 μl av den färglösningsblandning som beskrivs i protokoll 2 som nämns i steg 5.5.3 och följande anmärkning i en grupp brunnar. Placera kammaren glider tillbaka in i CO 2-inkubatorn i 1,5-2 h.
    5. Efter 13,5–14 timmar efter infektion, skölj HeLa-cellerna 2x med förvärmd DPBS. Tillsätt 500 μL färsk DMEM (kompletterat med FBS). Placera kammarens glid tillbaka i inkubatorn i 30 minuter. Tvätta cellerna med förvärmd DPBS följt av färsk DMEM 4x under ett intervall på 30 minuter.
    6. Vid 16 timmar efter infektion, fixera HeLa-cellerna med PFA genom att tillsätta 200 μL 4% PFA i varje brunn och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i mörkret. Aspirera av PFA, skölj 3x med PBS och förvara cellerna i PBS vid 4 ° C i mörkret.
      PFA är en mycket giftig kemikalie. Undvik inandning, såväl som hud- och ögonkontakt. Använd skyddsutrustning vid hantering. För att undvika att det märkta provet utsätts för ljus, stäng av ljuset i cellodlingshuven.
  6. Immunfärgning av HA-märkta proteiner
    1. Aspirera av PBS och skölj en gång i blockerande lösning (tabell 1).
    2. Inkubera de fasta HeLa-cellerna med en PBS-baserad primär antikroppslösning (tabell 1) i 1 timme vid rumstemperatur i mörker. Använd en kanin anti-HA primär antikropp för att fläcka utsöndrat SseJ (1:500 spädning).
    3. Efter 1 timme, tvätta försiktigt cellerna 2x med 0,5 ml 0,1% Tween-20/1x PBS. Under tvätten med Tween/PBS-lösning, inkubera cellerna 3x med 0,5 ml 0,1 % Tween20/1x PBS i 5 minuter.
    4. Späd sekundär antikropp åsna anti-kanin 555 1:500 i sekundär antikroppslösning och inkubera i 1 h vid rumstemperatur i mörkret.
    5. Efter 1 timme, tvätta försiktigt cellerna 2x med 0,5 ml 0,1% Tween-20/1x PBS och inkubera 2x med 0,5 ml 0,1% Tween20/1x PBS i 5 minuter.
    6. Tvätta cellerna 3x med 0,5 ml 1x PBS och förvara dem vid 4 ° C i mörkret.
      OBS: Fasta celler kan lagras i ett par veckor i PBS vid 4 ° C. Immunfärgning bör utföras i sista minuten.

6. Konfokal avbildning

  1. Använd ett konfokalmikroskop, till exempel spinnskiva (SD) eller STED-mikroskop.
    1. Justera inställningarna för bildinsamling, till exempel skanningsläge (XYZ), skanningshastighet (400 Hz), upplösning (512 x 512), förstoring (100x) och Z-stapling.
    2. Använd rätt excitations-/emissionsfilter för DAPI, BDP-Tz och JF646-tetrazin.
      OBS: För detta protokoll utfördes konfokal avbildning på ett STED-mikroskopsystem utrustat med en pulserad vit ljuslaser, vilket möjliggjorde val av excitation i intervallet 470–670 nm och en UV 405 nm diodlaser för excitation vid 405 nm, 488 nm och 647 nm. De lämpliga emissionsområdena fastställdes med hjälp av den inbyggda akustooptiska stråldelaren i kombination med en prismabaserad avstämbar multibandspektraldetektering av konfokalsystemet.
    3. Hämta bilderna med ett mål på 100×/1,4 för nedsänkning i olja.

7. Superupplösning (dSTORM) avbildning

  1. Slå på mikroskopet 3 timmar före avbildning för att tillåta termisk jämvikt (drift är mer sannolikt att inträffa om avbildning börjar före detta). Kyl kameran till -70 °C.
  2. Förbered under tiden en ny GLOX-BME-avbildningsbuffert (tabell 1).
  3. Ta cellerna till mikroskopet. Placera bildkammaren på mikroskopsteget i provhållaren. Se till att provet är plant och säkert i hållaren. Byt medium i brunnen med 0,4 ml av den nytillverkade GLOX-BME-avbildningsbufferten.
  4. Ställ in rätt laserlinje och filteruppsättningar. Minska lasereffekten till ~ 1 mW för att identifiera en HeLa-cell av intresse. Justera fokalplanet och laserstrålens vinkel medan du belyser provet med låga 647 nm laserdensiteter (i detta fall föreslås en brant lutande vinkel [HILO], eftersom HILO höjer signal-till-bakgrunden [SBR]). Justera HILO-belysningsvinkeln.
    OBS: I detta protokoll förvärvades superupplösningsavbildning av SseJ i Alexa Fluor 647-kanalen med hjälp av ett inverterat epifluorescensmikroskop (se materialtabellen), utrustad med ett TIRF-mål (100x Apo TIRF-oljenedsänkningsmål, NA 1.49). Fluorescens detekterades med en EMCCD-kamera, som styrdes via μManager.
  5. Ställ in förförstärkarens förstärkning på 3 och aktivera ramöverföringen i μManager. Ställ in EM-gain på 200 för högre känslighet i dSTORM-mätningar, som beskrivits i en tidigare rapport35.
  6. Innan dSTORM-avbildning ska du ta en referensdiffraktionsbegränsad bild av målstrukturen. Byt fluoroforerna till mörkt tillstånd genom att slå på lasern till sin maximala effekt.
    OBS: Individuella, snabbt blinkande molekyler av JF646-fluoroforer observerades när JF646-fluoroforer transformerades till ett övervägande mörkt tillstånd genom kontinuerlig belysning av 647 nm excitationsljus, som beskrivits tidigare36.
  7. Justera laserstyrkan till en lämplig nivå där blinkande händelser separeras i rum och tid, ställ in exponeringstiden till 30 ms och påbörja förvärvet. Skaffa 10 000–30 000 bildrutor.
    OBS: Förändringar i laserstyrka bör göras för att optimera blinkning. Överväg att öka laserintensiteten om det upptäcks för många händelser (blinkande partiklar som överlappar varandra). Den ideala längden beror på provets kvalitet, men ~ 10 000 bilder bör visa urskiljbara funktioner.

8. Bildrekonstruktion av dSTORM

  1. Använd lämplig programvara för bildanalys.
    OBS: ThunderSTORM, ett av många tillgängliga bildrekonstruktionsprogram med öppen källkod, beskrivs kortfattat nedan.
  2. Öppna ImageJ och importera rådata. Öppna ThunderSTORM-plugin och konfigurera kamerainställningen som motsvarar enheten.
  3. Gå till Kör analys och ställ in lämpliga inställningar, till exempel bildfiltrering (skillnad i medelvärdesfilter), lokaliseringsmetoder (lokalt maximum) och subpixellokalisering av molekyler (integrerad Gaussisk PSF). Klicka på OK för att starta bildrekonstruktionen.
    OBS: Vid behov har detaljerade instruktioner för inställning av parametrarna i ThunderSTORM redan beskrivits37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detta protokollpapper beskriver en GCE-baserad metod för platsspecifik fluorescerande märkning och visualisering av Salmonella-utsöndrade effektorer, som visas i figur 1. Den kemiska strukturen hos ncAA-bärande transcyklookten bioortogonal grupp (TCO) och det fluorescerande färgämnet visas i figur 1A. SseJ-märkning uppnåddes genom genetisk inkorporering av bioortogonala ncAAs vid ett bärnstensstoppkodon (se figur 1B) med användning av ett ortogonalt aminoacyl-tRNA-syntetas / tRNA-par via GCE-teknik. Behandling av TCO-märkta effektorer med tetrazinet innehållande en fluorofor (JF646-Tz eller BDP-Tz) gav en alternativ proteinmärkningsstrategi som möjliggjorde observation av translokerade Salmonella-utsöndrade effektorer många timmar efter infektion av värden (figur 1B, C). Vi började med att identifiera möjliga aminosyrarester och valde position 10 av SseJ för ncAA-inkludering baserat på yttillgänglighet och befintlig kunskap om SseJ-funktionella rester. Tidigare konstruktionsdata och ytexponeringsprojektioner kan hjälpa till vid valet av specifika platser.

Placeringen av det bärnstensfärgade kodonet i genen som kodar för POI påverkar effekten av TCO-inkorporering. Som ett resultat bör en serie mutanter med bärnstenskodon i olika positioner av POI-genen skapas och analyseras för optimal integrationseffektivitet. Valet av den gula kodonpositionen är empirisk. I allmänhet bör de förändrade resterna vara icke-väsentliga för POI-funktion, fria från posttranslationella modifieringar och tillgängliga för fluorescerande sonder. Uttrycksplasmiden ska vara ett lågt kopieringsnummer så att den efterliknar IP:ns ursprungliga kopieringsnummer. Kodonkontexten påverkar hur effektivt en ncAA införlivas av ett ortogonalt tRNA/aminoacyl-tRNA-syntetassystem. Medan AAT-TAG-ACT är det föredragna sammanhanget för det ortogonala tRNA, ändrades positionen för fenylalanin-10 av sseJ till TAG, vilket säkerställer AAT-TAG-ACT-sammanhanget för att möjliggöra den mest effektiva införlivandet av ncAA. Först testade vi om mutanterna var funktionella i E. coli med hjälp av en hög kopieringsnummerplasmid för att uttrycka sseJ. Som framgår av SDS-PAGE var SseJ-F10TCO-HA-mutantuttryck beroende av närvaron av TCO*A och motsvarande optimala tRNA/aaRS (figur 2A). SseJ-F10FCO-HA märktes med JF646-Tz med SPIEDAC klickkemi i E. coli. Den selektiva fluorescerande märkningen av SseJ-F10TCO-HA i E. coli in vitro bekräftades genom fluorescensmikroskopianalys (figur 2B). Med GCE införlivades TCO*A således platsspecifikt vid ett bärnstenskodon i sseJ. Försök att direkt identifiera genomisk off-target inkorporering av ncAAs med hjälp av tRNAPyl / PylRSAF-system gav inga bevis för deras existens. Vi rekommenderar dock att du använder fluorescens i gel, Western blot, fluorescerande fusionsprotein, in vitro-fluorescensmärkning och andra metoder för att bedöma effektiviteten, specificiteten, graden av off-target-inkorporering och toxiciteten hos pEVOL-plasmiden, vilket dokumenterats i tidigare rapporterade artiklar som citeras här12,29.

När vi väl fastställt att den undertryckta TAG i sseJ var funktionell klonade vi sseJ-F10TCO-HA tillsammans med dess inbyggda promotor i plasmiden pWSK29 med lågt kopieringsnummer, vilket säkerställde ett AAT-TAG-ACT-motiv för fluorescerande märkning och visualisering. Selektiv in vitro-märkning av SseJ-F10TCO-HA i salmonellaceller bekräftades med hjälp av fluorescensmikroskopi (figur 3). Vi infekterade sedan HeLa-celler med vildtyp Salmonella-stammen kompletterad med p sseJ-HA eller p sseJ 10TAG-HA, i frånvaro eller närvaro av TCO * A för att avgöra om TCO-införlivadeSseJ kunde translokeras till värdceller. Infekterade HeLa-celler fixerades med PFA och immunfärgades med anti-HA-antikroppar 16 timmar efter infektion för att markera SIF: erna dekorerade av SseJ. Som visas i figur 4C utsöndrades uppenbarligen SseJ-F10TCO-HA, SseJ-beroende SIF bildades och de liknade de som observerades i infekterade celler av vildtyp (figur 4A). SseJ-beroende SIF observerades dock inte i frånvaro av TCO*A (figur 4B). Dessa observationer visade att uttrycket av sseJ-F10TCO-HA med GCE räddade SseJ-beroende SIF. Dessutom indikerade resultaten också att SseJ-F10TCO-HA var en fullt fungerande virulensfaktor för Salmonella.

Efter att ha bekräftat att GCE-märkt SseJ var funktionell och utsöndrad använde vi SPIEDAC-reaktionen för att märka SseJ-F10TCO-HA med JF646-Tz i HeLa-celler. För att göra det infekterade vi HeLa-celler med vildtyp Salmonella kompletterad med p sseJ-F10TCO-HA, i närvaro av TCO * A. Efter märkning med JF646-Tz med användning av två alternativa protokoll som beskrivs i protokollavsnitt 5 tvättades cellerna i stor utsträckning för att avlägsna överskott av färgämne, fixerades med PFA och immunfärgades med en anti-HA-antikropp för att visualisera den utsöndrade SseJ-F10TCO-HA. SseJ-F10TCO-HA som utsöndrades i cytoplasman hos HeLa-celler märktes med JF646-Tz (figur 5A, B, röd) och tydligt samlokaliserad med HA-taggen (grön). Observationen att de två etiketterna överlappade varandra (en ett fluorescerande färgämne, den andra märkt genom immunfärgning) betonar ytterligare specificiteten av GCE-märkning.

För att säkerställa att fluorescenssignalen som observerades i dessa HeLa-celler endast var specifik för den utsöndrade effektorn SseJ, infekterade vi celler med vildtyp Salmonella (bär psseJ-HA) i närvaro av TCO * A och pEVOL-PylRS-AF. Ett klickfärgämne användes för att observera om det fanns någon bakgrundsmärkning i HeLa-cellerna. SseJ släpptes ut i värdcellens cytoplasma, utan intracellulära eller icke-specifika fluorescerande signaler (figur 5C), vilket visar att fluorescenssignalen var specifik för SseJ. Efter att ha fastställt att ncAAs införlivades specifikt vid ett bärnstenskodon och att utsöndrat SseJ kunde visualiseras i värdcellen via klickreaktionen, var nästa mål att skapa en superupplöst bild av utsöndrad SseJ i HeLa-celler (figur 6). I figur 6 demonstrerar vi kraften hos GCE och användningen av JF646-färgämnet för att generera platsspecifika superupplösningsbilder av den Salmonella-utsöndrade effektorn SseJ i HeLa-celler.

Figure 1
Figur 1: Schema för platsspecifik fluorescerande märkning av SPI-2-effektorer. a) TCO*A och JF-646-tetrazin. (B) Schemat visar införlivandet av en ncAA i en SPI-2-effektor. I bakteriecellen introduceras en plasmid innehållande genen för ett effektor POI (lila) och ett ortogonalt suppressor tRNA (rött)/aminoacylsyntetas (grönt) par. Ett naturligt kodon byts ut mot ett gult (TAG, rött) stoppkodon i effektorgensekvensen på en tillåtande plats. ncAA (mörkröd cirkel) införs helt enkelt i tillväxtmediet. Det plockas sedan upp av cellen och når cytosolen, där det är kopplat till det ortogonala tRNA av aminoacyl-tRNAsyntetas (aaRS). Det ncAA-acylerade tRNA med ett CUA-antikodon kommer in i ribosomalt maskineri som ett resultat av det komplementära bärnstenskodonet på effektorn mRNA (lila), som införlivar den bifogade ncAA i effektorn. NCAA bärs av effektorställets polypeptidkedja i full längd, som sedan viks och monteras till ett funktionellt effektorprotein. Den nyproducerade effektorn translokeras in i värdcellen genom T3SS. En externt tillförd fluorofor kan användas för att märka en utsöndrad SPI-2-effektor integrerad med ncAA. (C) Kopparfritt klickreaktionsschema med ett fluorogent tetrazinfärgämne. Genom SPIEDA-klickreaktionen reagerar en ncAA med en ansträngd alkengrupp införlivad i en POI (SseJ) med ett tetrazinkopplat färgämne (JF646-Tz). Det fluorogena, tetrazinkopplade färgämnet JF646-Tz blir fluorescerande (rött) först efter framgångsrik märkning. Förkortningar: TCO*A = transcyklookt-2-en-L-lysin; ncAA = icke-kanonisk aminosyra; T3SS = sekretionssystem av typ tre; SPI-2 = Salmonellapatogenicitet ö 2; POI = protein av intresse; SPIEDAC = stamfrämjad invers elektron-efterfrågan Diels-Alder cykloaddition. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2:TCO*A är platsspecifikt införlivad i SseJ-F10TCO-HA uttryckt i E. coli. (A) Coomassie-färgad SDS-PAGE bekräftar den selektiva införlivandet av TCO*A i SseJ-F10TCO-HA (indikerat med röd pil) in E. coli. (B) Uttryck av SseJ-F10TCO-HA i E. coli analyserade med fluorescensmikroskopi i frånvaro (överst) eller närvaro (botten) av 1 mM TCO * A. E. coli-celler som uttrycker SseJ-F10TCO-HA i frånvaro eller närvaro av TCO * A inkuberas med BDP-Fl-tetrazin och avbildas för BDP-fluorescens (grön). SseJ-fluorescens (grön) observeras endast i närvaro av den inbyggda TCO*A-etiketten. Observera frånvaron av bakgrundsfluorescens i toppanelen. Skalstång = 2 μm. Förkortningar: TCO*A = transcyklookt-2-en-L-lysin; BF = ljusfält; HA = hyaluronsyra. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: TCO*A är platsspecifikt införlivad i SseJ-F10TCO-HA uttryckt i Salmonella. Fluorescensmikroskopi används för att undersöka uttrycket av SseJ-F10TCO-HA i Salmonella i frånvaro (överst) eller närvaro (botten) av 1 mM TCO*A. Salmonella som uttrycker SseJ F10TCO-HA behandlas med JF646-Tz och avbildas för JF646 fluorescens (magenta), i närvaro eller frånvaro av TCO*A. Fluorescens av SseJ (magenta) detekteras endast när TCO*A är närvarande. Skalstång = 2 μm. Förkortningar: TCO*A = transcyklookt-2-en-L-lysin; BF = ljusfält; HA = hyaluronsyra. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Utsöndrad SseJ-J10TCO-HA är funktionell. (A) HeLa-celler är infekterade med Salmonella som hyser psseJ-HA i 16 timmar, fixerade och immunfärgade med anti-HA-antikroppar (röd), LPS (grön) och DAPI (blå). Som förväntat observeras bildandet av SseJ-beroende SIF i infekterade celler. (B) I frånvaro av TCO*A undertrycks inte det gula kodonet och SseJ-beroende SIF saknas i infekterade HeLa-celler. HeLa-celler är infekterade med Salmonella som uttrycker SseJ-F10TCO-HA i frånvaro av TCO*A i 16 timmar, fixerade och immunfärgade med anti-HA-antikroppar (röd), LPS (grön) och DAPI (blå). (C) SseJ-beroende SIF observeras i närvaro av TCO*A. Infekterade HeLa-celler med Salmonella som uttrycker SseJ-F10TCO-HA i närvaro av 400 μM TCO*A fixeras och immunfärgas med anti-HA-antikroppen SseJ (röd), LPS (grön) och DAPI (blå). SseJ-beroende SIF observeras i den vänstra panelen, vilket tydligt indikerar att SseJ räddades genom uttrycket av sseJ-F10TCO-HA med GCE. Skalstång = 10 μm. Förkortningar: HA = hyaluronsyra; LPS = lipopolysackarid; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; TCO*A = transcyklookt-2-en-L-lysin; SIF = Salmonellainducerade filament; GCE = genetisk kodutvidgning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Märkning av specificitet av SseJ med JF646-Tz-färgämne. (A) HeLa-celler är infekterade med Salmonella som uttrycker SseJ-F10TCO-HA i närvaro av 400 μM TCO * A. TCO-märkt utsöndrad SseJ-F10TCO-HA är märkt med 2 μM JF646-Tz i 1x PBS innehållande 1% kaseinnatriumsalt från nötkreatursmjölk, omfattande tvättat, fixerat och immunfärgat med anti-HA-antikropp för att visualisera den utsöndrade SseJ (grön). SseJ-F10TCO-HA utsöndras och märks med JF646-Tz färgämne (röd, vänster panel). SseJ märkt via GCE (röd) och HA (grön) är tydligt samlokaliserade (höger panel). (B) Med hjälp av ett något annorlunda märkningsprotokoll märks TCO-märkt utsöndrad SseJ-F10TCO-HA också med 2 μM JF646-Tz i komplett medium DMEM (utan FBS), tvättas i stor utsträckning och fixeras och utsätts för anti-HA-immunofluorescensfärgning. Utsöndrad SseJ-F10TCO-HA är märkt med JF646-Tz-färgämne (röd, vänster panel) och samlokaliserad med HA (grön). (C) För att ytterligare fastställa att fluorescenssignalen är unik för SseJ och inte en produkt av andra SPI-2-frisatta proteiner, är HeLa-celler infekterade med vildtyp Salmonella som bär psseJ-HA och pEVOL-PylRS-AF, i närvaro av ncAA (TCO * A). Vid 16 timmar efter infektion behandlas infekterade HeLa-celler med 2 μM JF646-Tz i komplett medium (utan FBS och TCO*A), och överskottet av färgämne avlägsnas noggrant med hjälp av nytt tillväxtmedium. HeLa-celler är PFA-fixerade och tvättas noggrant med PBS innan de immunfärgas för SseJ (grön). Bristen på synlig bakgrundsfluorescenssignal i den vänstra panelen (JF646-Tz) indikerar att nästan ingen off-target-märkning inträffade i värdcellerna. Skalstång = 10 μm. Förkortningar: HA = hyaluronsyra; PBS = fosfatbuffrad saltlösning; FBS = fetalt bovint serum; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; TCO*A = transcyklookt-2-en-L-lysin; SIF = Salmonellainducerade filament; GCE = genetisk kodutvidgning; SPI-2 = Salmonellapatogenicitet ö 2; BF = ljusfält. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Superupplösningsavbildning av GCE-märkt SseJ i HeLa-celler. HeLa-celler är infekterade med Salmonella som uttrycker SseJ-F10TCO-HA i närvaro av 400 μM TCO*A. TCO-märkt utsöndrad SseJ-F10TCO-HA är märkt med 2 μM JF646-Tz under fysiologiska förhållanden som beskrivs i protokollet och tvättas sedan i stor utsträckning. Bilder hämtas med Nikon N-STORM. (A) Brightfield-bild av en HeLa-cell under observation. Skalstapel = 10 μm. (B) Diffraktionsbegränsad, widefield-bild av utsöndrad SseJ märkt med TCO*A och JF-646. Skalstapel = 10 μm. (C) Motsvarande dSTORM-bild av de SseJ-dekorerade SIF: erna. Skalstapel = 10 μm. C(i) Infälld visar en förstorad vy av superupplöst SseJ i det boxade området. Skalstapel = 1 μm. Förkortningar: HA = hyaluronsyra; TCO*A = transcyklookt-2-en-L-lysin; SIF = Salmonellainducerade filament; GCE = genetisk kodutvidgning; WF = bredfält; BF = ljusfält. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1. Lösningar. Klicka här för att se en större version av denna tabell.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Tillvägagångssättet som beskrivs här användes för att spåra den exakta platsen för effektorproteiner som injicerades i värdcellen av bakteriella T3SS efter infektion. T3SS används av intracellulära patogener såsom Salmonella, Shigella och Yersinia för att transportera virulenskomponenter in i värden. Utvecklingen av superupplösningsbildteknik har gjort det möjligt att visualisera virulensfaktorer med en tidigare ofattbar upplösning12,13,24. Vissa märkningsbegränsningar förhindrade dock mer djupgående undersökningar, eftersom fotoaktiverbara proteinfusioner blockerar T3SS-poren och inte utsöndras. Dessutom kan klustringsartefakter och felaktig analys bero på vissa fusionsproteiners inneboende benägenhet att kluster eller aggregat.

I vissa fall spjälkas även fusionsproteinet, vilket vi observerat tidigare med PAmCherry-SsaP12,13. Alla dessa begränsningar övervinns av GCE, vilket möjliggör platsspecifik fluorescerande märkning av intressepunkter. Det möjliggör också visualisering av proteiner som inte är rikliga12,13. Även om det finns ett antal faktorer som kan påverka effektiviteten av ncAA-inkorporering med hjälp av ett ortogonalt tRNA / aminoacyl-tRNA-syntetassystem, verkar det som att kodonkontexten är den mest avgörande. Det ortogonala tRNA innehåller en ncAA mest effektivt när den föredragna kodonkontexten är AATTAGACT33. I figur 5 kan vi jämföra den skarpa märkningen som härrör från GCE och en platsspecifik fluorofor (liksom frånvaron av bakgrund) jämfört med immunfärgning av en HA-tag.

Som ett resultat kommer forskare att kunna visualisera POI i patogener, kommensala bakterier och eukaryota värdar med hjälp av metoden som beskrivs här. Kort sagt, genetiskt kodade ncAAs ger ett alternativt tillvägagångssätt för effektorproteinmärkning när konventionella metoder misslyckas. En stor begränsning av denna metod är emellertid fluoroforens inneboende kemiska egenskaper, såsom membranpermeabilitet, distribution och retention, vilket kan påverka effektiviteten hos fluorescerande märkning. Fluorescerande ncAA är ett alternativ för att undvika klickreaktioner12, men dessa kan endast visualiseras med hjälp av tvåfotonmikroskopi. Läsarna hänvisas till en lista över cellmembranpermeabla / ogenomträngliga färgämnen som citeras häri 12,38,39,40,41.

Sammanfattningsvis märkte och visualiserade vi Salmonella-utsöndrad effektor SseJ genom att genetiskt koda ncAAs i kombination med en fluorogen fluorofor utan att försämra dess biologiska funktion. Märkning av SseJ med JF646-Tz var mycket specifik, och superupplösningsavbildning kan vidare användas för att visualisera utsöndrade effektorer inuti värdceller. Således möjliggjorde fluorescerande märkning av bakteriella effektorer med användning av dSTORM-kompatibla färgämnen och genetisk kodutvidgning den subcellulära rumsliga lokaliseringen av bakteriella utsöndrade effektorer i värdceller, vid en upplösning under diffraktionsgränsen. Eftersom denna märkningsplattform är kompatibel med spårning av enstaka partiklar med levande celler, kommer vår metod att göra det möjligt att analysera effektorproteiner i T3SS-systemet med oöverträffade nivåer av tidsmässig och rumslig upplösning, vilket kommer att förbättra vår molekylära förståelse av bakteriell patogenes.

Även om det finns vissa begränsningar, såsom dålig ncAA-inkorporeringseffektivitet och de fotofysiska begränsningarna för den organiska fluoroforen, har vi visat att detta tillvägagångssätt kan hjälpa forskare att observera och lokalisera en utsöndrad effektor inuti värdceller, även när den är knapp12,13. Vi förväntar oss att anpassningen av tekniken kommer att öppna nya och spännande möjligheter för avbildning och forskning på andra effektorproteiner som produceras av bakterier vid infektion. Metoden är också lätt anpassad för märkning av virus, vilket visar dess breda användbarhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av startfonder från University of Texas Medical branch, Galveston, TX och ett Texas STAR-pris till JK. Vi tackar professor Edward Lemke (European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg, Tyskland) för plasmiden pEVOL-PylRS-AF. Bilderna i figur 1 skapades med BioRender.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Tris/Glycine SDS running buffer BIO-RAD 1610732
Ammonium chloride Fischer Scientific A661-500
Ammonium sulphate Fischer Scientific BP212R-1
Ampicillin Sodium Sigma-Aldrich A0166 5 g
Antibiotic-Antimycotic (100x) ThermiFischer Scientific 15240096
Arabinose Sigma-Aldrich A3256 500 g
Avanti J-26XP (High-Performance Centrifuge) Beckman Coulter
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
BDP-FL-tetrazine Lumiprobe (USA) 2.14E+02
β-mercaptoethanol Millipore 444203 250 mL
Bromophenol blue Sigma-Aldrich B8026
BSA Sigma-Aldrich A4503 500 g
Casein Sigma-Aldrich C8654
Catalase Sigma-Aldrich C9322
Chloramphenicol Sigma-Aldrich C1919
Click Amino Acid / trans-Cyclooct-2-en – L - Lysine (TCO*A) SiChem GmbH SC-8008 Size: 500 mg
DAPI (Hoechst33342) Invitrogen H3570
DeNovix DS-11+ Spectrophotometer DeNovix
DMEM* Corning 10-013-CV * Used for maintaining HeLa Cell
DMEM** Gibco 11965-092 **Used for bacterial infection in presence of ncAA, see section 5.4.
DMSO Sigma-Aldrich D8418 250 g
Donkey anti-rabbit Alexa fluoro555 secondary antibody Invitrogen A-31572
DPBS, 1x Corning 21-031-CV
E. coli strain BL21 (DE3) Novagen (Madison, WI)
EMCCD Camera Andor iXon Ultra 897-BV
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 mL (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Fetal Bovine Serum (FBS) Fischer 10082147
Fisherbrand Syringe Filters - Sterile (PVDF 0.22 µm) Fischer Scientific 97203 Pack of 100
Gene Pulser Xcell Electroporator BIO-RAD 1652660
Gentamycin Sigma-Aldrich G1272 10 mL
Gibco L-Glutamine (200 mM), 100x Fischer Scientific 25-030-081
Glucose oxidase Sigma-Aldrich G7141-50KU
Glycerol Fischer Scientific BF229-4
HeLa cells ATTC CCL-2
HEPES Buffer Corning 25-060-C1 100 mL
Hydrocloric acid Fischer Scientific A144-212
ImageJ Image processing and analysis:  http://rsbweb.nih.gov/ij
IntantBlue Expedeon ISB1L Coomassie-based stain
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
Janelia Fluoro 646-tetrazine Tocris Bioscience 7279
Kanamycin Sigma-Aldrich 60615 5 g
LB Broth BD Difco 244620 500 g
Lysozyme Sigma-Aldrich L6876
μManager (v. 1.4.2) https://micro-manager.org/Download_Micro-Manager_Latest_Release
MES Sigma-Aldrich M3671 250 g
Micro pulser cuvette BIO-RAD 165-2086 0.2 cm electrode gap, pkg. of 50
Nikon N-STORM Nikon Instruments Inc. https://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/super-resolution-microscopes/n-storm-super-resolution
Nunc EasYFlask Cell Culture Flasks ThermiFischer Scientific 156499
Omnipur Casamino Acid Calbiochem 2240 500 g
Paraformaldehhyde (PFA) Electron Microscopy Sciences  15710
PBS (10x) Roche 11666789001
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) GenDEPOT  CA005-010 100 mL
pEVOL-PylRS-AF For plasmid construction and map see following references
1. Angew Chem Int Ed Engl. 2011, 50(17), 3878-81.
2. Angew Chem Int Ed Engl., 2012, 51, 4166-70.
Plasmid Mini-prep Kit Qiagen 27106
plasmid pWSK29-sseJ10TAG-HA Ref.: elife. 2021, 10, e67789.
plasmid pWSK29-sseJ-HA Ref.: elife. 2021, 10, e67789.                                                                   Vector map of PWSK29: https://www.addgene.org/172972/
Pluronic F-127 Millipore 540025 Protein grade, 10% Solution
Potassium phosphate monobasic Fischer Scientific P285-500
Potassium sulphate Acros Organic 424220250
Protease Inhibitor Cocktail Set I - Calbiochem Sigma-Aldrich 539131 100x Solution
Rabbit anti-HA primary antibody Sigma-Aldrich H6908
S. enterica. serovar Typhimurium 14028s Ref.: PLoS Biol. 2015, 13, e1002116.
Saponin Sigma-Aldrich 47036-50G-F
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sigma-Aldrich L3771
Sodium hydroxide Fischer Scientific SS255-1
Sodium Pyruvate (100 mM), 100x Corning 25-060-C1 100 mL
Sonic Dismembrator Model 100 Fischer Scientific 24932
STED microsocpe (Leica TCS SP8 STED 3X system) Leica Microsystems, Wetzlar, Germany https://www.leica-microsystems.com/products/confocal-microscopes/p/leica-tcs-sp8-sted-one/
ThunderSTORM https://zitmen.github.io/thunderstorm/
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Trypsin-EDTA (1x), 0.25%   GenDEPOT  CA014-010
Tween-20 Sigma-Aldrich P9416 100 mL
X-well tissue culture chamber slides SARSTEDT 94.6190.802

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Marlovits, T. C., et al. Structural insights into the assembly of the type III secretion needle complex. Science. 306 (5698), 1040-1042 (2004).
  2. Kubori, T., et al. Supramolecular structure of the Salmonella typhimurium type III protein secretion system. Science. 280 (5363), 602-605 (1998).
  3. LaRock, D. L., Chaudhary, A., Miller, S. I. Salmonellae interactions with host processes. Nature Reviews Microbiology. 13 (4), 191-205 (2015).
  4. Galan, J. E., Waksman, G. Protein-injection machines in bacteria. Cell. 172 (6), 1306-1318 (2018).
  5. Feng, X., Oropeza, R., Kenney, L. J. Dual regulation by phospho-OmpR of ssrA/B gene expression in Salmonella pathogenicity island 2. Molecular Microbiology. 48 (4), 1131-1143 (2003).
  6. Walthers, D., et al. Salmonella enterica response regulator SsrB relieves H-NS silencing by displacing H-NS bound in polymerization mode and directly activates transcription. Journal of Biological Chemistry. 286 (3), 1895-1902 (2011).
  7. Chakraborty, S., Mizusaki, H., Kenney, L. J. A FRET-based DNA biosensor tracks OmpR-dependent acidification of Salmonella during macrophage infection. PLoS Biology. 13 (4), e1002116 (2015).
  8. Liew, A. T. F., et al. Single cell, super-resolution imaging reveals an acid pH-dependent conformational switch in SsrB regulates SPI-2. eLife. 8, e45311 (2019).
  9. Knuff, K., Finlay, B. B. What the SIF is happening-the role of intracellular Salmonella-induced filaments. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 335 (2017).
  10. Drecktrah, D., et al. Dynamic behavior of Salmonella-induced membrane tubules in epithelial cells. Traffic. 9 (12), 2117-2129 (2008).
  11. Garcia del-Portillo, F., Zwick, M. B., Leung, K. Y., Finlay, B. B. Salmonella induces the formation of filamentous structures containing lysosomal membrane glycoproteins in epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90 (22), 10544-10548 (1993).
  12. Singh, M. K., Zangoui, P., Yamanaka, Y., Kenney, L. J. Genetic code expansion enables visualization of Salmonella type three secretion system components and secreted effectors. elife. 10, e67789 (2021).
  13. Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-resolution imaging of bacterial pathogens and visualization of their secreted effectors. FEMS Microbiology Reviews. 45 (2), fuaa050 (2020).
  14. Akeda, Y., Galan, J. E. Chaperone release and unfolding of substrates in type III secretion. Nature. 437 (7060), 911-915 (2005).
  15. Su, W. W. Fluorescent proteins as tools to aid protein production. Microbial Cell Factories. 4 (1), 12 (2005).
  16. Wang, S., Moffitt, J. R., Dempsey, G. T., Xie, X. S., Zhuang, X. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for single-molecule-based superresolution imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (23), 8452-8457 (2014).
  17. Ghodke, H., Caldas, V. E. A., Punter, C. M., van Oijen, A. M., Robinson, A. Single-molecule specific mislocalization of red fluorescent proteins in live Escherichia coli. Biophysical Journal. 111 (1), 25-27 (2016).
  18. Gahlmann, A., Moerner, W. E. Exploring bacterial cell biology with single-molecule tracking and super-resolution imaging. Nature Reviews Microbiology. 12 (1), 9-22 (2014).
  19. Keppler, A., et al. A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo. Nature Biotechnology. 21 (1), 86-89 (2003).
  20. Gautier, A., et al. An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chemical Biology. 15 (2), 128-136 (2008).
  21. Young, A. M., Minson, M., McQuate, S. E., Palmer, A. E. Optimized fluorescence complementation platform for visualizing Salmonella effector proteins reveals distinctly different intracellular niches in different cell types. ACS Infectious Diseases. 3 (8), 575-584 (2017).
  22. Martin, B. R., Giepmans, B. N., Adams, S. R., Tsien, R. Y. Mammalian cell-based optimization of the biarsenical-binding tetracysteine motif for improved fluorescence and affinity. Nature Biotechnology. 23 (10), 1308-1314 (2005).
  23. Adams, S. R., et al. New biarsenical ligands and tetracysteine motifs for protein labeling in vitro and in vivo: Synthesis and biological applications. Journal of the American Chemical Society. 124 (21), 6063-6076 (2002).
  24. Gao, Y., Spahn, C., Heilemann, M., Kenney, L. J. The pearling transition provides evidence of force-driven endosomal tubulation during Salmonella infection. mBio. 9 (3), e01083-e01018 (2018).
  25. Brumell, J. H., Goosney, D. L., Finlay, B. B. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules. Traffic. 3 (6), 407-415 (2002).
  26. Lang, K., Chin, J. W. Cellular incorporation of unnatural amino acids and bioorthogonal labeling of proteins. Chemical Reviews. 114 (9), 4764-4806 (2014).
  27. Davis, L., Chin, J. W. Designer proteins: applications of genetic code expansion in cell biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (3), 168-182 (2012).
  28. Chin, J. W., et al. Addition of p-azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  29. Kipper, K., et al. Application of noncanonical amino acids for protein labeling in a genomically recoded Escherichia coli. ACS Synthetic Biology. 6 (2), 233-255 (2017).
  30. Uttamapinant, C., et al. Genetic code expansion enables live-cell and super-resolution imaging of site-specifically labeled cellular proteins. Journal of American Chemical Society. 137 (14), 4602-4605 (2015).
  31. Plass, T., et al. Amino acids for Diels-Alder reactions in living cells. Angewandte Chemie International Edition. 51 (17), 4166-4170 (2012).
  32. Lang, K., et al. Genetic encoding of bicyclononynes and trans-cyclooctenes for site-specific protein labeling in vitro and in live mammalian cells via rapid fluorogenic Diels-Alder reactions. Journal of the American Chemical Society. 134 (25), 10317-10320 (2012).
  33. Xu, H., et al. Re-exploration of the codon context effect on amber codon-guided incorporation of noncanonical amino acids in Escherichia coli by the blue-white screening assay. ChemBioChem. 17 (13), 1250-1256 (2016).
  34. Nakamura, Y., Gojobori, T., Ikemura, T. Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000. Nucleic Acids Research. 28 (1), 292 (2000).
  35. Spahn, C., et al. Sequential super-resolution imaging of bacterial regulatory proteins: the nucleoid and the cell membrane in single, fixed E. coli cells. Methods in Molecular Biology. 1624, 269-289 (2017).
  36. Grimm, J., English, B., Chen, J., et al. A general method to improve fluorophores for live-cell and single-molecule microscopy. Nature Methods. 12 (3), 244-250 (2015).
  37. Xu, J., Ma, H., Liu, Y. Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Current Protocols in Cytometry. 81 (1), 12-46 (2017).
  38. Meineke, B., Heimgärtner, J., Eirich, J., Landreh, M., Elsässer, S. J. Site-specific incorporation of two ncAAs for two-color bioorthogonal labeling and crosslinking of proteins on live mammalian cells. Cell Reports. 31 (12), 107811 (2020).
  39. Bessa-Neto, D., et al. Bioorthogonal labeling of transmembrane proteins with non-canonical amino acids unveils masked epitopes in live neurons. Nature Communications. 12 (1), 6715 (2021).
  40. Beliu, G., et al. Bioorthogonal labeling with tetrazine-dyes for super-resolution microscopy. Communication Biology. 2, 261 (2019).
  41. Arsić, A., Hagemann, C., Stajković, N., Schubert, T., Nikić-Spiegel, I. Minimal genetically encoded tags for fluorescent protein labeling in living neurons. Nature Communications. 13 (1), 314 (2022).

Tags

Biologi utgåva 192 Salmonella icke-kanoniska aminosyror genetisk kodutvidgning SseJ superupplösning dSTORM
Superupplösningsavbildning av bakteriella utsöndrade proteiner med hjälp av genetisk kodexpansion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Singh, M. K., Kenney, L. J.… More

Singh, M. K., Kenney, L. J. Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion. J. Vis. Exp. (192), e64382, doi:10.3791/64382 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter