Summary
Met lipiden beladen hepatocyten zijn inherent aan leverregeneratie, maar gaan meestal verloren bij centrifugatie van dichtheidsgradiënt. Hier presenteren we een geoptimaliseerd celisolatieprotocol dat steatotische hepatocyten behoudt, wat representatieve populaties van regenererende hepatocyten oplevert na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen.
Abstract
Partiële hepatectomie is op grote schaal gebruikt om leverregeneratie bij muizen te onderzoeken, maar de isolatie van hoge opbrengsten van levensvatbare hepatocyten voor downstream eencellige toepassingen is een uitdaging. Een duidelijke accumulatie van lipiden in regenererende hepatocyten wordt waargenomen tijdens de eerste 2 dagen van normale leverregeneratie bij muizen. Deze zogenaamde transient regeneration-associated steatose (TRAS) is tijdelijk maar overlapt gedeeltelijk de belangrijkste proliferatieve fase. Dichtheidsgradiëntzuivering is de ruggengraat van de meeste bestaande protocollen voor de isolatie van primaire hepatocyten. Omdat gradiëntzuivering afhankelijk is van de dichtheid en grootte van cellen, scheidt het niet-steatotische van steatotische hepatocytenpopulaties. Daarom gaan vette hepatocyten vaak verloren, wat niet-representatieve hepatocytenfracties oplevert.
Het gepresenteerde protocol beschrijft een eenvoudige en betrouwbare methode voor de in vivo isolatie van regenererende hepatocyten, ongeacht hun lipidegehalte. Hepatocyten van mannelijke C57BL/6-muizen worden 24-48 uur na hepatectomie geïsoleerd door een klassieke tweestaps collagenaseperfusiebenadering. Een standaard peristaltische pomp drijft de verwarmde oplossingen via de gekatheteriseerde inferieure vena cava in het restant, met behulp van een retrograde perfusietechniek met uitstroom door de poortader. Hepatocyten worden gedissocieerd door collagenase voor hun afgifte uit de Glisson-capsule. Na het wassen en zorgvuldig centrifugeren kunnen de hepatocyten worden gebruikt voor eventuele downstream-analyses. Concluderend beschrijft dit artikel een eenvoudige en reproduceerbare techniek voor de isolatie van een representatieve populatie van regenererende hepatocyten na gedeeltelijke hepatectomie bij muizen. De methode kan ook helpen bij de studie van leververvetting.
Introduction
De lever kan zichzelf regenereren, zelfs na groot weefselverlies. Dit unieke regeneratieve vermogen wordt expliciet geïllustreerd door het experimentele model van partiële (70%) hepatectomie, voor het eerst beschreven bij ratten door Higgins en Anderson in 19311. In dit model wordt 70% van de lever operatief verwijderd van dieren door grotere leverkwabben af te knippen. De resterende lobben groeien vervolgens door compenserende hypertrofie om de oorspronkelijke levermassa binnen ongeveer 1 week na de operatie te herstellen, zij het zonder herstel van de oorspronkelijke leverarchitectuur 2,3. Aanvullende hepatectomie met verschillende hoeveelheden weefselverwijdering zijn ontwikkeld, zoals 86% verlengde hepatectomie waarbij het leverrestant te klein is om te herstellen, wat uiteindelijk leidt tot posthepatectomie leverfalen (PHLF) en daaropvolgende dood bij 30% -50% van de dieren 4,5,6. Deze modellen maken de studie van normale en mislukte leverregeneratie mogelijk, afhankelijk van de hoeveelheid gereseceerd weefsel (figuur 1).
Hoewel muismodellen van hepatectomie al vele jaren met succes worden gebruikt, hebben pas onlangs meer geavanceerde analytische methoden een dieper inzicht op eencellig niveau mogelijk gemaakt. Voor de meeste van deze methoden is de aanwezigheid van individuele hepatocyten echter een basisvoorwaarde. De meeste protocollen voor de isolatie van primaire hepatocyten zijn gebaseerd op een tweestaps collagenaseperfusietechniek en daaropvolgende dichtheidsgradiëntzuivering om levensvatbare hepatocyten te scheiden van puin en niet-parenchymaal, evenals dode cellen 7,8,9. Deze methode werd voor het eerst beschreven door Berry en Friend in 196910 en aangepast door Seglen en collega's in 197211,12. Omdat gradiëntcentrifugatie echter afhankelijk is van de dichtheid en grootte van cellen, gaan lipide-beladen hepatocyten vaak verloren tijdens standaardzuivering. Hoewel een dergelijk verlies voor veel onderzoeksvragen verwaarloosbaar kan zijn, is het een cruciaal aspect voor vroege leverregeneratie. Tijdens de eerste 2 dagen accumuleren hepatocyten in de regenererende muizenlever lipiden, waardoor ze in omvang toenemen en in dichtheid dalen. Deze voorbijgaande regeneratie-geassocieerde steatose (TRAS) dient om regeneratieve brandstof te leveren en is tijdelijk, maar overlapt gedeeltelijk de belangrijkste proliferatieve fase en is ongelijk verdeeld binnen de leverkwabben - de functionele eenheden van de lever13,14. Na verlengde 86%-hepatectomie treedt TRAS echter ook op, maar blijft bestaan, omdat de regeneratie is vastgelopen en lipiden niet worden geoxideerd14. Daarom zal gradiëntzuivering van hepatocyten na 70% - of 86% -hepatectomie niet-representatieve fracties opleveren, omdat de meeste lipide-beladen hepatocyten verloren gaan vanwege hun lage dichtheid15.
In dit aangepaste isolatieprotocol worden hepatocyten van C57BL/6-muizen 24-48 uur na hepatectomie geïsoleerd door een klassieke tweestaps collagenaseperfusiebenadering. Meestal worden cannulatie en perfusie van het restant voor celisolatie gedaan via de poortader. De portovasculaire weerstand in kleine resten die overblijven na een grote resectie is echter hoog16, en dus is perfusie delicaat. Omdat de vena cava onaangetast blijft door hepatectomie, kan perfusie gemakkelijk in retrograde richting worden uitgevoerd via cannulatie van de vena cava. Een standaard peristaltische pomp drijft de verwarmde oplossingen via de gekatheteriseerde inferieure vena cava in het leverrest, met behulp van retrograde perfusie met uitstroom door de poortader (aanvullende figuur S1). Hepatocyten worden gedissocieerd door collagenasen en vrijgegeven uit de Glisson-capsule. Na het wassen en zorgvuldig verwerken van levensvatbare hepatocyten door stapsgewijze isolatie met behulp van een centrifugatiebenadering met lage snelheid, kunnen de hepatocyten worden gebruikt voor eventuele downstream-analyses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven waren in overeenstemming met de Zwitserse federale diervoorschriften en goedgekeurd door het Veterinair Bureau van Zürich (nr. 007/2017, 156/2019) om de menselijke zorg te garanderen. Mannelijke C57BL/6 muizen in de leeftijd van 10-12 weken werden gehouden op een 12 uur dag/nacht cyclus met gratis toegang tot voedsel en water. Elke experimentele groep bestond uit zes tot acht dieren. Zie de Materiaaltabel voor details met betrekking tot alle materialen, apparatuur en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.
1. Partiële hepatectomie bij muizen
- Voor standaard hepatectomie (70%) ligate en reseceer de linker laterale kwab, het rechterdeel van de mediane kwab en het linker deel van de mediane kwab (figuur 1B). Verwijder voor uitgebreide hepatectomie (86%)4 ook de caudate lobben en de rechter voorkwab (figuur 1C).
- OPMERKING: Standaard hepatectomie is een procedure die al vele jaren wordt gebruikt in leverregeneratieonderzoek. Protocollen voor deze procedure zijn beschikbaar3,17, inclusief het video-ondersteunde protocol van Mitchell en Willenbring 18. Meer informatie over de technieken die hier worden gebruikt voor hepatectomie is te vinden in Aanvullend Dossier 1.
Figuur 1: Standaard (70%) en uitgebreide (86%) hepatectomie bij muizen. (A) De vijf leverkwabben van muizen en hun respectieve bijdragen aan het totale levergewicht. (B) Schematische illustratie van 70%-hepatectomie bij muizen. De donkere kwabben vertegenwoordigen het toekomstige leverrestant. (C) Schematische illustratie van 86%-hepatectomie bij muizen. De donkere kwabben vertegenwoordigen het toekomstige leverrestant. (D) Precieze volume van gereseceerd weefsel na 70%- en 86%-hepatectomie. (E) Muizenbuik onmiddellijk na 70%-hepatectomie; (F) muizenbuik onmiddellijk (links) en 48 uur (rechts) na 86%-hepatectomie. Let op de bleke kleur van het steatotische overblijfsel (witte pijl). n = 6-7/groep. Afkortingen: sHx = standaard hepatectomie; eHx = uitgebreide hepatectomie; LW = levergewicht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Bereiding van de perfusieoplossingen
- Bereid de perfusie-, verterings- en conserveringsbuffers voor (zie tabel 1).
- Stel de pH van alle bufferoplossingen in op 37 °C door zo nodig natriumhydroxide (NaOH) of waterstofchloride (HCl) toe te voegen. De optimale pH voor de buffers is 7,4.
- Leg de conserveringsbuffer en Williams' Medium E op ijs.
- Bereid de flowcytometriebuffer voor en bewaar deze op ijs.
Tabel 1: Oplossingen en buffers die worden gebruikt voor de vertering en zuivering van hepatocyten. Klik hier om deze tabel te downloaden.
3. Voorbereiding van perfusieapparatuur
- Verwarm het waterbad tot 42 °C en plaats de perfusiebuffer (50 ml) en de vergistingsbuffer (10-20 ml) in het waterbad. Voeg nog geen collagenase toe aan de verteringsbuffer.
- Bereid de peristaltische pomp voor en plaats de slang. De volledige perfusie-instelling is weergegeven in figuur 2.
- Sluit een 26 G IV-canule aan op het uitlaatuiteinde van de slang met behulp van een Luer-vergrendelingsconnector. Steek het inlaatuiteinde van de buis in de voorverwarmde perfusiebufferbuis in het waterbad. Spoel de slang met 70% ethanol, gevolgd door 50 ml steriel natriumchloride (NaCl 0,9%). Primeer de slang met warme perfusiebuffer (pompsnelheid van 3 ml/min).
- Verdoof de muis met isofluraan inhalatie-anesthesie (800 ml / min O 2, 3% -5% isofluraan voor inductie en2% voor onderhoud tijdens de procedure). Behandel isofluraan onder een laboratoriumkap en zorg voor voldoende ventilatie.
- Buprenorfine subcutaan toedienen 30 minuten vóór de operatie in een dosering van 0,1 mg/kg lichaamsgewicht.
- Om onderkoeling te voorkomen, plaatst u de verdoofde muis op een opwarmkussen en plaatst u een opgerold doekweefsel onder de bovenbuik om de lever boven de andere organen te verheffen en de toegang tot de inferieure vena cava te vergemakkelijken.
OPMERKING: Gebruik geen weefsel dat te dik is, omdat knikken van bloedvaten mogelijk is en de perfusie-werkzaamheid zou worden beïnvloed. - Voeg oogzalf toe om schade aan het hoornvlies te voorkomen.
- Voordat u met de operatie begint, moet u ervoor zorgen dat het dier voldoende wordt verdoofd door de pedaalterugtrekkingsreflex te testen (voetkussen knijpen op beide achterpoten). In geval van een reactie, geef extra anesthesie en test opnieuw voordat u de procedure start.
- Reinig de buik met 70% ethanol.
- Open de middellijnincisie opnieuw door de hechtdraad door te snijden en de wondranden voorzichtig uit elkaar te trekken. Als de hepatectomie ouder is dan 24-48 uur, verwijder dan de hechting en knip de huid met een schaar.
- Bevestig een 5-0 polypropyleenhechting aan het borstbeen, trek eraan en bevestig het in deze positie. Gebruik een oprolmechanisme of eenvoudige clips om de buik open te houden. De buikholte moet zoveel mogelijk worden blootgesteld om de toegang en visualisatie te optimaliseren.
- Beweeg de darmen naar rechts met wattenstaafjes om de poortader en de vena cava te onthullen. Gebruik een natte doek om de darmen vast te houden.
- Plaats een zwaar voorwerp van ongeveer 2 cm hoog (bijvoorbeeld een met siliconen beklede gewichtsring voor volumetrische kolven) naast de achterpoten van de muis (aanvullende figuur S2A). Plaats de slang met de aangesloten 26 G IV canule op het voorwerp en plaats de naald voorzichtig bovenop de vena cava. Pas de lengte van de slang aan.
- Doe de bereide collagenase-stockoplossing in de voorverwarmde verteringsbufferbuis. Voeg 250 μL van de stamoplossing toe aan 10 ml verteringsbuffer. Bereid 10-20 ml verteringsbuffer per dier voor. Voor grotere dieren of perfusie van hele levers, bereid tot 30 ml verteringsbuffer voor.
OPMERKING: Het wordt aanbevolen om de collagenase-stockoplossing ongeveer 30 minuten voor het begin van het verteringsproces toe te voegen aan de verwarmde verteringsbuffer.
Figuur 2: Overzicht van de perfusie-opstelling. (A) Operatietafel met de apparatuur die nodig is voor de perfusie. (B) De materialen die nodig zijn voor de bereiding van de lever, evenals hepatocytenextractie en isolatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Cannulatie en perfusie
- Stel het pomptoerental in op 3 ml/min en zet de pomp aan. Laat de voorverwarmde perfusiebuffer de naald bereiken. Gooi de eerste 2-3 ml perfusiebuffer weg.
- Voer cannulatie uit van de inferieure vena cava.
- Terwijl de buffer door de naald loopt, steekt u de 26 G IV-canule onder een ondiepe hoek in de vena cava onder de nier. Zorg ervoor dat de naald naar boven wijst.
- Gebruik een wattenstaafje om de vena cava voorzichtig caudaal onder de prikplaats te trekken, zodat de geleverde spanning het inbrengen van de canule in de ader vergemakkelijkt. Zoek naar bloed in de flitskamer van de katheter wanneer de naald het lumen binnenkomt.
- Verplaats de naald nog eens 2-3 mm om ervoor te zorgen dat de punt van de plastic katheter ook in de ader is gekomen.
- Schuif de plastic katheter over de naald en nog eens 5 mm in de vena cava. Verwijder de naald langzaam en heel voorzichtig.
OPMERKING: Het fixeren van de canule met een ligatuur wordt niet aanbevolen. Deze stap is tijdrovend omdat het vat hiervoor eerst moet worden ontleed. Als de canule losjes is gepositioneerd en ondersteund met een object, is verdere fixatie niet nodig (zie perfusie-opstelling in aanvullende figuur S2). Om de cannulatieplaats te stabiliseren en terugstroming te voorkomen, kan een enkele druppel monomeer n-butyl-cyanoacrylaat op de cannulatieplaats worden toegevoegd.
- Wanneer er bloed uit de canule valt, vult u deze met een warme perfusiebuffer met een spuit.
- Bevestig de buis opnieuw aan de canule, die nog steeds draait met een pompsnelheid van 3 ml / min. Laat de perfusiebuffer in de lever komen.
- Zoek na 2-3 s naar witte vlekken in de lever en / of uitbreiding / zwelling van de poortader, die erop wijzen dat de perfusiebuffer door de lever stroomt en de leverlobben binnendringt vanuit de centrale ader (figuur 3).
- Wacht tot de poortader zichtbaar opzwelt binnen 1-2 s na het verschijnen van witte vlekken op het leveroppervlak. Knip de poortader met een schaar zo distaal mogelijk van de lever hilus. Gebruik een clip van een microvat om de snijplaats te labelen (niet af te sluiten) (figuur 3B).
OPMERKING: Dit vereenvoudigt de beoordeling van de stroom door de lever tijdens het perfusieproces. De lever zuivert onmiddellijk van bloed en wordt binnen enkele seconden geelwit (figuur 3C). Een extra snee door de huid aan de rechterkant van de buikopening vergemakkelijkt de uitstroom van het bloed en de perfusieoplossing (figuur 3B en aanvullende figuur S2B, C). - Verhoog de stroom tot 4-7 ml / min, afhankelijk van het gewicht van het dier, de levergrootte en de omvang van de eerdere hepatectomie.
- Klem de poortader vast met een pincet of vaatklem gedurende 7-10 s. Zorg ervoor dat er geen vloeistof doorheen gaat.
OPMERKING: De lever zwelt zichtbaar op tijdens het klemmen en ontspant bij het loslaten. Dit is cruciaal om de hele lever te spoelen en te ontdoen van eventueel achtergebleven bloed. - Voer na ongeveer 30 s een tweede klem uit en zorg ervoor dat de lever opzwelt en ontspant. Ga door met het spoelen van het dier totdat de buffer die uit de poortader stroomt vrij is, maar ten minste gedurende 3-4 minuten.
OPMERKING: De pompsnelheid is afhankelijk van de buis en de grootte van de lever. Het moet individueel worden geëvalueerd. - Op dit punt van de procedure had euthanasie secundair aan exsanguinatie moeten plaatsvinden. Bevestig dat de systemische circulatie is gestopt (geen hartslag of flikkering van het hart). Om de dood te garanderen, wordt bilaterale pneumothorax in dit stadium van de procedure uitgevoerd als secundaire fysieke methode van euthanasie.
OPMERKING: Verlaag de pompsnelheid enigszins als de systemische circulatie is gestopt (geen hartslag of flikkering van het hart).
Figuur 3: Perfusieproces van cannulatie tot vertering. (A) Anatomie van de muizenlever met de inferieure vena cava (witte pijl) en de poortader (gele pijl). (B) Cannulatie van de vena cava inferior. De canule wordt vastgezet met een ligatuur (witte pijl) en de locatie van de uitstroom door de geopende poortader wordt gemarkeerd (niet geklemd) met een microvatklem. (C) Let op het verschijnen van fragmentarische structuren voordat de perfusiebuffer de lever heeft gezuiverd van al het resterende bloed (witte pijl). De huid wordt ingesneden (gele pijl) en een wattenstaafje wordt geplaatst om de afvoer van bloed en perfusievloeistof te garanderen. Intermitterend klemmen kan worden uitgevoerd met een vaatklem of pincet. (D) De lever moet van al het bloed worden ontdaan (*). Nadat de collagenase-bevattende verteringsbuffer de lever is binnengedrongen, zal deze na het klemmen niet meer ontspannen en zullen de leverkwabben in omvang toenemen. (E) Na een tijdje kan een sprankelend uiterlijk op het oppervlak van de lever worden waargenomen (*). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
5. Spijsvertering
- Pauzeer de perfusiepomp en breng de inlaatslang snel over van de perfusiebuffer naar de voorverwarmde verteringsbuffer. Start de pomp opnieuw op.
- Voordat de spijsverteringsbuffer de lever bereikt, klemt u de poortader nog een keer gedurende 3-4 s. Zorg ervoor dat de lever ontspant bij het loslaten van de klem en de perfusievloeistof helder blijft.
OPMERKING: De verteringsbuffer bevat fenolrood en is gemakkelijk te onderscheiden van de heldere perfusiebuffer. Dit zorgt voor eenvoudige tracking in de buis. - Zodra de verteringsbuffer de lever heeft bereikt, klemt u de poortader nogmaals vast met een microvatklem.
OPMERKING: Bij het klemmen zwelt de lever op, maar ontspant niet bij het loslaten van de klem. Dit is normaal. - Om het verteringsproces te vergemakkelijken, sluit u de superieure vena cava met een vaatklem direct onder het diafragma om de spijsverteringsbuffer van de inferieure vena cava naar de lever naar de uitstroom door de geopende poortader te laten gaan.
OPMERKING: Deze klemming zorgt ervoor dat de systemische circulatie wordt omzeild en onnodig contact met resterende bloedbestanddelen/remmers wordt voorkomen. Deze stap is optioneel, omdat het moeilijk is om de superieure vena cava achter het vergrote leverweefsel te benaderen na schijnchirurgie, maar de toegang is veel gemakkelijker bij hepatectomiemuizen. - Vergist gedurende ongeveer 4 minuten bij een stroomsnelheid van 5 ml / min. Naarmate de spijsvertering vordert, zoek dan naar tekenen van de lever die begint op te zwellen en kleine heldere / transparante secties op het oppervlak van de lever. Merk verder op dat de lever de textuur van een nat stuk doek aanneemt en bijna drassig lijkt (figuur 3E). Onderzoek de consistentie door voorzichtig aan te raken met een vochtig wattenstaafje.
- Ga door met de perfusie totdat een duidelijk verschil in de oppervlaktestructuur van de lever kan worden waargenomen. Merk op dat de lever een zeer lichte kleur en een bruisend uiterlijk aanneemt (figuur 3E) en dat de capsule van de Glisson (d.w.z. de leverzak) zich scheidt van het parenchym. Stop het verteringsproces zodra de lever deze eigenschappen heeft verworven, omdat oververtering de hepatocyten kan beschadigen. Verwijder de naald voordat er lucht in de lever komt.
OPMERKING: Meestal is 10-20 ml verteringsbuffer nodig om voldoende spijsvertering te bereiken. Dit hangt af van de grootte van het dier, de mate van hepatectomie, de opstelling van de slang en de kwaliteit van de collagenase-oplossing. Verhoog indien nodig de perfusietijd in plaats van de perfusiesnelheid. Te veel druk in het vasculaire systeem kan ervoor zorgen dat de lever barst en de perfusie / spijsverteringsvloeistof kan verloren gaan in de retroperitoneale ruimte.
6. Bereiding van de lever
- Verwijder de lever voorzichtig uit de buikholte. Wees heel voorzichtig, want het is nu erg dun en fragiel.
- Pak het centrale bindweefsel tussen de lobben vast met een tang en til het iets naar boven op, met behulp van het als ankerpunt.
- Knip alle verbindingen van de lever met andere organen door, verwijder de galblaas en plaats de lever in de ijskoude conserveringsbuffer.
OPMERKING: Idealiter moeten hepatocytenextractie en verdere verwerking onmiddellijk plaatsvinden om de levensvatbaarheid van hepatocyten te behouden. Indien nodig kan de lever echter korte tijd worden bewaard bij 4 °C (bijvoorbeeld voor transport). Deze vertraging mag niet langer zijn dan 30-40 minuten.
7. Hepatocytenextractie
- Breng de lever over in een petrischaaltje van 10 cm en voeg 10 ml ijskoude Williams' Medium E toe.
- Scheur de capsule van de Glisson met een pincet met fijne punt op een paar plaatsen langs het leveroppervlak. Pak een centraal deel (bijvoorbeeld bindweefsel bij de lever hilus) vast met twee pincetten en trek ze langzaam uit elkaar, waardoor de capsule kan scheuren zonder de hepatocyten te beschadigen. Laat de cellen los door de capsule voorzichtig te schudden (aanvullende figuur S3).
OPMERKING: Idealiter scheurt de lever gemakkelijk uit elkaar en laat de cellen los. Oefen geen geweld uit. Een celschraper kan helpen om alle cellen volledig te verwijderen en de celopbrengst te verhogen. Knip de lever niet in stukken met een schaar. - Filtreer 5 ml leverpulp door een celzeef van 100 μm in een buis van 50 ml. Spoel het filter af met 10 ml vers ijskoud medium. Filter de resterende 5 ml pulp door de celzeef.
OPMERKING: Gebruik een serologische pipet van 25 ml om de leverpulp over te brengen met de gedissocieerde hepatocyten (figuur 4A). Kleinere pipetten met kleinere openingen verhogen de schuifspanning en beschadigen de hepatocyten onomkeerbaar. - Voeg in totaal 30 ml koud medium toe om de petrischaal af te spoelen, filter deze en voeg de suspensie toe aan de buis van 50 ml totdat deze vol is. Alle geïsoleerde cellen zijn nu in suspensie (figuur 4B).
Figuur 4: Zuivering door zachte centrifugering . (A) Leverhomogenaat dat overblijft na de extractiestap. B) microscopisch beeld (20x vergroting) van het homogenaat; Let op de gemarkeerde verontreiniging met puin. C) zuiveringscentrifugatiestappen en D) microscopische beelden van de weg te gooien supernatanten. (E) Microscopisch beeld van de gezuiverde hepatocytenfractie. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
8. Hepatocytenisolatie
- Draai bij 50 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C (laagste versnelling en laagst mogelijke rem).
OPMERKING: Hepatocyten zijn dichter dan niet-parenchymale levercellen. Vanwege de lage centrifugatiekracht worden alleen hepatocyten gepelletiseerd, terwijl andere cellen (bijv. Immuuncellen, erytrocyten en sinusoïdale cellen) in het supernatant blijven. - Zuig het grootste deel van het supernatant op, waardoor 1 ml overblijft om de cellen te resuspenderen door de buis voorzichtig te draaien.
- Voeg 40 ml koud Williams' E-medium toe en draai opnieuw bij 50 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C (lage acceleratie, lage rem) om dode hepatocyten en celresten verder te verwijderen en pellet levensvatbare en vette hepatocyten (figuur 4C).
- Gooi het grootste deel van het supernatant weg en laat 1 ml over om de cellen te resuspenderen door de buis te draaien.
- Voeg 40 ml koud Williams' E-medium toe en draai opnieuw op 50 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C (lage acceleratie, lage rem).
- Zuig het grootste deel van het supernatant op, waardoor 1 ml overblijft om de cellen te resuspenderen door de buis voorzichtig te draaien.
OPMERKING: Stop dit proces niet totdat cellen zijn gefixeerd of geanalyseerd. Hepatocyten zijn erg kwetsbaar en elke vertraging in het perfusie-, verterings- en zuiveringsproces kan de cellen beschadigen. - Bepaal de uiteindelijke celconcentratie na toevoeging van trypan blauw, met behulp van een door Neubauer verbeterde telkamer.
OPMERKING: De meeste puin en niet-parenchymale cellen zijn nu verwijderd, wat resulteert in een schone pellet van ongeveer 10-15 × 106 hepatocyten die overblijven na 70% -hepatectomie. - Voeg afhankelijk van de gewenste concentratie meer ijskoud medium toe. Gebruik de hepatocytencelsuspensie voor elke downstream-analyse of start een primaire celcultuur.
OPMERKING: In dit stadium blijven slechts enkele immuun- en niet-parenchymale cellen (<5%) in de suspensie achter. Indien verdere zuivering gewenst is, voert u een negatieve selectie van CD31+ en CD45+ cellen uit door middel van magnetische of fluorescentie-geactiveerde celsortering (MACS/FACS). Tot op heden is er geen betrouwbare en robuuste oppervlaktemarker voor leverparenchymale cellen.
9. Bereiding van de geïsoleerde hepatocyten voor flowcytometrie
- Centrifugeer de hepatocyten op 100 × g gedurende 5 min.
- Gooi het supernatant weg en voeg de gewenste hoeveelheid flowcytometriebuffer toe, afhankelijk van de concentratie van de celsuspensie.
- Voeg 1 ml celsuspensie toe in een flowcytometriebuis. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 100 × g en gooi het supernatant weg.
- Voeg 100-200 μL van de verdunde Alexa Fluor 488 Zombie groene levensvatbaarheidskleurstof (concentratie 1:400) toe aan de cellen en schud ze voorzichtig. Resuspendeer de hepatocyten voorzichtig door handmatig te schudden of een vortexmixer te gebruiken op lage snelheid (maximaal 2-3) gedurende 2 s.
OPMERKING: Gebruik geen kleine pipetpunten om de cellen opnieuw te suspenderen. Ze zijn erg kwetsbaar en de toegepaste schuifspanning veroorzaakt schade en vermindert de levensvatbaarheid van cellen. Als pipetteren niet te vermijden is, gebruik dan een pipet van 1.000 μL nadat u het kleinste deel van de punt hebt afgesneden om de diameter te vergroten en de cellen heel langzaam te pipetten. - Leg de buisjes op ijs of bewaar ze bij kamertemperatuur, afhankelijk van de gewenste kleuring. Incubeer de cellen gedurende 20-30 minuten in het donker.
- Voeg 2 ml flowcytometriebuffer toe en was de cellen 3x. Centrifugeer de cellen na elke wasstap op 100 × g gedurende 5 minuten.
- Voeg 2 ml fixatiebuffer toe (1:1, 4% PFA en PBS). Resuspendeer de hepatocyten voorzichtig door handmatig te schudden of een vortexmixer te gebruiken op lage snelheid (maximaal 2-3) gedurende 2 s.
- Bevestig de cellen gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer op 100 × g gedurende nog eens 5 minuten, gooi het supernatant weg en voeg een flowcytometriebuffer toe.
OPMERKING: Cellen kunnen worden opgeslagen in flowcytometriebuffer voorafgaand aan analyse tot 72 uur na isolatie.
10. Hepatocyten analyseren met flowcytometrie
- Analyseer de hepatocyten met behulp van een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder.
OPMERKING: Houd rekening met de relatief grote omvang van hepatocyten en pas de spanningen aan. Begin met een lage spanning en ga niet hoger dan 350 V voor forward scatter (FSC) en 220 V voor side scatter (SSC).- Pas de spanningen voor FSC en SSC aan de geschatte grote omvang van de cellen aan. Identificeer de hepatocytenpopulatie en registreer alle gebeurtenissen met behulp van SSC-A en FSC-A (figuur 5A).
- Merk op dat puin en niet-parenchymale cellen worden weergegeven in de linkerbenedenhoek van de FSC versus SSC-dichtheidsgrafiek en worden uitgesloten (figuur 5A).
- Aangezien doubletcellen de analyse kunnen beïnvloeden, construeert u een side scatter height (SSC-H) versus side scatter area (SSC-A) density plot om doubletten uit te sluiten, zoals weergegeven in figuur 5B.
- Selecteer de uiteindelijke hepatocytenpopulatie door CD31- (endotheelmarker) en CD45- (immuunmarker) cellen te gaten (figuur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TRAS piekt 16 uur na hepatectomie en verdwijnt geleidelijk 32-48 uur na standaard hepatectomie, maar blijft langer dan 48 uur na langdurige hepatectomie. Macroscopisch is TRAS gemakkelijk zichtbaar als een bleke teint van het leverrestant (figuur 1F) en kan worden waargenomen bij hepatectomie muizen tussen 16 h en 48 h na de operatie.
De geschatte uiteindelijke opbrengst is 10-15 × 10 6 hepatocyten na 70%-hepatectomie en 4-9 × 106 na verlengde 86%-hepatectomie bij muizen, met een gemiddelde uiteindelijke levensvatbaarheid van respectievelijk 78% en 65%. Dit komt overeen met het verwachte percentage ten opzichte van een totale opbrengst van 50-70 × 106 van een hele muizenlever (figuur 6A,C). Na partiële hepatectomie vertonen hepatocyten een verhoogde celgrootte in vergelijking met normale levers, wat overeenkomt met hun verhoogde lipidegehalte (figuur 6B). De gatingstrategie is weergegeven in aanvullende figuur S4.
Figuur 6: Hepatocytenopbrengst, celgrootte en levensvatbaarheid. (A) Celgetal van één hele muizenlever en van restanten 24 uur na 70%- en 86%-hepatectomie. (B) Berekend celvolume van geïsoleerde hepatocyten. Let op de duidelijke toename van de celgrootte 24 h na hepatectomie, voor zowel 70% als 86%. (C) Levensvatbaarheid van geïsoleerde hepatocyten na elke stap van het zuiveringsproces. De levensvatbaarheid werd gemeten door flowcytometrie met behulp van Alexa Fluor 488 Zombie groene levensvatbaarheidskleurstof. Percentages worden genomen van alle hepatocyten singlets. Voor de gatingstrategie, zie aanvullende figuur S6 en aanvullende figuur S4. Foutbalken verwijzen naar standaarddeviaties met n = 6-8/groep. Afkortingen: sHx = standaard hepatectomie; eHx = uitgebreide hepatectomie; zonder resectie = schijnchirurgie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een verhoogd lipidegehalte in muizenhepatocyten 24 h na partiële hepatectomie kan worden waargenomen door een toename van de granulariteit (figuur 7; voor gatingstrategie, zie aanvullende figuur S5) of direct waargenomen door de aanwezigheid van lipideblaasjes in vergrote hepatocyten (figuur 8 en aanvullend dossier 1).
Figuur 7: Verhoogde granulariteit en celgrootte gemeten door flowcytometrie. (A) Verhoogde granulariteit bij geïsoleerde hepatocyten 24 h na hepatectomie als indirecte marker voor de aanwezigheid van lipideblaasjes. (B) Histogram met SSC. (C) De percentages vertegenwoordigen de fractie van cellen met een hoge cytoplasmatische granulaire intensiteit, gemeten door het SSC-signaal. Foutbalken verwijzen naar standaarddeviaties met n = 6-8/groep. Afkortingen: sHx = standaard hepatectomie; eHx = uitgebreide hepatectomie; zonder resectie = schijnchirurgie; FSC = voorwaarts verstrooiingssignaal; SSC = zijverstrooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Soedan IV-kleuring als marker van het vetgehalte van geïsoleerde verse hepatocyten. (A) Hepatocyten uit een verse hele muizenlever zonder voorafgaande operatie. Verhoogde grootte en vetgehalte van hepatocyten 24 h (B) na 70% -hepatectomie en (C) 86% -hepatectomie. Let op de gelijktijdige aanwezigheid van zowel grotere, steatotische hepatocyten als kleinere, niet-steatotische hepatocyten. Schaalstaven = 30 μm (B-D). Foutbalken verwijzen naar standaarddeviaties met n = 6-8/groep. Afkortingen: sHx = standaard hepatectomie; eHx = uitgebreide hepatectomie; zonder resectie = schijnchirurgie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Een zeer laag percentage immuun- en niet-parenchymale cellen blijft in de uiteindelijke suspensie. Verdere zuivering wordt bereikt door FACS of MACS, indien gewenst. Negatieve selectie van CD31+ en CD45+ cellen door flowcytometrie wordt gebruikt om de niet-parenchymale cellen aan te tonen en te kwantificeren (figuur 5).
Figuur 5: Flowcytometrie gating strategie en selectie van CD31- en CD45- parenchymale cellen. (A) Gating chart met alle geregistreerde gebeurtenissen; Overweeg de relatief grote omvang van hepatocyten en gebruik aangepaste spanningen. Ga niet hoger dan 350 V voor FSC en 220 V voor SSC. (B) Singlet gating. (C) Hepatocyten worden geselecteerd door CD31- (endotheelmarker) en CD45- (immuunmarker) cellen te gaten. Deze selectie kan worden uitgevoerd in een fluorescentie-geactiveerde celsorteerder om parenchymale cellen te selecteren voor verdere downstream-analyses, indien nodig; n = 4-5/groep. Afkortingen: FSC = forward scatter; SSC = zijverstrooiing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Om de werkzaamheid van het gemodificeerde protocol bij het vasthouden van steatotische cellen aan te tonen, werden hepatocyten geïsoleerd met behulp van de klassieke dichtheidsgradiëntbenadering7 (figuur 9A). Anders dan bij de aangepaste procedure (figuur 9B) was er een vetcellaag duidelijk zichtbaar bovenop de dichtheidsgradiënt. Analyse van cellen bevestigde een grove afwezigheid van lipide-beladen hepatocyten in de pellet na dichtheidsgradiënt centrifugatie. Daarentegen werden cellen uit de vetlaag verrijkt met steatotische hepatocyten en een aanzienlijk deel van de niet-parenchymale en dode cellen (figuur 9A). Klassieke isolatie berooft dus de oogst van steatotische cellen, terwijl dit gemodificeerde protocol dat de dichtheidsgradiënt weglaat, lipide-beladen subpopulaties behoudt, waardoor de onbevooroordeelde verkenning van leverregeneratie mogelijk is zonder scheef te trekken naar magere hepatocyten.
Figuur 9: Opbrengsten van steatotische hepatocyten volgens het klassieke dichtheidsgradiëntisolatieprotocol in vergelijking met het verbeterde protocol. (A) Met de klassieke dichtheidsgradiëntzuiveringsmethode (eindconcentratie van 90% dichtheidsgradiëntoplossing in fosfaatgebufferde zoutoplossing) worden dode hepatocyten verzameld in een cellaag bovenop de dichtheidsgradiëntoplossing. (B) Deze laag bestaat niet alleen uit niet-parenchymale cellen en niet-levensvatbare hepatocyten, maar ook uit levensvatbare, grote, vette hepatocyten. (C) De pellet die wordt verkregen na centrifugatie met dichtheidsgradiënt bevat magere hepatocyten van kleinere omvang en is meestal verstoken van steatotische cellen. Dit is de "zuivere" fractie die geïsoleerd is met het klassieke protocol. (D) Met het verbeterde protocol gaan de met lipiden gevulde hepatocyten niet verloren en worden alle hepatocyten gepelletiseerd. Het supernatant (E) bestaat voornamelijk uit dode en gefragmenteerde hepatocyten en niet-parenchymale cellen, terwijl de pellet (F) een mengsel is van hepatocyten van variabele grootte en lipidegehalte. Schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullend dossier 1: Aanvullende protocollen. a) lipidenkleuring met Soedan IV; (B) standaard en uitgebreide hepatectomie bij muizen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S1: Overzicht van de perfusie-opstelling. (1) Kannuleer de inferieure vena cava. (2) Perfuseer de lever met warme perfusiebuffer om calcium te cheleren. (3) Verwarm de verteringsbuffer met collagenasen en Ca2+ om cellen in vivo te dissociëren. Verwijder de lever en (4) bewaar in ijskoude conserveringsbuffer (maximaal 30 min). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S2: Perfusie-instelling. (A) Perfusietafel met een isofluraanmondstuk, een gloeilamp met rood licht en een perfusiebuis. Een zwaar voorwerp kan onder de buis worden geplaatst om het te stabiliseren en het risico op verplaatsing te verminderen. (B) Tijdens de eerste paar minuten van de perfusie zal er wat bloed door de poortader stromen en zich in de open buikholte verzamelen. (C) De buikwand is aan één kant ingesneden om het bloed af te voeren. Een wattenstaafje vergemakkelijkt de drainage. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S3: De capsule van Glisson. (A) De capsule van de Glisson wordt op enkele plaatsen langs het leveroppervlak gescheurd met een pincet met fijne punt en de levercellen worden vrijgegeven door de capsule voorzichtig te schudden. (B) De lever moet gemakkelijk uit elkaar scheuren. (C) De lege leverzak (Glisson's capsule) met vrijgekomen hepatocyten in suspensie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S4: Flowcytometrie gating strategie voor levensvatbaarheidsscreening. (A) Alle gebeurtenissen werden geregistreerd. (B) Singlet gating. (C) Live / dode kleuring met Alexa Fluor 488 Zombie groene levensvatbaarheidskleurstof. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S5: Flowcytometrie gating strategie voor granulariteitsmeting. (A) Alle gebeurtenissen werden geregistreerd. (B) Singlet gating. (C) Punt plot van side scatter (SSC; x-as ) versus voorwaartse spreiding (FSC; y-as ) om de niveaus van granulariteit te analyseren. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur S6: Hepatocytenzuivering. A) Celpellet na de eerste centrifugatiestap; Let op de vetlaag bovenop het medium. B) Hepatocytenpellet na de tweede centrifugeerronde. (C) Gezuiverde hepatocyten aan het einde van het zuiveringsproces. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het gepubliceerde protocol biedt een betrouwbare en eenvoudige methode om een hoge opbrengst van normale en steatotische muizenhepatocyten te isoleren voor eencellige downstream-analyses of bulkanalyse van cellen na FACS-sortering. Het duidelijke voordeel ten opzichte van dichtheidsgradiëntzuivering is dat het cellulaire lipidengehalte in wezen geen invloed heeft op de effectieve opbrengst van hepatocyten. Zo zal de fractie van steatotische hepatocyten worden behouden en opgenomen in downstream-analyses. Dit is niet alleen cruciaal voor de studie van steatogene leverziekten, maar ook van het grootste belang voor elke analyse van processen na grote hepatectomieën, waarbij hepatocyten een temporeel en ruimtelijk dynamische steatose vertonen binnen de eerste 2-3 dagen van regeneratie. Hoewel (eencellige) analyses van geïsoleerde hepatocyten al zijn uitgevoerd na hepatectomie 19,20,21, moet worden aangenomen dat de geanalyseerde celpopulatie, althans gedeeltelijk, verstoken was van lipide-beladen hepatocyten en de resultaten waren daarom niet volledig representatief en scheef in de richting van magere hepatocyten.
Momenteel is de functie van TRAS niet volledig opgehelderd. De ruimtelijke verschillen in lipidegehalte binnen leverlobben blijven bijvoorbeeld slecht begrepen. Daarom is een methode nodig die kwantitatieve en kwalitatieve detectie mogelijk maakt zonder deze cellen precies uit te sluiten van analyses (bijvoorbeeld voor single-cell transcriptomics, flowcytometrie en metabolomics).
Over het algemeen is de hepatocytenopbrengst met dit verbeterde protocol aanzienlijk superieur aan andere methoden voor de isolatie van vetbevattende hepatocyten (bijv. Van muizen met niet-alcoholische steatohepatitis, NASH) met behulp van dichtheidsgradiëntzuivering15. Celopbrengst, levensvatbaarheid en vetgehalte kunnen echter variëren tussen preparaten. Verschillende factoren lijken verantwoordelijk te zijn.
Ten eerste zullen verschillende batches collagenase of collagenasemengsels variëren in hun enzymatische activiteit; De lot-to-lot verschillen zijn echter niet zo kritisch als bij traditionele collagenasen. Toch kan het nodig zijn de werkconcentratie aan te passen. De verschillen kunnen verder worden geminimaliseerd door de juiste opslag tot gebruik (droge lyofilisaten en gerehydrateerde stamoplossingen bij -15 tot -25 °C) en door repetitieve vries-dooicycli te vermijden, maar kunnen niet volledig worden geëlimineerd. Daarom wordt aanbevolen om alleen collagenasen van een specifieke batch te gebruiken voor een bepaalde experimentele serie. Bovendien hangt de enzymatische activiteit af van de temperatuur waarbij de verteringsbuffer de lever bereikt, met een optimale temperatuur tussen 35 °C en 37 °C voor een mengsel van collagenasen I en II22. Lagere temperaturen zullen de enzymatische activiteit verminderen, terwijl temperaturen boven 50 °C kunnen leiden tot onomkeerbare denaturatie van het eiwit. Test dit van tevoren en optimaliseer de experimentele omstandigheden door de begintemperatuur van de digestiebuffer, de lengte en diameter van de plastic buis en de stroomsnelheid aan te passen. Zo is een daling van de buffertemperatuur tot 10 °C binnen een buislengte van 60 cm te verwachten. Corrigeer de temperatuur door indien nodig verwarmingspads en infraroodlampen te gebruiken. Collagenasen vertonen hun optimale verteringscapaciteit bij een pH van 7,4; daarom wordt geadviseerd om de pH van de bufferoplossingen al voor gebruik op een werktemperatuur van ongeveer 37 °C te brengen.
Ten tweede is het van het grootste belang om de lever (of de hele muis) voldoende te spoelen met perfusiebuffer voordat het verteringsproces wordt gestart om potentiële remmers zoals serum of albumine te elimineren. Idealiter wordt perfusie pas gestart nadat de systemische circulatie is gestopt, om ervoor te zorgen dat de spijsverteringsbuffer alleen van de vena cava door de lever naar de uitstroom via de geopende poortader beweegt. De superieure vena cava kan worden afgesloten met een kleine vaatklem. Dit voorkomt contact met resterende bloedbestanddelen/remmers. Een andere methode om de lever optimaal te spoelen is intermitterend klemmen van de poortader. Dit moet zorgvuldig worden gedaan en - zodra de spijsverteringsbuffer de lever heeft bereikt - slechts één keer worden uitgevoerd om te voorkomen dat de reeds verteerde cellen worden beschadigd.
Ten derde zijn regenererende hepatocyten gevoelig en de ervaring heeft aangetoond dat ze kortere verteringstijden en een zorgvuldiger behandeling vereisen om oververtering en schade aan de cellen te voorkomen. Om de lever zo voorzichtig mogelijk te oogsten, wordt aanbevolen om de leverhilus met een klem vast te pakken en vervolgens eerst de superieure vena cava te snijden en de lever te bevrijden van de verbindingen met de ader en het middenrif. Vervolgens kunnen de inferieure vena cava en de poortader worden doorgesneden, waardoor mobilisatie van de lever mogelijk wordt en deze gemakkelijk wordt bevrijd van de gastro-intestinale ligamenten, de slokdarm aan de ene kant en de rechternier aan de andere kant. Bij hepatectomie bij muizen is het mogelijk om voorzichtig een van de ligaturen van de mediane lobben vast te pakken om de lever te verwijderen. Als een poging wordt gedaan om de lever met geweld naar buiten te trekken, kan de capsule van de Glisson scheuren en kunnen de geïsoleerde cellen verloren gaan.
Ten slotte is het van essentieel belang dat de perfusieprocedure en de verdere verwerking van de hepatocyten niet worden onderbroken of vertraagd, omdat dit onmiddellijk en onvermijdelijk de levensvatbaarheid zal beïnvloeden. Idealiter wordt de perfusie uitgevoerd in een team van ten minste twee personen en op één dier tegelijk. Deze eisen aan tijd en mankracht zijn echter een van de beperkingen van deze methode, hoewel dit ook geldt voor alternatieve methoden.
Een andere beperking is de uiteindelijke zuiverheid van de resulterende celsuspensie, omdat het voordeel van het niet verliezen van steatotische hepatocyten aan een dichtheidsgradiënt resulteert in een klein deel van de resterende niet-parenchymale en / of immuuncellen. In het getoonde monster is de fractie van CD45+ (immuuncellen) en CD31+ (endotheelcellen) lager dan 5%, en bij het eerst selecteren op celgrootte tijdens flowcytometrie zijn de percentages CD45+ en CD31+ respectievelijk 1,2% en 2,2% (figuur 5). Voor de meeste toepassingen is dit zuiverheidsniveau voldoende, maar zeer gevoelige methoden of het verdere gebruik in primaire celculturen vereisen waarschijnlijk een hogere graad. Talrijke studies hebben CD31 en CD45 gebruikt als systemische markers om levercelpopulaties te sorteren op MACS 23,24 of FACS25.
Deze verbeterde isolatiemethode is bij uitstek geschikt voor de studie van leverregeneratie, met name de vroege periode die zich presenteert met aanzienlijke hoeveelheden steatotische hepatocyten. PHLF, met aanhoudende steatose, is een bijzonder relevant onderwerp dat onderzoek vereist. Na langdurige hepatectomie die marginale resten achterlaat, kan PHLF zich ontwikkelen en vertegenwoordigt het inderdaad de meest voorkomende doodsoorzaak als gevolg van leverchirurgie. De pathobiologie is slechts gedeeltelijk begrepen en momenteel is er geen behandeling beschikbaar26. Gezien het feit dat PHLF de toepassing van leverchirurgie (zoals voor de genezing van levermaligniteiten) aanzienlijk beperkt, is het onderzoeken van de oorzaken en het identificeren van mogelijke maatregelen een duidelijke medische behoefte.
Er is ook behoefte aan de studie van ziekten die leversteatose als uitgangspunt hebben. Een prominent voorbeeld is niet-alcoholische leververvetting (NAFLD), die kan evolueren naar NASH en uiteindelijk naar hepatocellulair carcinoom (HCC)27. De verspreiding van sedentaire levensstijlen in combinatie met het westerse dieet heeft geleid tot een wereldwijde epidemie van NAFLD, en dienovereenkomstig zal de HCC-incidentie naar verwachtingmet 28,29 stijgen. Steatose is op zijn beurt ook nauw verbonden met obesitas, het metabool syndroom en type-2-diabetes, allemaal ziekten met een stijgende incidentie30. Daarom vormt steatose een toenemende last voor het huidige gezondheidszorgsysteem en vraagt het om effectieve middelen voor het beheer ervan. Deze verbeterde tweestaps collagenaseperfusiemethode maakt de studie van steatotische hepatocyten op eencellig niveau mogelijk en zou daarom moeten helpen bij het onderzoeken van de oorzaken en gevolgen van hepatocellulaire lipideaccumulatie.
Dit protocol presenteert een eenvoudige, snelle en betrouwbare techniek voor de in vivo isolatie van regenererende hepatocyten uit muizen na gedeeltelijke (70%) en uitgebreide (86%) hepatectomie. Deze aanpak is niet afhankelijk van gradiëntzuivering en kan worden gebruikt om leverregeneratieprocessen te onderzoeken met de opname van met lipiden beladen hepatocyten die meestal verloren gaan tijdens traditionele isolatieprotocollen. Bovendien kan deze methode ook worden toegepast voor het onderzoek naar verschillende leverziekten geassocieerd met steatotische veranderingen en is niet beperkt tot de muizensoort.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Swiss National Fond (projectsubsidie 310030_189262).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | - |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | - |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | - |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | - |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | - |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | - |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | - |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | - |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | - |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | - | - |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | - |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | - |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | - |
| Fenestrated sterile surgical drape | - | - | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | - |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | - |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | - | - |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | - |
| Isofluran station | Provet | - | - |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | - | - |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | - | - |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | - |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | - |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | - | - |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | - | - |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | - |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | - | Adjust to 42 °C |
References
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C.
- Lehmann, K., et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).
- Makino, H., et al. A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice. Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).
- Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N. Liver Pathology. Gayam, V., Engin, O. , IntechOpen. (2019).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Trotter, N. L. A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy. Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).
- Kachaylo, E., et al. PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice. Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Dold, S., et al. Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation. PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).
- Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 5 (22), (2020).
- Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver. Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).
- Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation. Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).
- Roche, Liberase TM Research Grade. , (2020).
- Giugliano, S., et al. Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication. Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).
- Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes. Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).
- Helling, T. S. Liver failure following partial hepatectomy. HPB. 8 (3), 165-174 (2006).
- Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F.
- Park, W. Y., et al. Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study. Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude. Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- Roeb, E. Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD). Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).
