Summary
Липидные гепатоциты присущи регенерации печени, но обычно теряются при центрифугировании с градиентом плотности. Здесь мы представляем оптимизированный протокол выделения клеток, который сохраняет стеатотические гепатоциты, давая репрезентативные популяции регенерирующих гепатоцитов после частичной гепатэктомии у мышей.
Abstract
Частичная гепатэктомия широко используется для исследования регенерации печени у мышей, но выделение высоких выходов жизнеспособных гепатоцитов для последующих одноклеточных применений является сложной задачей. Заметное накопление липидов в регенерирующих гепатоцитах наблюдается в течение первых 2 дней нормальной регенерации печени у мышей. Этот так называемый преходящий стеатоз, связанный с регенерацией (TRAS), является временным, но частично перекрывает основную пролиферативную фазу. Очистка с градиентом плотности является основой большинства существующих протоколов выделения первичных гепатоцитов. Поскольку градиентная очистка зависит от плотности и размера клеток, она отделяет нестеатотические популяции гепатоцитов от стеатоза. Поэтому жировые гепатоциты часто теряются, образуя нерепрезентативные фракции гепатоцитов.
Представленный протокол описывает простой и надежный метод выделения in vivo регенерирующих гепатоцитов независимо от содержания в них липидов. Гепатоциты самцов мышей C57BL/6 выделяют через 24-48 ч после гепатэктомии классическим двухэтапным подходом к перфузии коллагеназы. Стандартный перистальтический насос нагнетает нагретые растворы через катетеризированную нижнюю полую вену в остаток, используя метод ретроградной перфузии с оттоком через воротную вену. Гепатоциты диссоциируют коллагеназой для их высвобождения из капсулы Глиссона. После промывки и тщательного центрифугирования гепатоциты можно использовать для любых последующих анализов. В заключение, в этой статье описывается простой и воспроизводимый метод выделения репрезентативной популяции регенерирующих гепатоцитов после частичной гепатэктомии у мышей. Метод также может помочь в изучении жировой болезни печени.
Introduction
Печень может регенерировать себя даже после значительной потери ткани. Эта уникальная регенеративная способность наглядно иллюстрируется экспериментальной моделью частичной (70%) гепатэктомии, впервые описанной на крысах Хиггинсом и Андерсоном в 1931 году1. В этой модели 70% печени удаляется хирургическим путем у животных путем отсечения более крупных долей печени. Затем оставшиеся доли растут за счет компенсаторной гипертрофии, чтобы восстановить первоначальную массу печени в течение примерно 1 недели после операции, хотя и без восстановления исходной архитектуры печени 2,3. Были разработаны дополнительные гепатэктомии с различным количеством удаления тканей, такие как гепатэктомия с удлинением 86%, когда остаток печени слишком мал для восстановления, что в конечном итоге приводит к печеночной недостаточности после гепатэктомии (PHLF) и последующей смерти у 30-50% животных 4,5,6. Эти модели позволяют изучать нормальную и неудачную регенерацию печени в зависимости от количества резецированной ткани (рис. 1).
Хотя мышиные модели гепатэктомии успешно использовались в течение многих лет, только недавно появились более продвинутые аналитические методы, позволяющие глубже понять на уровне отдельных клеток. Однако для большинства из этих методов наличие отдельных гепатоцитов является основной предпосылкой. Большинство протоколов выделения первичных гепатоцитов основаны на двухступенчатой методике перфузии коллагеназы и последующей градиентной очистке плотности для отделения жизнеспособных гепатоцитов от мусора и непаренхиматозных, а также мертвых клеток 7,8,9. Этот метод был впервые описан Берри и Френдом в 1969 году10 и адаптирован Сегленом и его коллегами в 1972 году11,12. Однако, поскольку градиентное центрифугирование зависит от плотности и размера клеток, насыщенные липидами гепатоциты часто теряются во время стандартной очистки. Хотя такая потеря может быть незначительной для многих исследовательских вопросов, она является важным аспектом для ранней регенерации печени. В течение первых 2 дней гепатоциты в регенерирующей печени мыши накапливают липиды, тем самым увеличиваясь в размерах и уменьшаясь в плотности. Этот транзиторный регенеративный стеатоз (TRAS) служит для обеспечения регенеративного топлива и является временным, но частично перекрывает основную пролиферативную фазу и неравномерно распределен в дольках печени - функциональных единицах печени13,14. Однако после расширенной 86%-гепатэктомии TRAS также возникает, но сохраняется, потому что регенерация останавливается, а липиды не окисляются14. Следовательно, градиентная очистка гепатоцитов после 70% или 86%-гепатэктомии даст нерепрезентативные фракции, поскольку большинство липидных гепатоцитов теряется из-за их низкой плотности15.
В этом модифицированном протоколе изоляции гепатоциты мышей C57BL/6 выделяют через 24-48 ч после гепатэктомии классическим двухэтапным подходом к перфузии коллагеназы. Обычно канюляция и перфузия остатка для выделения клеток проводятся через воротную вену. Тем не менее, портоваскулярное сопротивление в небольших остатках, оставшихся после большой резекции, составляет16, и, таким образом, перфузия является деликатной. Поскольку полая вена остается незатронутой гепатэктомией, перфузия может быть легко выполнена в ретроградном направлении путем канюляции полой вены. Стандартный перистальтический насос подает нагретые растворы через катетеризированную нижнюю полую вену в остаток печени, используя ретроградную перфузию с оттоком через воротную вену (дополнительный рисунок S1). Гепатоциты диссоциируют коллагеназами и высвобождаются из капсулы Глиссона. После промывки и тщательной обработки жизнеспособных гепатоцитов путем ступенчатой изоляции с использованием низкоскоростного центрифугирования гепатоциты можно использовать для любых последующих анализов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Федеральными правилами Швейцарии по животным и одобрены Ветеринарным управлением Цюриха (No 007/2017, 156/2019), обеспечивая заботу о человеке. Самцов мышей C57BL/6 в возрасте 10-12 недель держали в 12-часовом дневном цикле со свободным доступом к пище и воде. Каждая экспериментальная группа состояла из шести-восьми животных. Подробную информацию обо всех материалах, оборудовании и реагентах, используемых в этом протоколе, см. в таблице материалов .
1. Частичная гепатэктомия у мышей
- При стандартной гепатэктомии (70%) перевязывают и резецируют левую боковую долю, правую часть срединной доли и левую часть срединной доли (рис. 1B). При расширенной гепатэктомии (86%)4 также удаляют хвостатые доли и правую переднюю долю (рис. 1C).
- ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартная гепатэктомия - это процедура, которая уже много лет используется в исследованиях регенерации печени. Доступны протоколы для этой процедуры3,17, включая видеопротокол Митчелла и Вилленбринга 18. Более подробную информацию о методах, используемых здесь для гепатэктомии, можно найти в дополнительном файле 1.
Рисунок 1: Стандартная (70%) и расширенная (86%) гепатэктомия у мышей. (A) Пять долей печени мыши и их соответствующий вклад в общую массу печени. (B) Схематическая иллюстрация 70%-ной гепатэктомии у мышей. Темные доли представляют собой будущий остаток печени. (C) Схематическая иллюстрация 86%-ной гепатэктомии у мышей. Темные доли представляют собой будущий остаток печени. (D) Точный объем резецированной ткани после 70% и 86% гепатэктомии. (E) Живот мыши сразу после 70%-ной гепатэктомии; (F) живот мыши сразу (слева) и через 48 ч (справа) после 86%-ной гепатэктомии. Обратите внимание на бледный цвет стеатотического остатка (белая стрелка). n = 6-7/группа. Сокращения: sHx = стандартная гепатэктомия; eHx = расширенная гепатэктомия; LW = вес печени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
2. Приготовление перфузионных растворов
- Подготовьте буферы для перфузии, сбраживания и консервации (см. Таблицу 1).
- Отрегулируйте рН всех буферных растворов при 37 °C, добавляя гидроксид натрия (NaOH) или хлористый водород (HCl) по мере необходимости. Оптимальный рН для буферов составляет 7,4.
- Поместите буфер сохранения и Medium E Уильямса на лед.
- Подготовьте буфер для проточной цитометрии и храните его на льду.
Таблица 1: Растворы и буферы, используемые для переваривания и очистки гепатоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.
3. Подготовка перфузионного оборудования
- Нагрейте водяную баню до 42 °C и поместите буфер для перфузии (50 мл) и буфер для сбраживания (10-20 мл) на водяную баню. Пока не добавляйте коллагеназу в буфер пищеварения.
- Подготовьте перистальтический насос и вставьте трубку. Полная настройка перфузии показана на рисунке 2.
- Подсоедините канюлю 26 G IV к выходному концу трубки с помощью соединителя замка Luer. Вставьте входной конец трубки в предварительно подогретую буферную трубку для перфузии на водяной бане. Промойте трубку 70% этанолом, а затем 50 мл стерильного хлорида натрия (NaCl 0,9%). Заправьте трубку теплым перфузионным буфером (скорость насоса 3 мл/мин).
- Успокаивайте мышей с помощью ингаляционной анестезии изофлурана (800 мл / мин O 2, 3% -5% изофлурана для индукции и2% для поддержания во время процедуры). Храните изофлуран под лабораторным колпаком и обеспечьте достаточную вентиляцию.
- Вводят бупренорфин подкожно за 30 мин до операции в дозировке 0,1 мг/кг массы тела.
- Чтобы предотвратить переохлаждение, поместите успокоенную мышь на грелку и положите свернутую ткань под верхнюю часть живота, чтобы поднять печень над другими органами и облегчить доступ к нижней полой вене.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте слишком толстую ткань, так как возможно перегиб сосудов и это повлияет на эффективность перфузии. - Добавьте глазную мазь, чтобы предотвратить повреждение роговицы.
- Перед началом операции убедитесь, что животное находится под адекватной анестезией, проверив рефлекс отвода педали (ущипните подушечку стопы на обеих задних лапах). В случае ответа предоставьте дополнительную анестезию и повторите тест перед началом процедуры.
- Очистите живот 70% этанолом.
- Снова откройте разрез по средней линии, разрезав шов и осторожно раздвинув края раны. Если гепатэктомия старше 24-48 часов, снимите шов и разрежьте кожу ножницами.
- Зафиксируйте полипропиленовый шов 5-0 к грудине, натяните его краниально и зафиксируйте в таком положении. Используйте ретрактор или простые зажимы, чтобы держать живот открытым. Брюшная полость должна быть максимально открыта, чтобы оптимизировать доступ и визуализацию.
- Переместите кишечник вправо с помощью ватных тампонов, чтобы открыть воротную вену и полую вену. Используйте влажную ткань, чтобы сохранить кишечник.
- Поместите тяжелый предмет высотой около 2 см (например, силиконовое утяжеляющее кольцо для объемных колб) рядом с задними лапами мыши (дополнительный рисунок S2A). Поместите трубку с подключенной канюлей 26 G IV на объект и осторожно поместите иглу поверх полой вены. Отрегулируйте длину трубки.
- Поместите приготовленный исходный раствор коллагеназы в предварительно подогретую буферную пробирку для разложения. Добавьте 250 мкл исходного раствора в 10 мл буфера для разложения. Приготовьте 10-20 мл буфера для переваривания на животное. Для более крупных животных или перфузии цельной печени приготовьте до 30 мл буфера для пищеварения.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется добавлять исходный раствор коллагеназы в подогретый буфер для разложения примерно за 30 минут до начала процесса сбраживания.
Рисунок 2: Обзор перфузионной установки. (A) Хирургический стол с оборудованием, необходимым для перфузии. (B) Материалы, необходимые для подготовки печени, а также для экстракции и выделения гепатоцитов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
4. Канюляция и перфузия
- Отрегулируйте скорость насоса до 3 мл/мин и включите насос. Дайте предварительно подогретому буферу перфузии достичь иглы. Откажитесь от первых 2-3 мл перфузионного буфера.
- Выполняют канюляцию нижней полой вены.
- Пока буфер проходит через иглу, вставьте канюлю 26 G IV под небольшим углом в полую вену под почкой. Убедитесь, что скос иглы направлен вверх.
- С помощью ватного тампона осторожно потяните полую вену каудально ниже места прокола, чтобы обеспеченное натяжение облегчило введение канюли в вену. Ищите кровь в камере вспышки катетера, когда игла входит в просвет.
- Продвинуте иглу еще на 2-3 мм, чтобы убедиться, что кончик пластикового катетера также вошел в вену.
- Наденьте пластиковый катетер на иглу и в полую вену еще на 5 мм. Извлекайте иглу медленно и очень осторожно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксировать канюлю лигатурой не рекомендуется. Этот шаг занимает много времени, так как для этого необходимо сначала вскрыть сосуд. Если канюля свободно расположена и поддерживается каким-либо предметом, дальнейшая фиксация не требуется (см. настройку перфузии на дополнительном рисунке S2). Чтобы стабилизировать место канюляции и предотвратить обратный поток, на место канюляции можно добавить одну каплю мономерного н-бутилцианоакрилата.
- Когда кровь выпадет из канюли, заполните ее теплым перфузионным буфером с помощью шприца.
- Снова прикрепите трубку к канюле, продолжая работать со скоростью насоса 3 мл / мин. Пусть буфер перфузии попадет в печень.
- Через 2-3 с обратите внимание на белые пятна, образующиеся в печени и/или расширение/отек воротной вены, которые указывают на то, что буфер перфузии протекает через печень и попадает в дольки печени из центральной вены (рис. 3).
- Дождитесь заметного отека воротной вены в течение 1-2 с после появления белых пятен на поверхности печени. Разрежьте воротную вену ножницами как можно дальше от печеночного жила. Используйте зажим для микрососуда, чтобы пометить (не закрыть) место резки (рис. 3B).
ПРИМЕЧАНИЕ: Это упрощает оценку потока через печень во время процесса перфузии. Печень мгновенно очищается от крови и становится желто-белой в течение нескольких секунд (рис. 3C). Дополнительный разрез кожи с правой стороны брюшного отверстия облегчает отток крови, а также перфузионного раствора (рис. 3B и дополнительный рисунок S2B, C). - Увеличьте поток до 4-7 мл / мин в зависимости от веса животного, размера печени и степени предшествующей гепатэктомии.
- Зажмите воротную вену пинцетом или сосудистым зажимом на 7-10 с. Убедитесь, что жидкость не проходит.
ПРИМЕЧАНИЕ: Печень заметно набухает во время зажима и расслабляется при освобождении. Это имеет решающее значение для промывания всей печени и очистки ее от оставшейся крови. - Выполните второй зажим примерно через 30 секунд и убедитесь, что печень набухает и расслабляется. Продолжайте промывать животное до тех пор, пока буфер, вытекающий из воротной вены, не станет чистым, но не менее 3-4 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость насоса зависит от трубки, а также от размера печени. Его необходимо оценивать индивидуально. - На этом этапе процедуры эвтаназия должна была произойти вторично по отношению к обескровливанию. Подтвердите, что системное кровообращение остановлено (нет сердцебиения или мерцания сердца). Чтобы обеспечить смерть, на этом этапе процедуры проводится двусторонний пневмоторакс как вторичный физический метод эвтаназии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Немного уменьшите скорость помпы, если системное кровообращение остановилось (нет сердцебиения или мерцания сердца).
Рисунок 3: Процесс перфузии от канюляции до пищеварения. (A) Анатомия печени мыши с нижней полой веной (белая стрелка) и воротной веной (желтая стрелка). (B) Канюляция нижней полой вены. Канюля закрепляется лигатурой (белая стрелка), а место оттока через открытую воротную вену отмечается (не зажимается) зажимом микрососуда. (C) Обратите внимание на появление пятнистых структур до того, как буфер перфузии очистит печень от всей оставшейся крови (белая стрелка). Кожа надрезается (желтая стрелка) и помещается ватный тампон для обеспечения дренажа крови и перфузионной жидкости. Прерывистый зажим может быть выполнен сосудистым зажимом или пинцетом. (D) Печень должна быть очищена от всей крови (*). После того, как коллагеназсодержащий буфер пищеварения попадет в печень, он больше не будет расслабляться после пережатия, и доли печени увеличатся в размерах. (E) Через некоторое время на поверхности печени может наблюдаться появление пузырьков (*). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
5. Пищеварение
- Приостановите работу перфузионного насоса и быстро перенесите впускную трубку из перфузионного буфера в предварительно подогретый буфер для сбраживания. Перезапустите насос.
- До того, как буфер пищеварения достигнет печени, зажмите воротную вену еще раз на 3-4 часа. Убедитесь, что печень расслабляется при снятии зажима, а перфузионная жидкость остается чистой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер для разложения содержит феноловый красный цвет и легко отличим от прозрачного перфузионного буфера. Это позволяет легко отслеживать внутри трубы. - Как только буфер пищеварения достигнет печени, снова зажмите воротную вену зажимом для микрососудов.
ПРИМЕЧАНИЕ: При зажиме печень набухает, но не расслабляется при отпускании зажима. Это нормально. - Чтобы облегчить процесс пищеварения, закройте верхнюю полую вену сосудистым зажимом непосредственно под диафрагмой, чтобы буфер пищеварения мог пройти от нижней полой вены к печени к оттоку через открытую воротную вену.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот зажим обеспечивает обход системного кровообращения и предотвращение ненужного контакта с остаточными компонентами/ингибиторами крови. Этот шаг не является обязательным, так как трудно подойти к верхней полой вене за увеличенной тканью печени после фиктивной операции, но доступ намного проще у мышей, подвергшихся гепатэктомии. - Варить в течение примерно 4 мин при скорости потока 5 мл/мин. По мере того, как пищеварение прогрессирует, ищите признаки начала набухания печени и небольшие прозрачные / прозрачные участки на поверхности печени. Кроме того, обратите внимание, что печень приобретает текстуру влажного куска ткани и выглядит почти мокрой (рис. 3E). Прощупайте консистенцию, осторожно прикоснувшись к влажной ватной палочке.
- Продолжайте перфузию до тех пор, пока не будет наблюдаться заметная разница в текстуре поверхности печени. Обратите внимание, что печень приобретает очень светлый цвет и пузырчатый вид (рис. 3E), а капсула Глиссона (т.е. печеночный мешок) отделяется от паренхимы. Остановите процесс пищеварения, как только печень приобретет эти свойства, так как чрезмерное переваривание может повредить гепатоциты. Извлеките иглу до того, как воздух попадет в печень.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно для достижения достаточного пищеварения требуется 10-20 мл буфера для пищеварения. Это зависит от размера животного, степени гепатэктомии, настройки трубок и качества раствора коллагеназы. При необходимости увеличьте время перфузии, а не скорость перфузии. Слишком большое давление в сосудистой системе может привести к разрыву печени, и жидкость для перфузии / пищеварения может быть потеряна в забрюшинном пространстве.
6. Подготовка печени
- Аккуратно извлеките печень из брюшной полости. Будьте очень осторожны, так как сейчас он очень хлипкий и хрупкий.
- Возьмитесь за центральную соединительную ткань между долями с помощью щипцов и слегка приподнимите ее вверх, используя в качестве опорной точки.
- Перережьте все связи печени с другими органами, удалите желчный пузырь и поместите печень в ледяной буфер для сохранения.
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале экстракция гепатоцитов и дальнейшая обработка должны происходить немедленно, чтобы поддерживать жизнеспособность гепатоцитов. Однако при необходимости печень можно хранить в течение короткого времени при температуре 4 °C (например, для транспортировки). Эта задержка не должна превышать 30-40 мин.
7. Экстракция гепатоцитов
- Переложите печень в чашку Петри диаметром 10 см и добавьте 10 мл ледяного Williams' Medium E.
- Разорвите капсулу Глиссона пинцетом с тонким наконечником в нескольких местах вдоль поверхности печени. Захватите центральную часть (например, соединительную ткань в печени) двумя парами пинцета и медленно раздвиньте их, позволяя капсуле разорваться, не повреждая гепатоциты. Освободите клетки, осторожно встряхнув капсулу (дополнительный рисунок S3).
ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале печень легко разрывается на части и высвобождает клетки. Не применяйте силу. Клеточный скребок может помочь полностью удалить все клетки и увеличить выход клеток. Не режьте печень на кусочки ножницами. - Отфильтруйте 5 мл пульпы печени через клеточное ситечко 100 мкм в пробирку объемом 50 мл. Промойте фильтр 10 мл свежей ледяной среды. Оставшиеся 5 мл мякоти процедите через клеточный фильтр.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте серологическую пипетку объемом 25 мл для переноса пульпы печени с диссоциированными гепатоцитами (рис. 4A). Меньшие пипетки с меньшими отверстиями увеличивают напряжение сдвига и необратимо повреждают гепатоциты. - Добавьте в общей сложности 30 мл холодной среды, чтобы промыть чашку Петри, отфильтровать ее и добавить суспензию в пробирку объемом 50 мл, пока она не заполнится. Все изолированные клетки в настоящее время находятся во взвешенном состоянии (рис. 4B).
Рисунок 4: Очистка щадящим центрифугированием . (A) Гомогенат печени, оставшийся после стадии экстракции. b) микроскопический вид (20-кратное увеличение) гомогената; Обратите внимание на отмеченное загрязнение мусором. (C) этапы центрифугирования очистки и (D) микроскопические виды надосадочных веществ, подлежащих отбраковке. (E) Микроскопический вид очищенной фракции гепатоцитов. Масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
8. Выделение гепатоцитов
- Отжим при 50 × g в течение 5 мин при 4 °C (минимально возможное ускорение и минимальное торможение).
ПРИМЕЧАНИЕ: Гепатоциты плотнее, чем непаренхиматозные клетки печени. Из-за низкой силы центрифугирования гранулируются только гепатоциты, в то время как другие клетки (например, иммунные клетки, эритроциты и синусоидальные клетки) остаются в надосадочной жидкости. - Аспирируйте большую часть надосадочной жидкости, оставляя 1 мл для ресуспендирования клеток, осторожно закручивая трубку.
- Добавьте 40 мл холодной среды Е Вильямса и снова вращайте при 50 × г в течение 10 минут при 4 ° C (низкое ускорение, низкое торможение) для дальнейшего удаления мертвых гепатоцитов и клеточного остатка, а также жизнеспособных и жирных гепатоцитов гранул (рис. 4C).
- Откажитесь от большей части надосадочной жидкости, оставив 1 мл для ресуспендирования клеток, вращая трубку.
- Добавьте 40 мл холодной среды Williams' E и снова вращайте при 50 × g в течение 5 минут при 4 ° C (низкое ускорение, низкое торможение).
- Аспирируйте большую часть надосадочной жидкости, оставляя 1 мл для ресуспендирования клеток, осторожно закручивая трубку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не останавливайте этот процесс до тех пор, пока ячейки не будут зафиксированы или проанализированы. Гепатоциты очень хрупкие, и любая задержка в процессе перфузии, пищеварения и очистки может повредить клетки. - Определите конечную концентрацию клеток после добавления трипанового синего, используя улучшенную Нойбауэром счетную камеру.
ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство обломков и непаренхиматозных клеток в настоящее время удалены, в результате чего после 70%-гепатэктомии остается чистая гранула примерно 10-15 ×10-6 гепатоцитов. - В зависимости от желаемой концентрации, добавьте еще ледяную среду. Используйте суспензию гепатоцитарных клеток для любого последующего анализа или инициируйте первичную культуру клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе в суспензии остается лишь несколько иммунных и непаренхиматозных клеток (<5%). Если требуется дальнейшая очистка, выполните отрицательный отбор клеток CD31+ и CD45+ с помощью магнитной или флуоресцентной сортировки клеток (MACS/FACS). На сегодняшний день не существует надежного и надежного поверхностного маркера паренхиматозных клеток печени.
9. Подготовка выделенных гепатоцитов к проточной цитометрии
- Центрифугируют гепатоциты по 100 × г в течение 5 мин.
- Откажитесь от надосадочной жидкости и добавьте желаемое количество буфера проточной цитометрии в зависимости от концентрации клеточной суспензии.
- Добавьте 1 мл клеточной суспензии в проточную цитометрическую пробирку. Центрифугу в течение 5 мин при 100 × г и выбросьте надосадочную жидкость.
- Добавьте в клетки 100-200 мкл разбавленного зеленого красителя Alexa Fluor 488 Zombie (концентрация 1:400) и осторожно встряхните их. Осторожно ресуспендируйте гепатоциты ручным встряхиванием или с помощью вихревого миксера на низкой скорости (максимум 2-3) в течение 2 с.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте маленькие наконечники пипеток для ресуспендирования клеток. Они очень хрупкие, и приложенное напряжение сдвига вызывает повреждение и снижает жизнеспособность клеток. Если пипетки невозможно избежать, используйте пипетку объемом 1000 мкл после отрезания мельчайшей части от наконечника, чтобы увеличить диаметр, и очень медленно пипетируйте клетки. - Поместите тюбики на лед или храните их при комнатной температуре, в зависимости от желаемого окрашивания. Инкубируйте клетки в течение 20-30 мин в темноте.
- Добавьте 2 мл буфера для проточной цитометрии и промойте клетки 3 раза. Центрифугируйте клетки после каждого этапа промывки по 100 × г в течение 5 мин.
- Добавьте 2 мл фиксирующего буфера (1:1, 4% PFA и PBS). Осторожно ресуспендируйте гепатоциты ручным встряхиванием или с помощью вихревого миксера на низкой скорости (максимум 2-3) в течение 2 с.
- Зафиксируйте клетки на 30 мин.
- Центрифугу при 100 × г еще 5 мин, выбросьте надосадочную жидкость и добавьте буфер для проточной цитометрии.
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки можно хранить в буфере проточной цитометрии до анализа до 72 ч после выделения.
10. Анализ гепатоцитов методом проточной цитометрии
- Проанализируйте гепатоциты с помощью фотосепаратора, активируемого флуоресценцией.
ПРИМЕЧАНИЕ: Учитывайте относительно большой размер гепатоцитов и регулируйте напряжения. Начните с низкого напряжения и не превышайте 350 В для прямого рассеяния (FSC) и 220 В для бокового рассеяния (SSC).- Отрегулируйте напряжения для FSC и SSC в соответствии с предполагаемым большим размером ячеек. Определите популяцию гепатоцитов и запишите все события с помощью SSC-A и FSC-A (рис. 5A).
- Обратите внимание, что дебрисы и непаренхиматозные клетки отображаются в левом нижнем углу графика плотности FSC и SSC и исключаются (рис. 5A).
- Поскольку дублетные ячейки могут влиять на анализ, постройте график плотности высоты бокового рассеяния (SSC-H) и площади бокового рассеяния (SSC-A), чтобы исключить дублеты, как показано на рисунке 5B.
- Выберите окончательную популяцию гепатоцитов путем стробирования клеток CD31- (эндотелиальный маркер) и CD45- (иммунный маркер) (рис. 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TRAS достигает пика через 16 ч после гепатэктомии и постепенно исчезает через 32-48 ч после стандартной гепатэктомии, но сохраняется более 48 ч после расширенной гепатэктомии. Макроскопически TRAS хорошо виден в виде бледного цвета лица остатка печени (рис. 1F) и может наблюдаться у мышей, подвергшихся гепатэктомии, между 16 и 48 часами после операции.
Предполагаемый конечный выход составляет 10-15 × 10 6 гепатоцитов после 70%-гепатэктомии и 4-9 ×10,6 после расширенной 86%-гепатэктомии у мышей, со средней конечной жизнеспособностью 78% и 65% соответственно. Это соответствует ожидаемому проценту по сравнению с общим выходом 50-70 × 10 6 из целой печени мыши (рис. 6А, В). После частичной гепатэктомии гепатоциты показывают увеличенный размер клеток по сравнению с нормальной печенью, что соответствует их повышенному содержанию липидов (рис. 6B). Стратегия стробирования показана на дополнительном рисунке S4.
Рисунок 6: Выход гепатоцитов, размер клеток и жизнеспособность. (A) Количество клеток одной целой печени мыши и остатков через 24 часа после 70% и 86% гепатэктомии. (B) Расчетный объем клеток изолированных гепатоцитов. Обратите внимание на заметное увеличение размера клеток через 24 часа после гепатэктомии, как на 70%, так и на 86%. (C) Жизнеспособность клеток изолированных гепатоцитов после каждого этапа процесса очистки. Жизнеспособность измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием красителя жизнеспособности Alexa Fluor 488 Zombie green. Проценты берутся из всех синглетов гепатоцитов. О стратегии стробирования см. Дополнительный рисунок S6 и Дополнительный рисунок S4. Полосы погрешностей относятся к стандартным отклонениям с n = 6-8 / группа. Сокращения: sHx = стандартная гепатэктомия; eHx = расширенная гепатэктомия; без резекции = фиктивная хирургия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Повышенное содержание липидов в мышиных гепатоцитах через 24 часа после частичной гепатэктомии может наблюдаться по увеличению зернистости (рис. 7; стратегию стробирования см. на дополнительном рисунке S5) или непосредственно по наличию липидных везикул внутри увеличенных гепатоцитов (рис. 8 и дополнительный файл 1).
Рисунок 7: Повышенная зернистость и размер клеток, измеренные с помощью проточной цитометрии. (A) Повышенная зернистость среди изолированных гепатоцитов через 24 часа после гепатэктомии в качестве косвенного маркера присутствия липидных везикул. (B) Гистограмма, показывающая SSC. (C) Проценты представляют собой долю клеток с высокой цитоплазматической зернистой интенсивностью, измеренную сигналом SSC. Полосы погрешностей относятся к стандартным отклонениям с n = 6-8 / группа. Сокращения: sHx = стандартная гепатэктомия; eHx = расширенная гепатэктомия; без резекции = фиктивная хирургия; FSC = сигнал прямого рассеяния; SSC = боковой разброс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 8: Окрашивание Судана IV как маркер содержания жира в изолированных свежих гепатоцитах. (A) Гепатоциты из свежей цельной печени мыши без предварительного хирургического вмешательства. Увеличение размера и содержания жира в гепатоцитах через 24 ч (B) после 70%-гепатэктомии и (C) 86%-гепатэктомии. Обратите внимание на одновременное наличие как более крупных стеатотических гепатоцитов, так и более мелких, нестеатотических гепатоцитов. Масштабные линейки = 30 мкм (B-D). Полосы погрешностей относятся к стандартным отклонениям с n = 6-8 / группа. Сокращения: sHx = стандартная гепатэктомия; eHx = расширенная гепатэктомия; без резекции = фиктивная хирургия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Очень низкий процент иммунных и непаренхиматозных клеток остается в окончательной суспензии. Дальнейшая очистка достигается с помощью FACS или MACS, при желании. Отрицательный отбор клеток CD31+ и CD45+ с помощью проточной цитометрии используется для демонстрации и количественной оценки непаренхиматозных клеток (рис. 5).
Рисунок 5: Стратегия стробирования проточной цитометрии и отбор клеток паренхимы CD31 и CD45. (A) Стробовая диаграмма со всеми зарегистрированными событиями; Учитывайте относительно большие размеры гепатоцитов и используйте скорректированные напряжения. Не превышайте 350 В для FSC и 220 В для SSC. (B) Синглетное стробирование. (C) Гепатоциты отбираются путем стробирования клеток CD31- (эндотелиальный маркер) и CD45- (иммунный маркер). Этот отбор может быть выполнен в сортировщике клеток, активируемом флуоресценцией, для отбора паренхиматозных клеток для дальнейшего последующего анализа, если это необходимо; n = 4-5/группа. Сокращения: FSC = прямой скаттер; SSC = боковой разброс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Чтобы продемонстрировать эффективность модифицированного протокола в удержании стеатотических клеток, гепатоциты были выделены с использованием классического подхода к градиенту плотности7 (рис. 9А). В отличие от модифицированной процедуры (рис. 9B), слой жировых клеток был хорошо виден поверх градиента плотности. Анализ клеток подтвердил полное отсутствие липидных гепатоцитов в грануле после центрифугирования с градиентом плотности. Напротив, клетки жирового слоя были обогащены стеатотическими гепатоцитами и значительной долей непаренхиматозных и мертвых клеток (рис. 9А). Таким образом, классическая изоляция лишает урожая стеатотических клеток, в то время как этот модифицированный протокол, исключающий градиент плотности, сохраняет липидные субпопуляции, что позволяет непредвзято исследовать регенерацию печени без перекоса в сторону постных гепатоцитов.
Рисунок 9: Выход стеатотических гепатоцитов в соответствии с классическим протоколом выделения градиента плотности по сравнению с улучшенным протоколом . (A) При классическом методе очистки с градиентом плотности (конечная концентрация 90% раствора с градиентом плотности в фосфатно-буферном физиологическом растворе) мертвые гепатоциты собираются в клеточный слой поверх раствора с градиентом плотности. (B) Этот слой состоит не только из непаренхиматозных клеток и нежизнеспособных гепатоцитов, но и из жизнеспособных, крупных, жирных гепатоцитов. (C) Гранула, полученная после центрифугирования с градиентом плотности, содержит бедные гепатоциты меньшего размера и в основном лишена стеатотических клеток. Это «чистая» фракция, которая выделена классическим протоколом. (D) При улучшенном протоколе заполненные липидами гепатоциты не теряются, и все гепатоциты гранулируются. Надосадочная жидкость (E) состоит в основном из мертвых и фрагментированных гепатоцитов и непаренхиматозных клеток, в то время как гранула (F) представляет собой смесь гепатоцитов переменного размера и содержания липидов. Масштабные линейки = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Дополнительные протоколы. а) окрашивание липидов с помощью Судана IV; (B) стандартная и расширенная гепатэктомия у мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S1: Обзор перфузионной установки. (1) Канюляция нижней полой вены. (2) Перфузируйте печень теплым перфузионным буфером для хелатирования кальция. (3) Подогрейте буфер пищеварения с помощью коллагеназ и Ca2+ , чтобы диссоциировать клетки in vivo. Удалите печень и (4) храните в ледяном буфере для консервации (максимум 30 минут). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Перфузионная установка. (A) Перфузионный стол с изофлурановым соплом, лампой нагрева красного света и перфузионной трубкой. Под трубку можно поместить тяжелый предмет, чтобы стабилизировать ее и снизить риск смещения. (B) В течение первых нескольких минут перфузии некоторое количество крови будет вытекать через воротную вену и скапливаться в открытой брюшной полости. (C) Брюшная стенка надрезается с одной стороны для отвода крови. Ватный тампон облегчает дренаж. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S3: капсула Глиссона. (A) Капсула Глиссона разрывается пинцетом с тонким наконечником в нескольких местах вдоль поверхности печени, и клетки печени высвобождаются путем осторожного встряхивания капсулы. (Б) Печень должна легко разрываться. (C) Пустой печеночный мешок (капсула Глиссона) с высвобожденными гепатоцитами в суспензии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S4: Стратегия стробирования проточной цитометрии для скрининга жизнеспособности. (А) Все события были записаны. (B) Синглетное стробирование. (C) Живое/мертвое окрашивание красителем Alexa Fluor 488 Zombie green. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S5: Стратегия стробирования проточной цитометрии для измерения зернистости. (А) Все события были записаны. (B) Синглетное стробирование. (C) Точечная диаграмма бокового рассеяния (SSC; ось x ) по сравнению с прямым рассеянием (FSC; ось y ) для анализа уровней детализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S6: Очистка гепатоцитов. (A) Гранулы ячейки после первой стадии центрифугирования; Обратите внимание на жировую прослойку поверх среды. (B) Гранула гепатоцитов после второго раунда центрифугирования. (C) Очищенные гепатоциты в конце процесса очистки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Опубликованный протокол обеспечивает надежный и простой метод выделения высокого выхода нормальных и стеатотических мышиных гепатоцитов для одноклеточного последующего анализа или массового анализа клеток после сортировки FACS. Явное преимущество перед очисткой с градиентом плотности заключается в том, что содержание клеточных липидов практически не влияет на эффективный выход гепатоцитов. Таким образом, фракция стеатотических гепатоцитов будет сохранена и включена в последующие анализы. Это не только важно для изучения стеатогенных заболеваний печени, но и имеет первостепенное значение для любого анализа процессов после обширной гепатэктомии, когда гепатоциты проявляют временной и пространственно динамический стеатоз в течение первых 2-3 дней регенерации. Несмотря на то, что (одноклеточные) анализы изолированных гепатоцитов уже проводились после гепатэктомии 19,20,21, следует предположить, что анализируемая клеточная популяция была, по крайней мере частично, лишена липидных гепатоцитов, и поэтому результаты не были полностью репрезентативными и смещены в сторону постных гепатоцитов.
В настоящее время функция TRAS до конца не выяснена. Например, пространственные различия в содержании липидов в дольках печени остаются непонятными. Следовательно, необходим метод, который позволяет количественно и качественно обнаруживать без точного исключения этих клеток из анализов (например, для одноклеточной транскриптомики, проточной цитометрии и метаболомики).
В целом, выход гепатоцитов с помощью этого улучшенного протокола заметно превосходит другие методы выделения жиросодержащих гепатоцитов (например, от мышей с неалкогольным стеатогепатитом, НАСГ) с использованием очистки градиента плотности15. Однако выход клеток, жизнеспособность и содержание жира могут варьироваться между препаратами. По-видимому, за это ответственны несколько факторов.
Во-первых, различные партии коллагеназы или коллагеназных смесей будут различаться по своей ферментативной активности; Однако различия между партиями не так критичны, как в случае с традиционными коллагеназами. Тем не менее, может потребоваться регулировка рабочей концентрации. Различия могут быть дополнительно сведены к минимуму путем надлежащего хранения до использования (сухие лиофилизаты и регидратированные исходные растворы при температуре от -15 до -25 ° C) и избегания повторяющихся циклов замораживания-оттаивания, но не могут быть полностью устранены. Поэтому рекомендуется использовать только коллагеназы определенной партии для данной экспериментальной серии. Кроме того, ферментативная активность зависит от температуры, при которой буфер пищеварения достигает печени, с оптимальной температурой от 35 ° C до 37 ° C для смеси коллагеназ I и II22. Более низкие температуры снижают ферментативную активность, в то время как температуры выше 50 °C могут привести к необратимой денатурации белка. Проверьте это заранее и оптимизируйте условия эксперимента, отрегулировав начальную температуру буфера разложения, длину и диаметр пластиковой трубки, а также скорость потока. Например, следует ожидать снижения температуры буфера до 10 °C в пределах трубы длиной 60 см. При необходимости отрегулируйте температуру, используя грелки и инфракрасные лампы. Коллагеназы демонстрируют свою оптимальную способность к перевариванию при рН 7,4; поэтому перед использованием рекомендуется отрегулировать рН буферных растворов уже при рабочей температуре около 37 °C.
Во-вторых, крайне важно достаточно промыть печень (или всю мышь) перфузионным буфером перед началом процесса пищеварения, чтобы устранить потенциальные ингибиторы, такие как сыворотка или альбумин. В идеале перфузию начинают только после того, как системное кровообращение прекратилось, чтобы буфер пищеварения двигался только от полой вены через печень к оттоку через открытую воротную вену. Верхняя полая вена может быть закрыта небольшим сосудистым зажимом. Это предотвращает контакт с остаточными компонентами/ингибиторами крови. Еще одним методом оптимального промывания печени является прерывистое пережатие воротной вены. Это следует делать осторожно и - как только буфер пищеварения достигнет печени - выполнять только один раз, чтобы не повредить уже переваренные клетки.
В-третьих, регенерирующие гепатоциты чувствительны, и опыт показал, что они требуют более короткого времени переваривания и более осторожного обращения, чтобы избежать чрезмерного переваривания и вреда для клеток. Чтобы собрать печень как можно мягче, рекомендуется захватить печеночный хилус зажимом, а затем сначала разрезать верхнюю полую вену и освободить печень от соединений с веной и диафрагмой. Впоследствии нижняя полая вена и воротная вена могут быть перерезаны, что обеспечивает мобилизацию печени и легко освобождает ее от связок желудочно-кишечного тракта, пищевода с одной стороны и правой почки с другой стороны. У мышей, подвергшихся гепатэктомии, можно осторожно захватить одну из лигатур срединных долей, чтобы удалить печень. Если попытаться вытащить печень силой, капсула Глиссона может разорваться, и изолированные клетки могут потеряться.
Наконец, важно, чтобы процедура перфузии и дальнейшая обработка гепатоцитов не прерывались и не откладывались, так как это немедленно и неизбежно повлияет на жизнеспособность. В идеале перфузия проводится в команде не менее двух человек и на одном животном одновременно. Эти требования ко времени и рабочей силе, однако, являются одним из ограничений этого метода, хотя это относится и к альтернативным методам.
Другим ограничением является окончательная чистота полученной клеточной суспензии, поскольку преимущество отсутствия потери стеатотических гепатоцитов из-за градиента плотности приводит к небольшой доле оставшихся непаренхиматозных и/или иммунных клеток. В показанном образце доля CD45+ (иммунные клетки) и CD31+ (эндотелиальные клетки) ниже 5%, а при отборе по размеру клеток сначала во время проточной цитометрии процентное содержание CD45+ и CD31+ составляет 1,2% и 2,2% соответственно (рис. 5). Для большинства применений этот уровень чистоты достаточен, но высокочувствительные методы или дальнейшее использование в первичных клеточных культурах, вероятно, требуют более высокой степени. Многочисленные исследования использовали CD31 и CD45 в качестве системных маркеров для сортировки популяций клеток печени по MACS 23,24 или FACS25.
Этот улучшенный метод выделения идеально подходит для изучения регенерации печени, особенно в раннем периоде, который характеризуется значительным количеством стеатотических гепатоцитов. PHLF, характеризующийся персистирующим стеатозом, является особенно актуальной темой, требующей исследования. После расширенной гепатэктомии, оставляющей после себя маргинальные остатки, может развиться ФГВУ и действительно представляет собой наиболее частую причину смерти из-за операции на печени. Его патобиология изучена лишь частично, и в настоящее время лечение недоступно26. Учитывая, что PHLF значительно ограничивает применение хирургии печени (например, для лечения злокачественных новообразований печени), изучение его причин и определение потенциальных мер является явной медицинской необходимостью.
Существует также необходимость в изучении заболеваний, которые разделяют стеатоз печени в качестве отправной точки. Ярким примером является неалкогольная жировая болезнь печени (НАЖБП), которая может прогрессировать до НАСГ и, в конечном итоге, до гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК)27. Распространение сидячего образа жизни в сочетании с западной диетой привело к всемирной эпидемии НАЖБП, и, соответственно, заболеваемость ГЦК, по прогнозам, возрастет28,29. Стеатоз, в свою очередь, также тесно связан с ожирением, метаболическим синдромом и диабетом 2 типа, всеми заболеваниями с растущей заболеваемостью30. Таким образом, стеатоз представляет собой растущую нагрузку на нынешнюю систему здравоохранения, требующую эффективных средств для его лечения. Этот усовершенствованный двухэтапный метод перфузии коллагеназы позволяет изучать стеатотические гепатоциты на уровне отдельных клеток и, следовательно, должен помочь в изучении причин и последствий накопления гепатоцеллюлярных липидов.
Этот протокол представляет собой простую, быструю и надежную технику выделения in vivo регенерирующих гепатоцитов у мышей после частичной (70%) и расширенной (86%) гепатэктомии. Этот подход не основан на градиентной очистке и может быть использован для исследования процессов регенерации печени с включением липидных гепатоцитов, которые обычно теряются во время традиционных протоколов изоляции. Более того, этот метод также может быть применен для исследования различных заболеваний печени, связанных со стеатическими изменениями, и не ограничивается видами мышей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Швейцарским национальным фондом (грант проекта 310030_189262).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | - |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | - |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | - |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | - |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | - |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | - |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | - |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | - |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | - |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | - | - |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | - |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | - |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | - |
| Fenestrated sterile surgical drape | - | - | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | - |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | - |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | - | - |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | - |
| Isofluran station | Provet | - | - |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | - | - |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | - | - |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | - |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | - |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | - | - |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | - | - |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | - |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | - | Adjust to 42 °C |
References
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C.
- Lehmann, K., et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).
- Makino, H., et al. A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice. Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).
- Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N. Liver Pathology. Gayam, V., Engin, O. , IntechOpen. (2019).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Trotter, N. L. A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy. Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).
- Kachaylo, E., et al. PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice. Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Dold, S., et al. Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation. PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).
- Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 5 (22), (2020).
- Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver. Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).
- Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation. Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).
- Roche, Liberase TM Research Grade. , (2020).
- Giugliano, S., et al. Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication. Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).
- Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes. Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).
- Helling, T. S. Liver failure following partial hepatectomy. HPB. 8 (3), 165-174 (2006).
- Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F.
- Park, W. Y., et al. Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study. Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude. Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- Roeb, E. Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD). Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).
