Summary
Lipidbelastade hepatocyter är inneboende för leverregenerering men förloras vanligtvis vid densitetsgradientcentrifugering. Här presenterar vi ett optimerat cellisoleringsprotokoll som behåller steatotiska hepatocyter, vilket ger representativa populationer av regenererande hepatocyter efter partiell hepatektomi hos möss.
Abstract
Partiell hepatektomi har använts i stor utsträckning för att undersöka leverregenerering hos möss, men isoleringen av höga utbyten av livskraftiga hepatocyter för nedströms encellsapplikationer är utmanande. En markant ackumulering av lipider inom regenererande hepatocyter observeras under de första 2 dagarna av normal leverregenerering hos möss. Denna så kallade övergående regenereringsassocierade steatos (TRAS) är tillfällig men överlappar delvis den stora proliferativa fasen. Densitetsgradientrening är ryggraden i de flesta befintliga protokoll för isolering av primära hepatocyter. Eftersom gradientrening är beroende av cellernas densitet och storlek, separerar den icke-steatotiska från steatotiska hepatocytpopulationer. Därför förloras ofta feta hepatocyter, vilket ger icke-representativa hepatocytfraktioner.
Det presenterade protokollet beskriver en enkel och tillförlitlig metod för in vivo-isolering av regenererande hepatocyter oavsett deras lipidinnehåll. Hepatocyter från manliga C57BL / 6-möss isoleras 24-48 timmar efter hepatektomi genom en klassisk tvåstegs kollagenasperfusionsmetod. En standard peristaltisk pump driver de uppvärmda lösningarna via den kateteriserade underlägsna vena cava in i resten, med hjälp av en retrograd perfusionsteknik med utflöde genom portalvenen. Hepatocyter dissocieras av kollagenas för deras frisättning från Glissons kapsel. Efter tvättning och noggrann centrifugering kan hepatocyterna användas för alla nedströmsanalyser. Sammanfattningsvis beskriver detta dokument en enkel och reproducerbar teknik för isolering av en representativ population av regenererande hepatocyter efter partiell hepatektomi hos möss. Metoden kan också hjälpa till att studera fettlever.
Introduction
Levern kan regenerera sig även efter större vävnadsförlust. Denna unika regenerativa kapacitet illustreras uttryckligen av den experimentella modellen för partiell (70%) hepatektomi, som först beskrevs hos råttor av Higgins och Anderson 19311. I denna modell avlägsnas 70% av levern kirurgiskt från djur genom att klippa av större leverlober. De återstående loberna växer sedan genom kompensatorisk hypertrofi för att återställa den ursprungliga levermassan inom cirka 1 vecka efter operationen, om än utan återställande av den ursprungliga leverarkitekturen 2,3. Ytterligare hepatektomier med varierande mängder vävnadsavlägsnande har utvecklats, såsom 86%-förlängd hepatektomi där leverresterna är för små för att återhämta sig, vilket så småningom leder till posthepatektomi leversvikt (PHLF) och efterföljande död hos 30% -50% av djuren 4,5,6. Dessa modeller möjliggör studier av normal och misslyckad leverregenerering, beroende på mängden resekterad vävnad (figur 1).
Även om musmodeller av hepatektomi har använts framgångsrikt i många år, har först nyligen mer avancerade analysmetoder möjliggjort en djupare insikt på encellsnivå. För de flesta av dessa metoder är emellertid närvaron av enskilda hepatocyter en grundläggande förutsättning. De flesta protokoll för isolering av primära hepatocyter är baserade på en tvåstegs kollagenasperfusionsteknik och efterföljande densitetsgradientrening för att separera livskraftiga hepatocyter från skräp och icke-parenkymala, såväl som döda celler 7,8,9. Denna metod beskrevs först av Berry and Friend 196910 och anpassades av Seglen och kollegor 197211,12. Men eftersom gradientcentrifugering är beroende av cellernas densitet och storlek, förloras lipidbelastade hepatocyter ofta under standardrening. Även om sådan förlust kan vara försumbar för många forskningsfrågor, är det en avgörande aspekt för tidig leverregenerering. Under de första 2 dagarna ackumulerar hepatocyter i den regenererande musleveren lipider och växer därmed i storlek och doppar i densitet. Denna övergående regenereringsassocierade steatos (TRAS) tjänar till att ge regenerativt bränsle och är tillfällig, men överlappar delvis den stora proliferativa fasen och är ojämnt fördelad inom leverlobulerna - de funktionella enheterna i levern13,14. Efter förlängd 86%-hepatektomi förekommer emellertid TRAS också men kvarstår, eftersom regenereringen stoppas och lipider oxiderasinte 14. Därför kommer gradientrening av hepatocyter efter 70%- eller 86%-hepatektomier att ge icke-representativa fraktioner, eftersom de flesta lipidbelastade hepatocyter går förlorade på grund av deras låga densitet15.
I detta modifierade isoleringsprotokoll isoleras hepatocyter från C57BL / 6-möss 24-48 timmar efter hepatektomi genom en klassisk tvåstegs kollagenasperfusionsmetod. Vanligtvis görs kanylering och perfusion av resterna för cellisolering via portalvenen. Det portovaskulära motståndet i små rester kvar efter större resektion är dock högt16, och perfusion är därför känslig. Eftersom vena cava förblir opåverkad av hepatektomier, kan perfusion enkelt utföras i retrograd riktning via kanylering av vena cava. En standard peristaltisk pump driver de uppvärmda lösningarna via den kateteriserade underlägsna vena cava in i leverresten, med retrograd perfusion med utflöde genom portalvenen (kompletterande figur S1). Hepatocyter dissocieras av kollagenaser och frigörs från Glissons kapsel. Efter tvättning och noggrann bearbetning av livskraftiga hepatocyter genom stegvis isolering med hjälp av en låghastighetscentrifugeringsmetod kan hepatocyterna användas för alla nedströmsanalyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök var i enlighet med schweiziska federala djurförordningar och godkända av veterinärkontoret i Zürich (nr 007/2017, 156/2019) som garanterar mänsklig vård. Manliga C57BL / 6-möss i åldern 10-12 veckor hölls på en 12 h dag / natt cykel med fri tillgång till mat och vatten. Varje försöksgrupp bestod av sex till åtta djur. Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material, utrustning och reagenser som används i detta protokoll.
1. Partiell hepatektomi hos möss
- För standard hepatektomi (70%), ligera och resektera vänster sidolob, höger del av medianloben och vänster del av medianloben (figur 1B). För förlängd hepatektomi (86%)4, ta också bort caudatalloberna och den högra främre loben (figur 1C).
- OBS: Standard hepatektomi är ett förfarande som har använts i leverregenereringsforskning i många år. Protokoll för denna procedur finns tillgängliga3,17, inklusive det videoassisterade protokollet från Mitchell och Willenbring 18. Mer information om de tekniker som används här för hepatektomi finns i kompletterande fil 1.
Figur 1: Standard (70%) och förlängd (86%) hepatektomi hos möss. (A) De fem musleverloberna och deras respektive bidrag till den totala levervikten. (B) Schematisk illustration av 70%-hepatektomi hos möss. De mörka loberna representerar den framtida leverresten. (C) Schematisk illustration av 86%-hepatektomi hos möss. De mörka loberna representerar den framtida leverresten. (D) Exakt volym resekterad vävnad efter 70%- och 86%-hepatektomi. (E) Musbuken omedelbart efter 70%-hepatektomi; (F) musbuken omedelbart (vänster) och 48 timmar (höger) efter 86%-hepatektomi. Notera den bleka färgen på den steatotiska kvarlevan (vit pil). n = 6-7/grupp. Förkortningar: sHx = standard hepatektomi; eHx = förlängd hepatektomi; LW = levervikt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Beredning av perfusionslösningarna
- Förbered perfusions-, matsmältnings- och konserveringsbuffertarna (se tabell 1).
- Justera pH-värdet för alla buffertlösningar vid 37 °C genom att tillsätta natriumhydroxid (NaOH) eller väteklorid (HCl) efter behov. Det optimala pH-värdet för buffertarna är 7,4.
- Lägg konserveringsbufferten och Williams Medium E på is.
- Förbered flödescytometribufferten och förvara den på is.
Tabell 1: Lösningar och buffertar som används för uppslutning och rening av hepatocyter. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
3. Beredning av perfusionsutrustning
- Värm vattenbadet till 42 °C och placera perfusionsbufferten (50 ml) och digestionsbufferten (10–20 ml) i vattenbadet. Tillsätt inte kollagenas till matsmältningsbufferten ännu.
- Förbered den peristaltiska pumpen och sätt in slangen. Den fullständiga perfusionsinställningen visas i figur 2.
- Anslut en 26 G IV kanyl till slangens utloppsände med en Luer lock-kontakt. För in rörets inloppsände i det förvärmda perfusionsbuffertröret i vattenbadet. Spola slangen med 70% etanol, följt av 50 ml steril natriumklorid (NaCl 0,9%). Fyll slangen med varm perfusionsbuffert (pumphastighet 3 ml/min).
- Lugna musen med isofluraninhalationsanestesi (800 ml/minO2, 3%-5% isofluran för induktion och 2% för underhåll under proceduren). Hantera isofluran under laboratoriehuv och sörj för tillräcklig ventilation.
- Administrera buprenorfin subkutant 30 minuter före operation i en dos på 0,1 mg/kg kroppsvikt.
- För att förhindra hypotermi, placera den sederade musen på en värmedyna och lägg en rullad tygvävnad under övre buken för att höja levern över de andra organen och underlätta tillgången till den sämre vena cava.
OBS: Använd inte vävnad som är för tjock eftersom kinkning av kärl är möjlig och perfusionseffekten skulle påverkas. - Tillsätt ögonsalva för att förhindra hornhinneskador.
- Innan operationen påbörjas, se till att djuret är tillräckligt bedövat genom att testa pedalabstinensreflexen (fotdyna nypa på båda bakfötterna). Vid svar, ge ytterligare anestesi och testa igen innan proceduren påbörjas.
- Rengör buken med 70% etanol.
- Öppna mittlinjesnittet igen genom att klippa suturen och försiktigt dra isär sårkanterna. Om hepatektomi är äldre än 24-48 h, ta bort suturen och skär huden med sax.
- Fäst en 5-0 polypropensutur på bröstbenet, dra den kraniellt och fixa den i detta läge. Använd en retractor eller enkla klämmor för att hålla buken öppen. Bukhålan måste exponeras så mycket som möjligt för att optimera åtkomst och visualisering.
- Flytta tarmarna till höger med hjälp av bomullspinnar för att avslöja portalvenen och vena cava. Använd en våt trasa för att behålla tarmarna.
- Placera ett tungt föremål med ca 2 cm höjd (t.ex. en silikonbelagd viktring för mätkolvar) intill musens bakben (kompletterande figur S2A). Placera slangen med den anslutna 26 G IV-kanylen på föremålet och placera nålen försiktigt ovanpå vena cava. Justera slangens längd.
- Lägg den beredda kollagenasstamlösningen i det förvärmda rötningsbuffertröret. Tillsätt 250 μl stamlösning till 10 ml rötningsbuffert. Förbered 10-20 ml matsmältningsbuffert per djur. För större djur eller perfusion av hela lever, förbered upp till 30 ml matsmältningsbuffert.
OBS: Det rekommenderas att tillsätta kollagenasstamlösningen till den uppvärmda rötningsbufferten cirka 30 minuter innan rötningsprocessen påbörjas.
Bild 2: Översikt över perfusionskonfigurationen. (A) Kirurgiskt bord med den utrustning som behövs för perfusionen. (B) De material som behövs för beredning av levern, liksom hepatocytextraktion och isolering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Kanylering och perfusion
- Justera pumphastigheten till 3 ml/min och slå på pumpen. Låt den förvärmda perfusionsbufferten nå nålen. Kassera de första 2-3 ml perfusionsbufferten.
- Utför kanylering av den sämre vena cava.
- Medan bufferten löper genom nålen, sätt in 26 G IV-kanylen i en grund vinkel i vena cava under njuren. Se till att nålavfasningen pekar uppåt.
- Använd en bomullspinne för att försiktigt dra vena cava kaudalt under punkteringsstället så att den medföljande spänningen underlättar införandet av kanylen i venen. Leta efter blod i kateterns blixtkammare när nålen kommer in i lumen.
- För nålen ytterligare 2-3 mm framåt för att säkerställa att spetsen på plastkatetern också har kommit in i venen.
- Skjut plastkatetern över nålen och in i vena cava ytterligare 5 mm. Ta bort nålen långsamt och mycket försiktigt.
OBS: Fixering av kanylen med en ligatur rekommenderas inte. Detta steg är tidskrävande eftersom fartyget först måste dissekeras för detta ändamål. Om kanylen är löst placerad och stöds av ett föremål behövs ingen ytterligare fixering (se perfusionsuppställning i kompletterande figur S2). För att stabilisera kanyleringsstället och förhindra återflöde kan en enda droppe monomera n-butylcyanoakrylat tillsättas på kanyleringsstället.
- När blod faller ut ur kanylen, fyll den med varm perfusionsbuffert med en spruta.
- Sätt tillbaka röret på kanylen, som fortfarande körs med en pumphastighet på 3 ml/min. Låt perfusionsbufferten komma in i levern.
- Efter 2-3 s, leta efter vita fläckar som bildas i levern och / eller expansion / svullnad av portalvenen, vilket indikerar att perfusionsbufferten strömmar genom levern och kommer in i leverlobulerna från den centrala venen (figur 3).
- Vänta tills portalvenen synligt sväller inom 1-2 s efter utseendet av vita fläckar på leverytan. Klipp portalvenen med sax så distalt som möjligt från leverhilusen. Använd en mikrokärlklämma för att märka (inte täppa till) skärplatsen (bild 3B).
OBS: Detta förenklar bedömningen av flödet genom levern under perfusionsprocessen. Levern rensar blod omedelbart och blir gulvit inom några sekunder (figur 3C). Ett ytterligare snitt genom huden på höger sida av buköppningen underlättar utflödet av blodet såväl som perfusionslösningen (figur 3B och kompletterande figur S2B, C). - Öka flödet upp till 4-7 ml/min beroende på djurets vikt, leverstorlek och omfattningen av den tidigare hepatektomi.
- Kläm fast portalvenen med pincett eller kärlklämma i 7-10 s. Se till att ingen vätska passerar igenom.
OBS: Levern sväller synligt under klämning och slappnar av vid frisättning. Detta är avgörande för att spola hela levern och rensa den från eventuellt kvarvarande blod. - Utför en andra klämma efter cirka 30 s och se till att levern sväller och slappnar av. Fortsätt med att spola djuret tills bufferten som rinner ut ur portvenen är klar, men åtminstone i 3-4 minuter.
OBS: Pumphastigheten beror på röret såväl som leverns storlek. Det måste utvärderas individuellt. - Vid denna tidpunkt av förfarandet borde eutanasi ha inträffat sekundärt till exsanguination. Bekräfta att systemcirkulationen har upphört (inga hjärtslag eller flimmer i hjärtat). För att säkerställa döden utförs bilateral pneumotorax i detta skede av proceduren som sekundär fysisk metod för eutanasi.
OBS: Sänk pumphastigheten något om systemcirkulationen har stannat (inga hjärtslag eller flimmer i hjärtat).
Figur 3: Perfusionsprocessen från kanylering till matsmältning. (A) Musleverns anatomi med den nedre vena cava (vit pil) och portalvenen (gul pil). (B) Kanylering av den sämre vena cava. Kanylen är säkrad med en ligatur (vit pil), och platsen för utflödet genom den öppnade portalvenen är markerad (inte fastklämd) med en mikrokärlklämma. (C) Observera uppkomsten av fläckiga strukturer innan perfusionsbufferten har rensat levern från allt återstående blod (vit pil). Huden skärs (gul pil) och en bomullspinne placeras för att säkerställa dränering av blod och perfusionsvätska. Intermittent klämning kan utföras med en vaskulär klämma eller pincett. (D) Levern ska rensas från allt blod (*). Efter att den kollagenasinnehållande matsmältningsbufferten har kommit in i levern kommer den inte längre att slappna av efter klämning och leverloberna kommer att öka i storlek. (E) Efter ett tag kan ett bubbligt utseende observeras på leverns yta (*). Klicka här för att se en större version av denna figur.
5. Matsmältning
- Pausa perfusionspumpen och överför snabbt inloppsslangen från perfusionsbufferten till den förvärmda rötningsbufferten. Starta om pumpen.
- Innan matsmältningsbufferten når levern, kläm fast portalvenen en gång till i 3-4 s. Se till att levern slappnar av när klämman släpps och att perfusionsvätskan förblir klar.
OBS: Digestionsbufferten innehåller fenolrött och är lätt att skilja från den klara perfusionsbufferten. Detta möjliggör enkel spårning i röret. - Så snart matsmältningsbufferten har nått levern, kläm fast portalvenen igen med ett mikrokärlklämma.
OBS: Vid fastspänning sväller levern men slappnar inte av när klämman släpps. Detta är normalt. - För att underlätta matsmältningsprocessen, stäng den överlägsna vena cava med en vaskulär klämma direkt under membranet så att matsmältningsbufferten kan passera från den sämre vena cava till levern till utflödet genom den öppnade portalvenen.
OBS: Denna fastspänning säkerställer att den systemiska cirkulationen kringgås och onödig kontakt med kvarvarande blodkomponenter/inhibitorer förhindras. Detta steg är valfritt, eftersom det är svårt att närma sig den överlägsna vena cava bakom den förstorade levervävnaden efter skenoperation, men åtkomst är mycket lättare hos hepatektomerade möss. - Smält i ca 4 min med en flödeshastighet på 5 ml/min. När matsmältningen fortskrider, leta efter tecken på levern börjar svälla och små klara / transparenta sektioner på ytan av levern. Observera dessutom att levern tar på sig strukturen av en våt trasa och verkar nästan fuktig (figur 3E). Sondra konsistensen genom att försiktigt röra med en fuktig bomullspinne.
- Fortsätt med perfusionen tills en markant skillnad i leverns ytstruktur kan observeras. Observera att levern antar en mycket ljus färg och ett bubbligt utseende (figur 3E), och Glissons kapsel (dvs leversäcken) skiljer sig från parenkymen. Stoppa matsmältningsprocessen så snart levern har förvärvat dessa egenskaper, eftersom övermatsmältning kan skada hepatocyterna. Ta bort nålen innan luft kommer in i levern.
OBS: Vanligtvis behövs 10-20 ml matsmältningsbuffert för att nå tillräcklig matsmältning. Detta beror på djurets storlek, omfattningen av hepatektomi, slanginställning och kvaliteten på kollagenaslösningen. Om det behövs, öka perfusionstiden snarare än perfusionshastigheten. För mycket tryck i kärlsystemet kan orsaka att levern spricker och perfusions- / matsmältningsvätskan kan gå förlorad till retroperitonealutrymmet.
6. Förberedelse av levern
- Ta bort levern försiktigt från bukhålan. Var mycket försiktig eftersom den nu är mycket tunn och ömtålig.
- Ta tag i den centrala bindväven mellan loberna med pincett och lyft den något uppåt och använd den som en förankringspunkt.
- Skär alla anslutningar i levern till andra organ, ta bort gallblåsan och placera levern i den iskalla konserveringsbufferten.
OBS: Helst bör hepatocytextraktion och vidare bearbetning ske omedelbart för att upprätthålla hepatocyternas livskraft. Vid behov kan levern dock förvaras under en kort tid vid 4 °C (t.ex. för transport). Denna fördröjning bör inte överstiga 30-40 min.
7. Hepatocytextraktion
- Överför levern till en 10 cm petriskål och tillsätt 10 ml iskall Williams Medium E.
- Ruptur Glissons kapsel med pincett med fin spets på några ställen längs leverytan. Ta tag i en central del (t.ex. bindväv vid levern hilus) med två par pincett och dra dem långsamt isär, så att kapseln kan riva utan att skada hepatocyterna. Släpp cellerna genom att försiktigt skaka kapseln (kompletterande figur S3).
OBS: Helst rivs levern lätt isär och släpper ut cellerna. Använd inte våld. En cellskrapa kan hjälpa till att helt ta bort alla celler och öka cellutbytet. Skär inte levern i bitar med sax. - Filtrera 5 ml levermassa genom en 100 μm cellsil till ett 50 ml rör. Skölj filtret med 10 ml färskt iskallt medium. Filtrera de återstående 5 ml massa genom cellsilen.
Använd en 25 ml serologisk pipett för att överföra levermassan med de dissocierade hepatocyterna (figur 4A). Mindre pipetter med mindre öppningar ökar skjuvspänningen och skadar hepatocyterna irreversibelt. - Tillsätt totalt 30 ml kallt medium för att skölja petriskålen, filtrera den och tillsätt suspensionen till 50 ml röret tills det är fullt. Alla isolerade celler är nu suspenderade (figur 4B).
Figur 4: Rening genom försiktig centrifugering . a) Leverhomogenat kvar efter extraktionen. (B) Mikroskopisk vy (20x förstoring) av homogenatet. Observera den markerade föroreningen med skräp. (C) Reningscentrifugeringssteg och (D) mikroskopiska vyer av de supernatanter som ska kasseras. (E) Mikroskopisk bild av den renade hepatocytfraktionen. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
8. Hepatocytisolering
- Snurra vid 50 × g i 5 minuter vid 4 °C (lägsta möjliga acceleration och lägsta möjliga broms).
Hepatocyter är tätare än icke-parenkymala leverceller. På grund av den låga centrifugeringskraften pelleteras endast hepatocyter, medan andra celler (t.ex. immunceller, erytrocyter och sinusformade celler) förblir i supernatanten. - Aspirera det mesta av supernatanten och lämna 1 ml för att resuspendera cellerna genom att försiktigt virvla röret.
- Tillsätt 40 ml kallt Williams E-medium och snurra igen vid 50 × g i 10 minuter vid 4 °C (låg acceleration, låg broms) för att ytterligare avlägsna döda hepatocyter och cellskräp och pelletlivskraftiga och feta hepatocyter (figur 4C).
- Kassera det mesta av supernatanten och lämna 1 ml för att resuspendera cellerna genom att virvla röret.
- Tillsätt 40 ml kallt Williams E-medium och snurra igen vid 50 × g i 5 minuter vid 4 °C (låg acceleration, låg broms).
- Aspirera det mesta av supernatanten och lämna 1 ml för att resuspendera cellerna genom att försiktigt virvla röret.
Stoppa inte denna process förrän cellerna är fixerade eller analyserade. Hepatocyter är mycket ömtåliga och varje fördröjning i perfusions-, matsmältnings- och reningsprocessen kan skada cellerna. - Bestäm den slutliga cellkoncentrationen efter tillsats av trypanblått med hjälp av en Neubauer-förbättrad räknekammare.
OBS: De flesta skräp och icke-parenkymala celler har nu tagits bort, vilket resulterar i en ren pellet på cirka 10-15 × 106 hepatocyter kvar efter 70% hepatektomi. - Beroende på önskad koncentration, tillsätt mer iskallt medium. Använd hepatocytcellsuspensionen för någon nedströmsanalys eller initiera en primär cellodling.
OBS: I detta skede finns endast ett fåtal immun- och icke-parenkymala celler (<5%) kvar i suspensionen. Om ytterligare rening önskas, utför ett negativt urval av CD31+ och CD45+ celler genom magnetisk eller fluorescensaktiverad cellsortering (MACS/FACS). Hittills finns det ingen pålitlig och robust ytmarkör för leverparenkymala celler.
9. Beredning av de isolerade hepatocyterna för flödescytometri
- Centrifugera hepatocyterna vid 100 × g i 5 minuter.
- Kassera supernatanten och tillsätt önskad mängd flödescytometribuffert, beroende på cellsuspensionens koncentration.
- Tillsätt 1 ml cellsuspension i ett flödescytometrirör. Centrifugera i 5 min vid 100 × g och kassera supernatanten.
- Tillsätt 100-200 μL av det utspädda Alexa Fluor 488 Zombie gröna livskraftsfärgämnet (koncentration 1:400) till cellerna och skaka dem försiktigt. Resuspendera försiktigt hepatocyterna genom manuell skakning eller med en virvelblandare med låg hastighet (max 2-3) i 2 sekunder.
OBS: Använd inte små pipettspetsar för att återsuspendera cellerna. De är mycket ömtåliga och den applicerade skjuvspänningen orsakar skador och minskar cellens livskraft. Om pipettering inte kan undvikas, använd en 1 000 μL pipett efter att ha klippt av den minsta delen från spetsen för att förstora diametern och pipettera cellerna mycket långsamt. - Placera rören på is eller förvara dem vid rumstemperatur, beroende på önskad färgning. Inkubera cellerna i 20-30 minuter i mörkret.
- Tillsätt 2 ml flödescytometribuffert och tvätta cellerna 3x. Centrifugera cellerna efter varje tvättsteg vid 100 × g i 5 minuter.
- Tillsätt 2 ml fixeringsbuffert (1:1, 4% PFA och PBS). Resuspendera försiktigt hepatocyterna genom manuell skakning eller med en virvelblandare med låg hastighet (max 2-3) i 2 sekunder.
- Fixera cellerna i 30 minuter.
- Centrifugera vid 100 × g i ytterligare 5 minuter, kassera supernatanten och tillsätt flödescytometribuffert.
OBS: Celler kan lagras i flödescytometribuffert före analys upp till 72 timmar efter isolering.
10. Analysera hepatocyter med flödescytometri
- Analysera hepatocyterna med hjälp av en fluorescensaktiverad cellsorterare.
OBS: Tänk på den relativt stora storleken på hepatocyter och justera spänningarna. Börja med låg spänning och gå inte högre än 350 V för forward scatter (FSC) och 220 V för side scatter (SSC).- Justera spänningarna för FSC och SSC till den uppskattade stora storleken på cellerna. Identifiera hepatocytpopulationen och registrera alla händelser med SSC-A och FSC-A (figur 5A).
- Observera att skräp och icke-parenkymala celler visas i det nedre vänstra hörnet av FSC- kontra SSC-densitetsdiagrammet och utesluts (figur 5A).
- Eftersom dubblettceller kan påverka analysen, konstruera ett täthetsdiagram för sidospridningshöjd (SSC-H) kontra sidospridningsområde (SSC-A) för att utesluta dubbletter, som visas i figur 5B.
- Välj den slutliga hepatocytpopulationen genom att grinda CD31- (endotelmarkör) och CD45- (immunmarkör) celler (figur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
TRAS når sin topp vid 16 timmar efter hepatektomi och försvinner gradvis 32-48 timmar efter standardhepatektomi, men kvarstår efter 48 timmar efter förlängd hepatektomi. Makroskopiskt är TRAS lätt synlig som en blek hy av leverrester (figur 1F) och kan observeras hos hepatektomerade möss mellan 16 timmar och 48 timmar efter operationen.
Den uppskattade slutliga avkastningen är 10-15 × 10 6 hepatocyter efter 70% -hepatektomi och 4-9 × 106 efter förlängd 86% -hepatektomi hos möss, med en genomsnittlig slutlig livskraft på 78% respektive 65%. Detta motsvarar den förväntade procentsatsen jämfört med en total avkastning på 50-70 × 106 från en hel muslever (figur 6A,C). Efter partiella hepatektomier uppvisar hepatocyter en ökad cellstorlek jämfört med normala lever, vilket motsvarar deras ökade lipidinnehåll (figur 6B). Portstrategin visas i kompletterande figur S4.
Figur 6: Hepatocytutbyte, cellstorlek och viabilitet. (A) Cellantal i en hel muslever och i rester 24 timmar efter 70 % och 86 % hepatektomi. (B) Beräknad cellvolym av isolerade hepatocyter. Observera den markanta ökningen av cellstorleken 24 timmar efter hepatektomi, för både 70% och 86%. c) Cellviabiliteten hos isolerade hepatocyter efter varje steg i reningsprocessen. Viabiliteten mättes med flödescytometri med Alexa Fluor 488 Zombie green viability dye. Procentandelar tas från alla hepatocytsinglets. För grindstrategin, se kompletterande figur S6 och kompletterande figur S4. Felstaplar avser standardavvikelser med n = 6-8/grupp. Förkortningar: sHx = standard hepatektomi; eHx = förlängd hepatektomi; w / o resektion = skenkirurgi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Ett ökat lipidinnehåll i murina hepatocyter 24 timmar efter partiell hepatektomi kan observeras genom en ökning av granulariteten (figur 7; för grindstrategi, se kompletterande figur S5) eller direkt observeras genom närvaron av lipidvesiklar inuti förstorade hepatocyter (figur 8 och kompletterande fil 1).
Figur 7: Ökad granularitet och cellstorlek mätt med flödescytometri. (A) Ökad granularitet bland isolerade hepatocyter 24 timmar efter hepatektomi som en indirekt markör för närvaro av lipidvesiklar. b) Histogram som visar SSC. (C) Procentandelarna representerar fraktionen av celler med hög cytoplasmatisk granulär intensitet, mätt med SSC-signalen. Felstaplar avser standardavvikelser med n = 6-8/grupp. Förkortningar: sHx = standard hepatektomi; eHx = förlängd hepatektomi; w / o resektion = skenkirurgi; FSC = framåtriktad spridningssignal; SSC = sidospridning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Färgning av Sudan IV som markör för fetthalten i isolerade färska hepatocyter. (A) Hepatocyter från en färsk hel muslever utan föregående operation. Ökad storlek och fetthalt i hepatocyter 24 h (B) efter 70% -hepatektomi och (C) 86% -hepatektomi. Observera samtidig närvaro av både större, steatotiska hepatocyter och mindre, icke-steatotiska hepatocyter. Skalstänger = 30 μm (B-D). Felstaplar avser standardavvikelser med n = 6-8/grupp. Förkortningar: sHx = standard hepatektomi; eHx = förlängd hepatektomi; w / o resektion = skenkirurgi. Klicka här för att se en större version av denna figur.
En mycket låg andel immun- och icke-parenkymala celler finns kvar i den slutliga suspensionen. Ytterligare rening uppnås med FACS eller MACS, om så önskas. Negativt urval av CD31 + och CD45 + celler genom flödescytometri används för att demonstrera och kvantifiera de icke-parenkymala cellerna (figur 5).
Figur 5: Flödescytometri grindstrategi och urval av CD31- och CD45-parenkymala celler. (A) Gating diagram med alla händelser registrerade; Tänk på den relativt stora storleken på hepatocyter och använd justerade spänningar. Gå inte högre än 350 V för FSC och 220 V för SSC. (B) Singlet grind. (C) Hepatocyter väljs genom grindning av CD31- (endotelmarkör) och CD45- (immunmarkör) celler. Detta urval kan utföras i en fluorescensaktiverad cellsorterare för att välja parenkymala celler för ytterligare nedströmsanalyser, om det behövs; n = 4-5/grupp. Förkortningar: FSC = forward scatter; SSC = sidospridning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
För att demonstrera effekten av det modifierade protokollet för att behålla steatotiska celler isolerades hepatocyter med användning av den klassiska densitetsgradientmetoden7 (figur 9A). Till skillnad från den modifierade proceduren (figur 9B) var ett fettcellskikt tydligt synligt ovanpå densitetsgradienten. Analys av celler bekräftade en grov frånvaro av lipidbelastade hepatocyter i pelleten efter densitetsgradientcentrifugering. Däremot berikades celler från fettlagret med steatotiska hepatocyter och en betydande fraktion av icke-parenkymala och döda celler (figur 9A). Således berövar klassisk isolering skörden av steatotiska celler, medan detta modifierade protokoll som utelämnar densitetsgradienten behåller lipidbelastade subpopulationer, vilket möjliggör opartisk utforskning av leverregenerering utan att skeva mot magra hepatocyter.
Figur 9: Utbyten av steatotiska hepatocyter enligt det klassiska täthetsgradientisoleringsprotokollet jämfört med det förbättrade protokollet . (A) Med den klassiska reningsmetoden för densitetsgradient (slutlig koncentration av 90% densitetsgradientlösning i fosfatbuffrad saltlösning) samlas döda hepatocyter i ett cellskikt ovanpå densitetsgradientlösningen. (B) Detta skikt består inte bara av icke-parenkymala celler och icke-viabla hepatocyter utan också av livskraftiga, stora, feta hepatocyter. (C) Den pellet som erhålls efter densitetsgradientcentrifugering innehåller magra hepatocyter av mindre storlek och saknar mestadels steatotiska celler. Detta är den "rena" fraktionen som isoleras med det klassiska protokollet. (D) Med det förbättrade protokollet förloras inte de lipidfyllda hepatocyterna och alla hepatocyter pelleteras. Supernatanten (E) består mestadels av döda och fragmenterade hepatocyter och icke-parenkymala celler, medan pelleten (F) är en blandning av hepatocyter av varierande storlek och lipidinnehåll. Skalstreck = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande fil 1: Tilläggsprotokoll. a) Lipidfärgning med Sudan IV. b) standardiserad och förlängd hepatektomi hos möss. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S1: Översikt över perfusionsinställningen. (1) Kanylera den sämre vena cava. (2) Perfusera levern med varm perfusionsbuffert till kelat kalcium. (3) Värm digestionsbufferten med kollagenaser och Ca2+ för att dissociera celler in vivo. Ta bort levern och (4) förvara i iskall konserveringsbuffert (max 30 min). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Perfusionsinställning. (A) Perfusionsbord med isofluranmunstycke, värmelampa med rött ljus och perfusionsrör. Ett tungt föremål kan placeras under röret för att stabilisera det och minska risken för förskjutning. (B) Under de första minuterna av perfusionen kommer en del blod att strömma ut genom portvenen och poolen i den öppna bukhålan. (C) Bukväggen skärs på ena sidan för att dränera blodet. En bomullspinne underlättar dräneringen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S3: Glissons kapsel. (A) Glissons kapsel är sprucken med pincett med fin spets på några ställen längs leverytan, och levercellerna frigörs genom att försiktigt skaka kapseln. (B) Levern ska lätt rivas isär. (C) Den tomma leversäcken (Glissons kapsel) med frisatta hepatocyter i suspension. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S4: Flödescytometri gating strategi för viabilitet screening. (A) Alla händelser registrerades. (B) Singlet grind. (C) Levande / död färgning med Alexa Fluor 488 Zombie grön livskraft färgämne. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S5: Flödescytometri grindstrategi för granularitetsmätning. (A) Alla händelser registrerades. (B) Singlet grind. c) Punktdiagram över sidospridning (SSC; x-axeln ) kontra framåtspridning (FSC; y-axeln ) för att analysera kornighetsnivåerna. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S6: Hepatocytrening. a) Cellpellet efter det första centrifugeringssteget. Notera fettlagret ovanpå mediet. b) Hepatocytpelleten efter den andra centrifugeringsomgången. c) Renade hepatocyter i slutet av reningsprocessen. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det publicerade protokollet ger en tillförlitlig och enkel metod för att isolera ett högt utbyte av normala och steatotiska murina hepatocyter för encellsanalyser nedströms eller bulkanalys av celler efter FACS-sortering. Den distinkta fördelen jämfört med densitetsgradientrening är att det cellulära lipidinnehållet i huvudsak inte har någon inverkan på det effektiva utbytet av hepatocyter. Således kommer fraktionen av steatotiska hepatocyter att behållas och inkluderas i nedströmsanalyser. Detta är inte bara avgörande för studier av steatogena leversjukdomar utan också avgörande för alla analyser av processer efter stora hepatektomi, där hepatocyter uppvisar en tidsmässigt och rumsligt dynamisk steatos inom de första 2-3 dagarna av regenerering. Även om (encelliga) analyser av isolerade hepatocyter redan har utförts efter hepatektomi 19,20,21, måste det antas att den analyserade cellpopulationen åtminstone delvis berövades lipidbelastade hepatocyter och resultaten var därför inte helt representativa och snedställda mot magra hepatocyter.
För närvarande är TRAS funktion inte helt klarlagd. Till exempel är de rumsliga skillnaderna i lipidinnehåll i leverlobuler fortfarande dåligt förstådda. Därför behövs en metod som möjliggör kvantitativ och kvalitativ detektion utan att exakt utesluta dessa celler från analyser (t.ex. för encellstranskriptomik, flödescytometri och metabolomik).
Sammantaget är hepatocytutbytet med detta förbättrade protokoll markant överlägset andra metoder för isolering av fettinnehållande hepatocyter (t.ex. från möss med alkoholfri steatohepatit, NASH) med användning av densitetsgradientrening15. Cellutbyte, livskraft och fettinnehåll kan dock variera mellan preparat. Flera faktorer verkar vara ansvariga.
För det första kommer olika satser av kollagenas eller kollagenasblandningar att variera i sin enzymatiska aktivitet; Skillnaderna mellan partier är dock inte lika kritiska som med traditionella kollagenaser. Det kan dock vara nödvändigt att justera arbetskoncentrationen. Skillnaderna kan minimeras ytterligare genom korrekt förvaring fram till användning (torra frystorkade pulver och rehydrerade stamlösningar vid -15 till -25 °C) och genom att undvika upprepade frys-tö-cykler, men kan inte elimineras helt. Därför rekommenderas att endast kollagenaser av en specifik sats används för en given experimentell serie. Dessutom beror den enzymatiska aktiviteten på den temperatur vid vilken digestionsbufferten når levern, med en optimal temperatur mellan 35 °C och 37 °C för en blandning av kollagenaser I och II22. Lägre temperaturer minskar den enzymatiska aktiviteten, medan temperaturer över 50 °C kan leda till irreversibel denaturering av proteinet. Testa detta i förväg och optimera experimentella förhållanden genom att justera den ursprungliga temperaturen på rötningsbufferten, plaströrets längd och diameter och flödeshastigheten. Till exempel kan en sänkning av bufferttemperaturen på upp till 10 °C inom en rörlängd på 60 cm förväntas. Korrigera temperaturen genom att använda värmedynor och infraröda lampor, om det behövs. Kollagenaser visar sin optimala matsmältningskapacitet vid ett pH av 7,4; Därför rekommenderas att buffertlösningarnas pH justeras redan vid en arbetstemperatur på cirka 37 °C före användning.
För det andra är det av största vikt att spola levern (eller hela musen) tillräckligt med perfusionsbuffert innan matsmältningsprocessen påbörjas för att eliminera potentiella hämmare såsom serum eller albumin. Helst startas perfusion först efter att den systemiska cirkulationen har stoppats, för att säkerställa att matsmältningsbufferten endast rör sig från vena cava genom levern till utflödet via den öppnade portalvenen. Den överlägsna vena cava kan stängas med en liten vaskulär klämma. Detta förhindrar kontakt med kvarvarande blodkomponenter/hämmare. En annan metod för optimal spolning av levern är intermittent klämning av portalvenen. Detta bör göras noggrant och - när matsmältningsbufferten har nått levern - utförs endast en gång för att undvika att skada de redan smälta cellerna.
För det tredje är regenererande hepatocyter känsliga, och erfarenheten har visat att de kräver kortare matsmältningstider och mer noggrann hantering för att undvika översmältning och skada på cellerna. För att skörda levern så försiktigt som möjligt rekommenderas att ta tag i leverhilusen med en klämma och sedan först skära den överlägsna vena cava och frigöra levern från anslutningarna till venen och membranet. Därefter kan den sämre vena cava och portalvenen skäras, vilket möjliggör mobilisering av levern och frigör den lätt från gastrointestinala ligament, matstrupen på ena sidan och höger njure på andra sidan. Hos hepatektomerade möss är det möjligt att försiktigt ta tag i en av ligaturerna från medianloberna för att ta bort levern. Om ett försök görs att dra ut levern med våld kan Glissons kapsel brista och de isolerade cellerna kan gå vilse.
Slutligen är det viktigt att perfusionsförfarandet och vidare bearbetning av hepatocyterna inte avbryts eller försenas, eftersom detta omedelbart och oundvikligen kommer att påverka livskraften. Helst utförs perfusionen i ett team på minst två personer och på ett djur i taget. Dessa krav i tid och arbetskraft är dock en av begränsningarna med denna metod, även om detta också gäller alternativa metoder.
En annan begränsning är den slutliga renheten hos den resulterande cellsuspensionen, eftersom fördelen med att inte förlora steatotiska hepatocyter till en densitetsgradient resulterar i en liten andel återstående icke-parenkymala och / eller immunceller. I det visade provet är fraktionen av CD45 + (immunceller) och CD31 + (endotelceller) under 5%, och vid val av cellstorlek först under flödescytometri är procentandelarna av CD45 + och CD31 + 1,2% respektive 2,2% (figur 5). För de flesta tillämpningar är denna renhetsgrad tillräcklig, men mycket känsliga metoder eller vidare användning i primära cellkulturer kräver förmodligen en högre grad. Många studier har använt CD31 och CD45 som systemiska markörer för att sortera levercellpopulationer med MACS 23,24 eller FACS25.
Denna förbättrade isoleringsmetod är idealisk för studier av leverregenerering, särskilt den tidiga perioden som presenterar betydande mängder steatotiska hepatocyter. PHLF, med ihållande steatos, är ett särskilt relevant ämne som kräver forskning. Efter förlängda hepatektomier som lämnar efter sig marginella rester kan PHLF utvecklas och utgör faktiskt den vanligaste dödsorsaken på grund av leverkirurgi. Dess patobiologi är endast delvis förstådd, och för närvarande finns ingen behandling tillgänglig26. Med tanke på att PHLF avsevärt begränsar tillämpningen av leverkirurgi (t.ex. för att bota levermaligniteter) är det ett tydligt medicinskt behov att utforska dess orsaker och identifiera potentiella åtgärder.
Behov finns också av studier av sjukdomar som har leverstatos som utgångspunkt. Ett framträdande exempel är alkoholfri fettleversjukdom (NAFLD), som kan utvecklas till NASH och så småningom till hepatocellulärt karcinom (HCC)27. Spridningen av stillasittande livsstil i samband med den västerländska kosten har lett till en världsomspännande epidemi av NAFLD, och följaktligen beräknas HCC-incidensen öka28,29. Steatos är i sin tur också tätt kopplad till fetma, det metabola syndromet och typ 2-diabetes, alla sjukdomar med en ökande förekomst30. Därför utgör steatos en ökande börda för det nuvarande hälso- och sjukvårdssystemet, vilket kräver effektiva medel för dess hantering. Denna förbättrade tvåstegs kollagenasperfusionsmetod möjliggör studier av steatotiska hepatocyter på encellsnivå och bör därför hjälpa till att utforska orsakerna och konsekvenserna av hepatocellulär lipidackumulering.
Detta protokoll presenterar en enkel, snabb och pålitlig teknik för in vivo-isolering av regenererande hepatocyter från möss efter partiell (70%) och förlängd (86%) hepatektomi. Detta tillvägagångssätt är inte beroende av gradientrening och kan användas för att undersöka leverregenereringsprocesser med inkludering av lipidbelastade hepatocyter som vanligtvis förloras under traditionella isoleringsprotokoll. Dessutom kan denna metod också tillämpas för forskning av olika leversjukdomar i samband med steatotiska förändringar och är inte begränsad till musarten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av Swiss National Fond (projektbidrag 310030_189262).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 488 Zombie green | BioLegend | 423111 | Amine-reactive viability dye |
| Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9% | Provet AG | QN01AB06 | CAUTION: needs ventilation |
| EDTA solution | Sigma-Aldrich | E8008-100ML | - |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | V001229 | Dilute with water to 70% |
| Fetal bovine serum (FCS) | Gibco | A5256701 | - |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS), Ca2+, Mg2+, phenol red | Sigma-Aldrich | H9269-6x600ML | For digestion/preservation |
| Hanks' Balanced Salt solution (HBSS), w/o Ca2+, w/o Mg2+, no phenol red | Sigma-Aldrich | H6648-6x500ML | For perfusion buffer |
| HEPES solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 83264-100ML-F | - |
| Histoacryl tissue adhesive (butyl-2-cyanoacrylate) | B. Braun | 1050052 | For stabilization of cannulation site |
| Hoechst 33258 Staining Dye Solution | Abcam | ab228550 | - |
| Liberase Research Grade | Roche | 5401119001 | Lyophilized collagenases I/II |
| NaCl 0.9% 500 mL Ecotainer | B. Braun | 123 | - |
| Paralube Vet Ointment | Dechra | 17033-211-38 | - |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | A1286301 | - |
| Sudan IV – Lipid staining | Sigma-Aldrich | V001423 | - |
| Temgesic (Buprenorphine hydrochloride), Solution for Injection 0.3 mg/mL | Indivior Europe Ltd. | 345928 | Narcotics. Store securely. |
| Trypan blue, 0.4%, sterile-filtered | Sigma-Aldrich | T8154 | For cell counting |
| Williams’ Medium E | Sigma-Aldrich | W4128-500ML | - |
| Materials | |||
| 25 mL serological pipette, Greiner Cellstar | Merck | P7865 | - |
| 50 mL Falcon tubes | TPP | - | - |
| BD Neoflon, Pro IV Catheter 26 G | BD Falcon | 391349 | - |
| Cell scraper, rotating blade width 25 mm | TPP | 99004 | - |
| Falcon Cell Strainer 100 µm Nylon | BD Falcon | 352360 | - |
| Fenestrated sterile surgical drape | - | - | Reusable cloth material |
| Filling nozzle for size 16# tubing (ID 3.1 mm) | Drifton | FILLINGNOZZLE#16 | To go into the tubes |
| Flow cytometry tubes, 5 mL | BD Falcon | 352008 | - |
| Male Luer to Barb, Tubing ID 3.2 mm | Drifton | LM41 | Connection tube to syringe |
| Petri dishes, 96 x 21 mm | TPP | 93100 | - |
| Prolene 5-0 | Ethicon | 8614H | To retract the sternum |
| Prolene 6-0 | Ethicon | 8695H | For skin suture |
| Prolene 8-0 | Ethicon | EH7470E | Ligature gall bladder |
| Tube 16#, WT 1.6 mm, ID 3.2 mm, OD 6.4 mm | Drifton | SC0374T | Perfusion tube |
| Equipment | |||
| BD LSRFortessa Cell Analyzer Flow Cytometer | BD | - | - |
| Isis rodent shaver | Aesculap | GT421 | - |
| Isofluran station | Provet | - | - |
| Low-speed centrifuge – Scanspeed 416 | Labogene | - | - |
| Neubauer-improved counting chamber | Marienfeld | - | - |
| Oxygen concentrator – EverFlo | Philips | 1020007 | 0 – 5 L/min |
| Pipetboy – Pipettor Turbo-Fix | TPP | 94700 | - |
| Shenchen perfusion pump – YZ1515x | Shenchen | YZ1515x | - |
| Surgical microscope – SZX9 | Olympus | - | - |
| ThermoLux warming mat | Thermo Lux | - | - |
| Vortex Genie 2, 2700 UpM | NeoLab | 7-0092 | - |
| Water bath – Precision GP 02 | Thermo scientific | - | Adjust to 42 °C |
References
- Higgins, G., Anderson, R. Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal. Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C.
- Lehmann, K., et al. Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration. Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).
- Makino, H., et al. A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice. Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).
- Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N. Liver Pathology. Gayam, V., Engin, O. , IntechOpen. (2019).
- Charni-Natan, M., Goldstein, I. Protocol for primary mouse hepatocyte isolation. STAR Protocols. 1 (2), 100086 (2020).
- Smedsrød, B., Pertoft, H. Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence. Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).
- Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers. Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).
- Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
- Seglen, P. O. Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver. Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).
- Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).
- Trotter, N. L. A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy. Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).
- Kachaylo, E., et al. PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice. Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).
- Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease. STAR Protocols. 1 (3), 100222 (2020).
- Dold, S., et al. Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation. PLoS One. 10 (11), 0141877 (2015).
- Boyce, S., Harrison, D. A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse. Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).
- Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration. JCI Insight. 5 (22), (2020).
- Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver. Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).
- Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation. Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).
- Roche, Liberase TM Research Grade. , (2020).
- Giugliano, S., et al. Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication. Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).
- Shetty, S., et al. Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium. The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).
- Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes. Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).
- Helling, T. S. Liver failure following partial hepatectomy. HPB. 8 (3), 165-174 (2006).
- Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F.
- Park, W. Y., et al. Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study. Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).
- Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude. Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).
- Roeb, E. Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD). Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).
