Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Gelijktijdige beoordeling van verwantschap, delingsgetal en fenotype via flowcytometrie voor hematopoëtische stam- en voorlopercellen

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64918
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4, 1, 2, 1
1Quantitative Immuno-hematology, CNRS UMR168, Institut Curie, 2Hamilton Institute, Maynooth University, 3Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3348, Orsay, 4Université Paris-Sud, Université Paris-Saclay, CNRS UMR 3348, Orsay

Summary

Hier wordt een op flowcytometrie gebaseerde techniek gepresenteerd die het mogelijk maakt om tegelijkertijd het aantal celdelingen, het fenotype van de oppervlaktecel en de cellulaire verwantschap te meten. Die eigenschappen kunnen statistisch worden getest met behulp van een op permutatie gebaseerd raamwerk.

Abstract

Weinig technieken kunnen fenotype en lot voor dezelfde cel tegelijkertijd beoordelen. De meeste van de huidige protocollen die worden gebruikt om het fenotype te karakteriseren, hoewel ze in staat zijn om grote datasets te genereren, vereisen de vernietiging van de cel van belang, waardoor het onmogelijk is om het functionele lot ervan te beoordelen. Heterogene biologische differentiërende systemen zoals hematopoiese zijn daarom moeilijk te beschrijven. Voortbouwend op celdelingsvolgkleurstoffen hebben we verder een protocol ontwikkeld om tegelijkertijd verwantschap, delingsaantal en differentiatiestatus te bepalen voor veel enkelvoudige hematopoietische voorlopers. Dit protocol maakt de beoordeling mogelijk van het ex vivo differentiatiepotentieel van muizen en menselijke hematopoëtische voorlopercellen, geïsoleerd uit verschillende biologische bronnen. Bovendien, omdat het gebaseerd is op flowcytometrie en een beperkt aantal reagentia, kan het snel een grote hoeveelheid gegevens genereren, op het niveau van één cel, op een relatief goedkope manier. We bieden ook de analytische pijplijn voor eencellige analyse, gecombineerd met een robuust statistisch kader. Omdat dit protocol de koppeling van celdeling en differentiatie op eencellig niveau mogelijk maakt, kan het worden gebruikt om symmetrische en asymmetrische lotsverbintenis, de balans tussen zelfvernieuwing en differentiatie en het aantal delingen voor een bepaald lot kwantitatief te beoordelen. Al met al kan dit protocol worden gebruikt in experimentele ontwerpen die gericht zijn op het ontrafelen van de biologische verschillen tussen hematopoietische voorlopers, vanuit een eencellig perspectief.

Introduction

Het afgelopen decennium werd gekenmerkt door de wereldwijde verspreiding van eencellige benaderingen van cellulaire en moleculaire biologie. In navolging van de single-cell genomics1,2 is het tegenwoordig mogelijk om veel componenten van een enkele cel (bijv. DNA, RNA, eiwitten) te bestuderen, met nieuwe single cell -omics-technieken die elk jaar ontluiken. Deze technieken hebben licht geworpen op oude en nieuwe vragen op het gebied van immunologie, neurobiologie, oncologie en andere, zowel met behulp van menselijke als modelorganismecellen3. Door de verschillen tussen individuele cellen te benadrukken, leidde single cell -omics tot de definitie van een nieuw model van hematopoiese, gericht op de heterogeniteit van hematopoietische stam- en voorlopercellen (HSPC's) en weg van het klassieke model van discrete homogene populaties 4,5.

Een van de weinige nadelen van alle -omics-technieken is de vernietiging van de cel van belang, waardoor de mogelijkheid om de functionaliteit ervan te beoordelen wordt uitgesloten. Omgekeerd bieden andere eencellige methoden, zoals eencellige transplantatietest en afstammingstraceringstechnologieën, een uitlezing van de functionaliteit van de vooroudercel door het lot van individuele cellen in vivote beoordelen 6,7. Lineage tracing-technologieën omvatten het labelen van de cel van belang met een erfelijke genetische7 of een fluorescerend label8,9, waardoor het lot van meerdere afzonderlijke cellen tegelijkertijd kan worden gevolgd. De karakterisering van de startcellen is echter meestal beperkt tot een beperkt aantal parameters, zoals de expressie van enkele oppervlakte-eiwitten beoordeeld door flowcytometrie10. Bovendien vereisen single-cell lineage tracing-technologieën een moeizame detectie van het cellulaire label, meestal via DNA / RNA-sequencing of beeldvorming. Met name dit laatste punt beperkt het aantal omstandigheden dat in één experiment kan worden getest.

Een andere klasse van methoden die worden gebruikt om de functionaliteit van afzonderlijke cellen te bestuderen, zijn ex vivo celkweeksystemen van enkele HSPC's. Eenvoudig uit te voeren, deze gouden standaardtests omvatten het sorteren van individuele cellen in 96-wells celkweekvaten en na kweek, waarbij het fenotype van het celnageslacht wordt gekarakteriseerd, meestal door flowcytometrie of morfologische analyse. Deze testen zijn meestal gebruikt om de langetermijndifferentiatie van HSPC's in volwassen cellen te karakteriseren, meestal na 2-3 weken kweek11,12. Als alternatief zijn ze gebruikt om te proberen ex vivo HSPC's 13,14,15,16,17,18 te behouden en uit te breiden, met de belofte van medisch voordeel voor menselijke stamceltransplantatie 19. Ten slotte zijn ze gebruikt om de vroege inzet van HSPC's te bestuderen met behulp van kortetermijncultuur20, waarbij het lage aantal cellen dat in deze cultuur wordt gegenereerd de belangrijkste beperkende factor is. Een nadeel van deze verschillende soorten ex vivo assays is dat ze slechts gedeeltelijk de in vivo complexiteit weerspiegelen; toch zijn ze een van de zeldzame manieren om menselijke HSPC-differentiatie te bestuderen.

Een ontbrekend stukje informatie van bestaande eencellige methoden (single cell-omics, lineage tracing en ex vivo cultuur) is de nauwkeurige detectie van celdelingen, een essentiële parameter om te overwegen bij het bestuderen van HSPC dynamics21. Een eenvoudige manier om het aantal delingen via flowcytometrie te beoordelen is het gebruik van oplosbare "eiwitkleurstoffen", zoals de 5-(en 6)-carboxyfluoresceïnediacetaat succinimidylester (CFSE)22. Deze delingskleurstoffen diffunderen in het cytoplasma van de gekleurde cellen en worden met de helft verdund en bij elke celdeling doorgegeven aan de twee dochtercellen, waardoor tot 10 delingen kunnen worden opgesomd. Door verschillende divisiekleurstoffen te combineren, is het mogelijk om meerdere individuele voorlopers in dezelfde put te zaaien, omdat elke individuele kleurstof scheiding van de verschillende afstammelingen mogelijk maakt. Dit is het principe achter het gebruik van celkleurstoffen voor multiplex klonale en delingstracking dat voor het eerst werd geïntroduceerd voor muriene lymfocyten23,24.

Hier presenteren we de ontwikkeling van de MultiGen-test voor gebruik met murine en menselijke HSPC's. Het maakt het mogelijk om veel afzonderlijke cellen tegelijkertijd te testen op hun eigenschappen van differentiatie, deling en verwantschap ex vivo. Deze high-throughput, eenvoudig uit te voeren en goedkope test maakt het mogelijk om het cellulaire fenotype, het aantal uitgevoerde delingen en de celverwantschap en klonale relatie met de andere cellen in de put te meten, allemaal tegelijkertijd. Het kan worden gebruikt om symmetrische en asymmetrische lotsverbintenis, de balans tussen zelfvernieuwing en differentiatie en het aantal divisies dat nodig is voor een bepaald lot van het lot van een verbintenis kwantitatief te beoordelen. Het protocol vereist een fluorescentie geactiveerde cel sorteerder (FACS) en een flowcytometer met een plaatlezer, plus de apparatuur die nodig is om celkweek uit te voeren. Naast het technische protocol voor de uitvoering van de test op menselijke HSPC's, bieden we ook het gedetailleerde analysekader, inclusief de statistische tests die nodig zijn om cellulaire eigenschappen met betrekking tot het concept van celfamilie25 te beoordelen. Dit protocol is al met succes gebruikt om het murine HSPC-compartiment26,27 te beschrijven.

Het volgende protocol gebruikt magnetisch verrijkte CD34+ cellen als uitgangsmateriaal28. Op deze manier is het mogelijk om de menselijke HSPC's efficiënt te kleuren en te isoleren van verschillende bloedbronnen (bijv. Navelstrengbloed, beenmerg, perifeer bloed). Het is belangrijk om de CD34-fractie niet weg te gooien, omdat deze als onderdeel van het protocol zal worden gebruikt om verschillende soorten experimentele controles in te stellen. De genoemde celhoeveelheden en -volumes kunnen omhoog of omlaag worden geschaald, afhankelijk van de experimentele workflow en benodigdheden. Op dezelfde manier kan het protocol worden aangepast aan de studie van verschillende soorten voorlopercellen, simpelweg door de antilichamen te wijzigen die worden gebruikt voor de celsortering en flowcytometriestappen.

Protocol

Voor het volgende protocol werd gedeïdentificeerd navelstrengbloed gebruikt als HSPC-bron en verzameld in overeenstemming met de richtlijnen die zijn gedefinieerd door de biobank van het Navelstrengbloed van het Saint-Louis Hospital (autorisatie AC-2016-2759) en met de Verklaring van Helsinki.

OPMERKING: Voordat u begint, moet u ervoor zorgen dat alle reagentia en apparatuur die nodig zijn voor dit protocol beschikbaar zijn, zoals vermeld in de materiaaltabel en vermeld in het protocol. Bereid de betreffende reagentia vers en bewaar ze niet, tenzij uitdrukkelijk vermeld.

1. Celkleuring

OPMERKING: Deze sectie beschrijft kleuring met vier combinaties van CFSE en violette kleurstof (CTV) celdelingskleurstoffen. Verwerk alle buizen tegelijkertijd, zelfs als er geen celkleurstofoplossing is toegevoegd. Alle stappen worden uitgevoerd in steriele omstandigheden om de volgende celkweekstap mogelijk te maken. Benodigde tijd: ongeveer 100 min.

  1. Verwerk de navelstrengbloedeenheid volgens een magnetisch sorteerprotocol29. Zorg ervoor dat er twee fracties beschikbaar zijn: een grote CD34-fractie en een kleinere CD34+-fractie. Draai beide buizen gedurende 5 minuten op 300 x g. Zuig het supernatant aan zonder de pellet te verstoren.
  2. Voor de CD34+ fractie, resuspensie in 1 ml van Dulbecco's gemodificeerde Eagle medium (DMEM) zonder foetaal runderserum (FBS). Tel de cellen met behulp van een hemocytometer; de celdichtheid mag niet hoger zijn dan 3 x 106 cellen/ml. Als dit het geval is, past u het volume dienovereenkomstig aan. Voor de CD34-fractie, resuspendien in DMEM zonder FBS en stel het volume in op maximaal 6 x 106 cellen/ml.
  3. Aliquot 250 μL van de CD34+ fractie in vier 15 ml polypropyleen buizen. Label de buizen als volgt: CD34+/CF (CFSE_only), CD34+/CV (CFSE_high CTV_low), CD34+/VC (CFSE_low CTV_high) en CD34+/VI (CTV_high). Aliquot 250 μL van de CD34-fractie in nog eens vier 15 ml polypropyleen buizen. Label de buizen als volgt: CD34-/CF (CFSE_only), CD34-/CV (CFSE_high CTV_low), CD34-/VC (CFSE_low CTV_high) en CD34-/VI (CTV_high). De resterende cellen van de CD34-fractie kunnen worden weggegooid.
  4. Bereid twee CFSE-oplossingen voor, genaamd CFSE_high en CFSE_low. Meng voor CFSE_high (10 μM) 1,1 ml DMEM zonder FBS met 2,2 μl CFSE-stockoplossing (5 mM). Meng voor CFSE_low (5 μM) 550 μL DMEM zonder FBS en 0,55 μL CFSE-stockoplossing (5 mM).
  5. Voeg 250 μL van de CFSE_high oplossing toe aan de CF- en CV-buizen, 250 μL van de CFSE_low-oplossing aan de VC-buizen en 250 μL DMEM zonder FBS aan de VI-buis. Om een efficiënte mix van celsuspensie en celkleurstof te garanderen, kantelt u de buis bijna 90 graden en deponeert u de CFSE-oplossingen op de buiswand. Houd vervolgens de buis verticaal om de twee oplossingen te mengen en pipetteer drie of vier keer om een snelle menging van de CFSE-oplossingen met de geresuspendeerde cellen te garanderen. Incubeer bij 37 °C gedurende precies 8 minuten.
  6. Voeg na de incubatie 5 ml DMEM + 10% FBS toe. Houd de buisjes gedurende 5 minuten op 37 °C.
  7. Draai de buizen 5 minuten op 300 x g. Verwijder het supernatant via aspiratie zonder de pellet te verstoren en was de pellet met 5 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing 1x/ethyleendiaminetetra-azijnzuur (PBS 1x/EDTA). Draai opnieuw gedurende 5 minuten op 300 x g. Gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren en resuspensie van de celkorrel in 250 μL 1x PBS/EDTA.
  8. Bereid twee CTV-oplossingen voor, genaamd CTV_high en CTV_low. Meng voor CTV_high (10 μM) 1,1 ml PBS 1x/EDTA en 2,2 μL CTV-voorraad (5 mM). Meng voor CTV_low (5 μM) 550 μL PBS 1x/EDTA met 0,55 μL CTV-voorraad (5 mM).
  9. Voeg 250 μL van de CTV_high oplossing toe aan de VC- en VI-buis, 250 μL van de CTV_low-oplossing aan de CV-buis en 250 μL 1x PBS/EDTA aan de CF-buis. Gebruik dezelfde techniek als beschreven in stap 1.5. Incubeer bij 37 °C gedurende precies 8 minuten.
  10. Voeg na de incubatie 5 ml DMEM + 10% FBS toe. Bewaren bij 37 °C gedurende 5 min.
  11. Draai de buisjes 5 minuten op 300 x g, gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren en was de pellet vervolgens met 5 ml 1x PBS / EDTA. Draai opnieuw gedurende 5 minuten op 300 x g.
  12. Gooi het supernatant weg zonder de pellet te verstoren en resuspensie van de CD34-fracties in 1x PBS/EDTA voor een eindconcentratie van 1,5 x 106 cellen/ml. Resuspendeer de CD34+ fracties in 40 μL kleuringsbuffer en breng de cellen over in buisjes van 1,5 ml.

2. Antilichaamkleuring

OPMERKING: Antilichaamkleuring kan worden aangepast aan de experimentele behoeften. Alleen de CD34+ fracties ondergaan antilichaamkleuring; de CD34-fracties worden gebruikt als een enkele kleuringscontrole voor de celdelingskleurstofcombinaties (CV-, VC-, CF- en VI-fracties). Het volgende paneel is op maat gemaakt voor de detectie van vier soorten HSPC's: hematopoietische stamcellen (HSC's), multipotente voorlopercellen (MPP's), lymfoïde-geprimeerde multipotente voorlopercellen (LMPP's) en hematopoietische voorlopercellen (HPC's)12. Er wordt echter een identificatie van HSC's en MPP's gepresenteerd. Benodigde tijd: 75 min.

  1. Bereid de enkele kleuring voor op oppervlaktekleuring, met behulp van compensatieparels. Meng negatieve kralen en Immunoglobuline G (IgG) kralen in een verhouding van 1:1, voor een totaal volume gelijk aan 20 μL x het aantal oppervlaktemarkers (bijv. 120 μL als het kleuringspaneel zes antilichamen bevat).
  2. Verzend 20 μL kralen in afzonderlijke buisjes van 1,5 ml voor elke marker. Voeg het volume toe dat overeenkomt met de verdunningsfactor voor elk antilichaam in de overeenkomstige buis (als de verdunningsfactor bijvoorbeeld 1:20 is, voeg dan 1 μl toe).
  3. Om de CD34+ cellen te kleuren, bereidt u een mastermix van antilichamen12 voor, gebaseerd op tabel 1. Meng de antilichamen in een enkele buis van 0,5 ml. Voeg 7 μL uit de antilichaammastermix toe aan elk van de vier CD34+-condities.
  4. Incubeer de compensatieparels en de CD34+ monsters bij 4°C gedurende ten minste 30 minuten.
    OPMERKING: De incubatietijd moet worden aangepast aan de technische details van de antilichamen die voor kleuring worden gebruikt.
  5. Bereid tijdens de incubatie de 96-puts ronde bodemplaat voor die moet worden gebruikt voor het sorteren, waarbij 100 μL celkweekmedium aan elke put wordt toegevoegd met behulp van een meerkanaalspipet.
    OPMERKING: Laat putjes H8-H12 leeg.
  6. Label 5 ml polypropyleenbuizen voor de oppervlaktekleuringscontroles (5, met behulp van kralen), de celdelingskleurstofcontroles (4, met behulp van de CD34-fracties) en de CD34+ monsters (4).
  7. Was aan het einde van de incubatie de cellen en kralen met 1 ml kleurbuffer. Breng het totale volume over naar de polypropyleenbuizen van 5 ml. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten op 300 x g en streef vervolgens naar het supernatant zonder de pellet te verstoren.
  8. Resuspendeer de cellen in kleurbuffer, met elk ongeveer 500 μL voor de kralen en CD34+ cellen, en 1 ml voor de CD34-buizen.

Tabel 1: Sjabloon om de antilichaammastermix voor te bereiden op een celsorteerexperiment. Klik hier om deze tabel te downloaden.

3. Celsortering

OPMERKING: De gesorteerde celnummers kunnen variëren afhankelijk van het totale aantal beschikbare cellen. In het protocol wordt een minimum celnummer voor elk besturingselement gegeven. Benodigde tijd (voor een enkele plaat): 100 min.

  1. Open het sjabloonexperiment of stel een nieuw experiment in. Maak een enkel monster en meerdere buizen, één per voorwaarde.
  2. Stel de gating-strategie in die in figuur 1 wordt beschreven en maak zes stippenplotdiagrammen. Visualiseer eerst de cellen op een FSC-A/SSC-A dot plot en dubbelklik op de polygon gating tool om een populatie met lage side scatter te selecteren (Figuur 1A). Klik in de volgende dot plot (FSC-A / FSC-H) met de rechtermuisknop op de plot en selecteer de gate "Cells" in het vervolgkeuzemenu door erop te klikken. Gebruik hetzelfde gatinggereedschap om een strakke populatie te selecteren op de diagonaal tussen de twee assen (figuur 1B).
  3. Geef in de derde dot plot (APC vs. FSH-H) de populatie "Single Cells" weer en gate de cellen negatief voor de expressie van APC Lineage (Lin) (Figuur 1C). Geef in het vierde diagram (CFSE vs. CTV) de populatie "Lin-" weer en maak vier gescheiden poorten, één voor elke kleurstofcombinatie (figuur 1D).
    OPMERKING: Deze poorten moeten strak zijn om slechts een klein deel van homogeen gekleurde cellen te selecteren.
  4. Gebruik de vijfde en zesde plot (APC-Cy7 vs. BV650 en PE-Cy7 vs. PE) om de voorlopers van belang te identificeren. Sluit royaal de CD34+CD38-populatie en de CD34+CD38+ af in het vijfde plot (Figuur 1E). Selecteer vervolgens de CD34 + CD38-populatie in het zesde plot en teken drie poorten, volgens figuur 1F.
  5. Voer de enkele kleurbuizen met de compensatieparels uit en klik op de knop Verwerven . Pas de pmt-spanningen (fotomultiplicatorbuis) aan in het vervolgkeuzemenu Parameters , met name voor de kleurstoffen voor celdeling (tussen 104 en 105 op een biexponentiële schaal).
  6. Verfijn de compensatiematrix op basis van het deelvenster dat wordt gebruikt voor het sorteren, met behulp van het tabblad Compensatie . Neem ten minste 5.000 gebeurtenissen op in de kralenpoort en klik op de knop Opnemen .
  7. Voer de CD34-fracties uit en controleer de compensatiematrix opnieuw. Registreer ten minste 10.000 gebeurtenissen in de eencellige poort.
  8. Voer de CD34+ fracties uit en registreer ten minste 5.000 gebeurtenissen in de single-cell gate. Pas de poort aan voor elke kleurstofcombinatie en stel een strakke poort in om een homogene populatie te selecteren (figuur 1D). Pas op dezelfde manier de gating aan voor het selecteren van HSC's en MPP's.
  9. Zodra de analyse is voltooid en alle buizen zijn geregistreerd, plaatst u de plaat in de juiste houder, na het uitvoeren van de standaard Aria-kalibratie voor sortering op platen met 96 putten. Het koelen van de plaat wordt aanbevolen.
  10. Bereid de plaatsorteersjabloon voor volgens het schema in tabel 2, met behulp van de sorteerlay-out van het experiment. De putten met de naam "CD34-" bevatten 5.000-10.000 cellen, gesorteerd op de CF/CV/VC/VI poort. De "Bulk" putten bevatten minstens 500 cellen, gesorteerd op de gate CD34+CD38-. Ten slotte bevatten de eencellige putjes slechts één gebeurtenis per celdelingskleurstofcombinatie per put, dus vier gebeurtenissen per put in totaal.
    OPMERKING: De "Bulk"-populaties kunnen worden aangepast aan de subgroep van specifieke voorlopercellen; Sorteer niet minder dan 500 cellen.
  11. Ga voor het sorteren in volgorde te werk en voltooi elke celdelingskleurstofcombinatie voordat u naar de volgende gaat. Begin bijvoorbeeld met het sorteren van de CD34-CF, in de opbrengstzuiverheidsmodus. Klik op de knop Verkrijgen en vervolgens op de knop Sorteren.
  12. Plaats aan het einde van de CD34-sortering de CF CD34+ buis. Verwerven, klik vervolgens op de sorteerknop en zorg ervoor dat u 0/16/0 hebt aangevinkt als zuiverheidsklasse. Sorteer ten slotte de cellen van belang, één cel per put, in zuiverheid van één cel, en zorg ervoor dat u de optie Index sorteren aanvinkt.
  13. Ga naar de volgende celdelingskleurstofcombinatie en herhaal dezelfde volgorde. Als referentie geeft tabel 2 een voorbeeld van een gesorteerde plaat.
    OPMERKING: De indexsorteerfunctie genereert afzonderlijke bestanden voor elke gesorteerde voorwaarde.
  14. Aan het einde van de sortering exporteert u de bestanden als FCS 3.0-bestanden. Plaats de cellen in een 37 °C, 5% CO2 incubator. De cellen worden gedurende meerdere dagen gekweekt, volgens het experimentele ontwerp, gedurende ten minste 24 uur26.

Tabel 2: Sjabloon voor een celsorterende 96-well plaat, gebaseerd op de specifieke vereisten voor de opeenvolgende flowcytometrie-analyse. Klik hier om deze tabel te downloaden.

4. Analyse van celsorteergegevens

OPMERKING: Om de kwaliteit van celsortering te valideren, is de FACS-gegevensanalyse noodzakelijk voordat u verder gaat. De belangrijkste output van deze stap is het genereren van een spreadsheet met de markerintensiteiten van elke gesorteerde individuele cel.

  1. Upload de .fcs 3.0-bestanden in de analysesoftware.
  2. Controleer de compensatie-instelling die wordt gebruikt tijdens het sorteren van cellen, met behulp van de enkele kleuringsbestanden die zijn opgenomen vóór de eigenlijke sortering.
  3. Stel de herziene gatingstrategie in met behulp van de bestanden die overeenkomen met de verschillende bulk. Kopieer en plak die poorten in de indexsorteerbestanden.
  4. Controleer of de index gesorteerde cellen in de ingestelde poort zijn gevallen. Als er enkele gesorteerde cellen zijn die onjuist zijn omheind, kunnen ze worden geïdentificeerd door de plaatcoördinaten te exporteren die tijdens het sorteren van de index zijn geregistreerd en later in de analyse zijn verwijderd.
  5. Exporteer de gebeurtenis uit de indexsorteerbestanden als gecompenseerde parameters. Exporteer ze als .csv bestanden en vink de opties " schaalwaarden " en " gecompenseerde parameters" aan. Deze bestanden moeten worden geëxporteerd in een map met de naam " Geëxporteerde bestanden".
  6. Combineer alle bestanden in één .csv bestand met behulp van het script in Aanvullend bestand 1. Stel het juiste pad in met de functie "setwd". De uitvoer van dit script is een spreadsheet met alle verschillend afgesloten gebeurtenissen en de relatieve intensiteiten voor alle parameters.

5. Na kweek antilichaam kleuring

OPMERKING: Voer dit deel van het protocol uit in steriele omstandigheden; Verschillende reagentia worden gedeeld met de vorige stappen en moeten steriel blijven. Gebruik voor de flowcytometrie-analyse een flowcytometer met een plaatlezer. Dit maakt het mogelijk om de kleuring direct in de weefselkweekplaat uit te voeren, waardoor het celverlies tot een minimum wordt beperkt door de hoeveelheid pipetteren en spinnen te beperken. Bereid de oppervlaktemarkering voor met één kleur kleuring met behulp van de compensatieparels, behalve voor putjes A1-A4, die de enkele kleuring voor de CF / CV / VC / VI-kleuren vertegenwoordigen en al aanwezig zijn in de 96-putplaat. De bulkpopulaties gesorteerd op basis van de celkleurstof helpen bij het bepalen van de gatingstrategie voor het aantal divisies en de algemene gating. Benodigde tijd: 120 min.

  1. Voordat u het protocol start, markeert u de putjes die ten minste één cel bevatten door de plaat onder een omgekeerde microscoop te controleren. Deze stap maakt het mogelijk om de hoeveelheid antilichaam die wordt gebruikt voor de kleuring te optimaliseren en versnelt de procedure.
  2. Bereid de antilichaam mastermix voor, volgens tabel 3. Omdat er een aanzienlijke hoeveelheid pipetteren is, houdt de tabel rekening met de technische fout als gevolg van pipetteren, inclusief een extra volume van 5%. De antilichamen die in de tabel worden beschreven, maken het mogelijk om een reeks HSPC's uit menselijke navelstrengbloedmonsters te karakteriseren12.
  3. Centrifugeer de plaat gedurende 5 minuten op 300 x g. Keer de plaat snel om onder de motorkap en over een papieren handdoek om het supernatant te verwijderen.
  4. Voeg 8 μL kleurbuffer toe aan putjes A1-A4. Voeg 8 μL van het mengsel toe aan de andere putjes.
  5. Meng de negatieve kralen en IgG-compensatieparels in een verhouding van 1:1, voor een totaal volume gelijk aan 120 μL. Verzend 20 μL in één buis van 1,5 ml per marker. Voeg het antilichaamvolume toe dat overeenkomt met de verdunningsfactor (als de verdunningsfactor bijvoorbeeld 1:20 is, voeg dan 1 μl toe).
    OPMERKING: Pas het totale volume aan het aantal markers aan dat voor de kleuring wordt gebruikt (bijvoorbeeld 100 μL als het kleuringspaneel vijf antilichamen bevat).
  6. Incubeer de plaat en de enkele kleuringscompensatieregelaars bij +4 °C, gedurende ten minste 30 minuten.
    OPMERKING: De incubatietijd moet worden aangepast aan de technische details van de antilichamen die voor de kleuring worden gebruikt.
  7. Was de kralen met 1 ml vlekbuffer. Breng het totale volume over naar de 5 ml polypropyleenbuizen die eerder zijn gelabeld. Centrifugeer de buizen gedurende 5 minuten op 300 x g en verwijder vervolgens het supernatant via aspiratie.
  8. Was de cellen in de plaat door 100 μL kleurbuffer per put toe te voegen met behulp van een meerkanaals pipet. Centrifugeer de plaat op 300 x g gedurende 5 minuten en keer de plaat vervolgens snel om onder de kap en over een papieren handdoek om het supernatant te verwijderen.
  9. Suspensie van de cellen opnieuw in 85 μL kleuringsbuffer, met behulp van een meerkanaalspipet.
  10. Start de analyse op de flowcytometer (acquisitiemodus), gebruik de speciale sjabloon en klik op aangepast. Deze aangepaste sjabloon houdt rekening met de technische kenmerken van de 96-well round-bottom plaat, met name de afmetingen van elke put (diameter, diepte en dikte). De sonde moet de bodem van de put bereiken, dus zet hem precies in het midden van de putten A1 en H12.
  11. Nadat u de fluoroforen van belang hebt geselecteerd uit de lijst die door de software wordt voorgesteld, stelt u de plaatopstelling in volgens de plaatsjabloon van tabel 2, gecorrigeerd voor het aantal putten met ten minste één cel.
  12. Selecteer 100 μL als de limiet voor het acquisitievolume. Vink de optie roeren aan . Stel de acquisitiesnelheid in op maximaal 1 μL/s, omdat een lagere snelheid het totale geanalyseerde volume per put verbetert.
  13. Voeg de juiste reinigings- en wasoplossingen toe aan putjes H8-H12. Het sjabloon in tabel 2 laat specifiek putjes H8-H12 leeg, omdat de flowcytometer aan het einde van de analyse een reeks wascondities moet uitvoeren.
    OPMERKING: Deze stap is aangepast aan de specifieke kenmerken van de gebruikte flowcytometer.
  14. Stel in de sectie plots en poorten eerst de eencellige poort in, met behulp van de FSC-A / SSC-A-verstrooiingsplot en vervolgens de FSC-H / FSC-A-verstrooiingsplot. Maak een histogram voor elke marker van belang.
  15. Zodra de instellingen zijn bevestigd, gaat u verder met de sectie Analyse . Analyseer eerst de enkele kleuring en registreer niet minder dan 5.000 gebeurtenissen (optimaal bereik: 5.000-15.000 gebeurtenissen), zowel voor de compensatiekralen als de CD34-gekleurde fracties. Pas indien nodig de spanningen aan.
  16. Zodra de afzonderlijke vlekken allemaal zijn geregistreerd, is het mogelijk om de daadwerkelijke acquisitie te starten door op de acquisitiefunctie te klikken.

Tabel 3: Antilichaam mastermix voor een flowcytometrie-experiment, specifiek voor de identificatie van HSPC's uit menselijk navelstrengbloed. Klik hier om deze tabel te downloaden.

6. Post-kweek flowcytometrie data-analyse

OPMERKING: De beschreven gegevensanalyse is specifiek voor de software die wordt vermeld in de materiaaltabel. De belangrijkste output is het genereren van een spreadsheet met informatie over de intensiteit van oppervlaktemarkers, het aantal delingen en verwantschap per geanalyseerde cel. Inbegrepen in dit deel van het protocol is een script geschreven in R, nodig voor deze workflow om de uiteindelijke analysespreadsheet te genereren.

  1. Exporteer bestanden van de flowcytometer als .fcs-bestanden. Upload ze naar de analysesoftware en groepeer ze samen als "enkele kleuring", "bulk" en "enkele cel".
  2. Bereid een compensatiematrix voor met behulp van de enkele kleuringsbestanden en pas deze toe op de andere twee groepen door slepen en neerzetten.
    OPMERKING: Als een automatische compensatietool wordt gebruikt, controleer dan de kwaliteit met de hand voordat u verder gaat.
  3. Om een representatieve gating te hebben, voegt u de verschillende bulkputten samen in één bestand. Deze stap markeert snel of twee kleuren elkaar overlappen (meestal CV en VC) of andere afwijkingen en daarom moeten worden uitgesloten. Nadat u op de optie aaneengeschakelde populaties hebt geklikt, selecteert u alle niet-gecompenseerde parameters in het menu "parameters" en klikt u vervolgens op aaneenschakeling.
  4. Upload het aaneengeschakelde bestand naar de werkruimte en pas vervolgens de compensatiematrix toe via slepen en neerzetten.
  5. Bereid de gatingstrategie voor die is gedefinieerd in figuur 2 met behulp van het samengevoegde bestand. Geef in de eencellige poort de gebeurtenissen weer op een spreidingsplot met CFSE en CTV. Maak een eerste poort met de naam Gelabeld, inclusief alle vier de kleuren en exclusief mogelijke automatische fluorescentie (Figuur 2C). Sluit vervolgens elke kleur afzonderlijk af.
  6. Cellen gelabeld met CV en VC hebben een getransformeerde waarde nodig, aangezien de kleur het resultaat is van de CFSE- en CTV-signalen. De twee gecoördineerde signalen worden daarom op een logaritmische schaal 45° gedraaid, zodat de delingsverdunning parallel aan de x-as kan verlopen. Deze getransformeerde waarde wordt handmatig afgeleid, door op Tools te klikken en vervolgens op Parameter afleiden. Plak de volgende formule in het formulevak:
    Equation 1
    OPMERKING: De vergelijking26 gaat ervan uit dat CFSE en CTV parameters 03 en 17 zijn.
  7. Om deze nieuwe parameter met de naam Afgeleide parameter correct te visualiseren, stelt u een lineaire as in die ~3-7 bereikt, klikt u op de optie Asparameter en selecteert u As aanpassen.
  8. Pas de gating toe op elke kleur afzonderlijk als een histogramplot: voor CF en VI stelt u CFSE-A en CTV-A in op respectievelijk de x-as. Stel voor CV en VC de nieuw afgeleide parameter in op de x-as. Stel poorten in die overeenkomen met elke piek, zoals weergegeven in figuur 3.
  9. Breng de gating aan op elke afzonderlijke eencellige put. Zorg ervoor dat u de afgeleide parameter aan elk geanalyseerd goed toevoegt. Controleer handmatig elke kleurpoort voor elke put om gebeurtenissen te detecteren die onjuist zijn toegewezen aan een bepaalde piek. Voorbeelden van gating zijn weergegeven in figuur 4.
  10. Nadat de analyse is voltooid en alle putten zijn geverifieerd, selecteert u alle CF/CV/VC/VI-poorten die ten minste één cel bevatten. Exporteer ze als .csv bestanden en vink de opties "schaalwaarden" en "gecompenseerde parameters" aan. Deze bestanden worden geëxporteerd in een map met de naam "Geëxporteerde bestanden".
  11. Combineer alle bestanden in één .csv met behulp van het R-script in Aanvullend bestand 1. Vergeet niet om het juiste pad in te stellen met de functie "setwd". De uitvoer van dit script is een spreadsheet met alle verschillende gated events en de relatieve intensiteiten voor alle parameters.
  12. Open de spreadsheet en wijzig de naam van de kolommen voor elke parameter, bijvoorbeeld met de volgende namen: CFSE, CTV, CD90, CD123, CD45RA, CD34, CD38. Deze namen worden gebruikt om de gating-drempel te identificeren om hun identiteit correct aan elke cel toe te wijzen.
  13. Voeg zes kolommen toe met de namen "Well", "Condition", "Color", "Generation", "Original_cell" en "Culture_time". Deze variabelen zijn experimenteel gedefinieerd en worden uit elke rij afgeleid:
    export_A10 CD34 + PBS_CV_Peak 1.csv,1 = A10 (goed), CD34+ (Original_cell), PBS (Conditie), CV (Kleur), Peak_1 (Generatie).
  14. Exporteer de bulkputten om de drempelwaarden voor gating te identificeren: exporteer de gecompenseerde populatie van belang (bijv. CD34 + CD38-) als .csv bestanden, waarbij u de opties "schaalwaarden" en "gecompenseerde parameters" aanvinkt. Exporteer deze bestanden in een map met de naam "Geëxporteerde bestanden".
  15. Als u de drempelwaarde voor CD38 wilt bepalen, identificeert u de grootste numerieke waarde voor deze parameter. Omgekeerd, om de drempel voor CD34 te vinden, identificeert u de kleinste numerieke waarde voor deze parameter. Herhaal dit proces voor alle parameters van belang.
    OPMERKING: Voor de analyse die in het protocol wordt gepresenteerd, wordt de marker CD45RA gebruikt om LMPPs te identificeren in de CD34+CD38- gate en CMP/GMP in de CD34+CD38+ gate. Dit betekent dat er twee verschillende drempelwaarden moeten worden geëxtraheerd voor deze marker.
  16. Kopieer en plak de drempelwaarden in een Excel-bestand met de naam "gating_matrix". Dit bestand is georganiseerd volgens tabel 4 en maakt de analyse van meerdere onafhankelijke experimenten mogelijk. Het is erg belangrijk om elke kolom precies met dit schema te benoemen: XXYYMMDD_xxh, waarbij XX staat voor de twee initialen van de operator, YY de laatste twee nummers voor het jaar, MM voor de maand, DD voor de dag en xx voor het analysetijdpunt.

Tabel 4: Gating matrix voor de toewijzing van het lot van de cel, vóór de statistische analyse. De CD45h verwijst naar de intensiteit van CD45RA voor de HPC subset gating, terwijl CD45l verwijst naar de intensiteit van CD45RA voor de CD34+CD38- subsets. Klik hier om deze tabel te downloaden.

7. Statistische analyse

OPMERKING: Het statistisch testen van de gegenereerde gegevens omvat een op maat gemaakte analysepijplijn, gecodeerd met behulp van de programmeertaal Python (Aanvullend bestand 2, Aanvullend bestand 3 en Aanvullend bestand 4). Het script is georganiseerd in drie blokken: het eerste blok voor het verwerken van de spreadsheet, het tweede blok om de heatmap voor gegevensvisualisatie te genereren en het laatste blok om meerdere histogrammen te genereren om differentiatie- en delingseigenschappen te analyseren en te testen.

  1. Begin met het blok "0_process_data" (Aanvullend bestand 2) en zorg ervoor dat de paden van de gating_matrix en de gegevensspreadsheet correct zijn gedefinieerd in het script.
  2. Definieer het woordenboek "cell_cols" om de relevante cellotgevallen aan elke cel toe te wijzen. In het specifieke geval zijn de lotgevallen HSC's, MPP's, LMPP's, gemeenschappelijke myeloïde voorlopers (CMP's), granulo-monocytische voorlopers (GGP's), megakaryocytische-erytroïde voorlopers (MEPs) en CD34-.
  3. Definieer met behulp van de drempelwaarden die zijn gedefinieerd vanuit de bulkputten (stap 6.16) de functie "cell_class_exp_time". Het is essentieel om consistent te zijn in de kolomnaamgeving, om deze drempels correct te definiëren, met dezelfde naam die wordt gebruikt om elke kolom te definiëren in stap 6.12.
  4. De celfenotypen worden in het script gedefinieerd met behulp van een reeks "if-else" -instructies, gebaseerd op de drempels die worden gedetecteerd tijdens de flowcytometrie-analyse.
    OPMERKING: Verschillende fenotypen kunnen worden weergegeven door deze instructies aan te passen aan andere markeringscombinaties.
  5. Specificeer de experimentele specifieke omstandigheden, met behulp van de functie "cond_rule" (bijvoorbeeld verschillende experimentele behandelingen). Voor de verstrekte dataset worden de voorwaarden "GT" en "Diff" genoemd. Beschrijf de twee verschillende celkweekmedia die worden gebruikt om de cellen te kweken. Deze informatie wordt gebruikt door het blok "1_dot_plot" (Aanvullend bestand 3) voor het plotten van de heatmap.
  6. Definieer in het blok "2_bar_plot" (aanvullend bestand 4) het woordenboek "class_dct", inclusief de discrete cel lotgevallen van belang. Voor de verstrekte dataset zijn de cel lotgevallen van belang dezelfde beschreven voor het "cell_cols" woordenboek.
  7. Definieer "conds" (voorwaarden), "or_cells" (oorspronkelijke cel), "sym_labs" (symmetrielabels) en "times" (het experimentele tijdstip). Dit zijn herhalende filters die nodig zijn voor het plotten. "conds" nemen de voorwaarden die zijn gedefinieerd in "cond_rule" opnieuw, "or_cells" zijn HSC's en MPP's en "sym_labs" beschrijven het type divisies.
  8. In het blok "2_bar_plot" is het mogelijk om cellen te plotten die zijn gevorderd tot deling 6.
    OPMERKING: De verstrekte gegevensset bevat alleen cellen tot deling 4, dus er verschijnt een foutmelding, maar dit voorkomt niet dat het script werkt.
  9. De cijfers die door het script worden gegenereerd, kunnen als pdf-bestanden worden opgehaald in de map met de naam "figuren". De bestanden met de naam "Test" vertegenwoordigen de verschillende statistische tests die zijn uitgevoerd voor het bijbehorende histogram.

Representative Results

FACS sortering
De sorteerstrategieën die in dit protocol worden gepresenteerd, zijn gebaseerd op algemeen aanvaarde strategieën 12,30,31. Voor de gatingstrategie in figuur 1 is het uitgangsmateriaal navelstrengbloedvoorlopers die eerder zijn gezuiverd via CD34+ magnetische verrijking, wat het verwaarloosbare percentage Lineage-positieve cellen verklaart. Het is essentieel om strakke poorten te gebruiken voor de vier intracellulaire kleurstofcombinaties (bijvoorbeeld de CTV in de figuur), om de resolutie van de pieken tijdens de volgende analyse te verbeteren en om de juiste celpopulatie te gaten (figuur 1D). In het geval dat in de figuur wordt weergegeven, selecteren de poorten voor de grootste en beter gedefinieerde populatie. De aanwezigheid van meerdere, nauwe populaties voor elke celdelingskleurstofcombinatie is in onze ervaring niet representatief voor biologische verschillen. In plaats daarvan zou het kunnen wijzen op a) een niet-optimale kleuringsprocedure, of b) een grote heterogeniteit (vooral in grootte) in de beginpool van cellen. Dit is niet onverwacht wanneer wordt uitgegaan van navelstrengbloed of andere complexe biologische bronnen (bijv. beenmergaspiraten, perifeer bloed). Als de poort niet strak is gedefinieerd, kan de progressieve verdunning van de verschillende kleurstofcombinaties leiden tot samenvoeging van de latere pieken, specifiek voor de omstandigheden CV en VC (figuur 2D). Een ander negatief gevolg van een suboptimale gating is het onvermogen om verschillende pieken na celkweek efficiënt te onderscheiden, omdat een heterogene startpopulatie kan leiden tot ondiepe pieken.

Figure 1
Figuur 1: Gating strategie voor celsortering. (A) FSC-A versus SSC-A, om puin en verontreinigende cellen uit te sluiten. (B) FSC-A versus FSC-H, om doubletten en celklonten uit te sluiten. (C) Lin versus FSC-H, om cellen uit te sluiten die Lin+ zijn. (D) CTV versus CFSE, om de cellen die gekleurd zijn met de kleurstofcombinaties CF, CV, VC en VI ondubbelzinnig te identificeren. De poorten moeten streng genoeg zijn om een homogene populatie op te nemen. (E) CD34 versus CD38, om de beperkte voorlopers CD34+CD38+ (ook wel HPC's genoemd) te scheiden van het multipotente compartiment CD34+CD38-. (F) CD45RA versus CD90, van de CD34+CD38-populatie, om onderscheid te maken tussen de meest onvolwassen voorlopers verrijkt in de HSC (CD90+CD45RA-), de LMPP (CD90midCD45RA+), en de meer toegewijde MPP (CD90-CD45RA-). (G) Index gesorteerde gebeurtenissen, hier weergegeven voor hun celkleurstofcombinatiekleuring en (H) de expressie van oppervlaktemarkers CD90 en CD45RA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Flowcytometrie-analyse na celkweek
De gegevens in figuur 2 zijn representatief voor HSC's in menselijk navelstrengbloed, die gedurende 72 uur in cultuur worden gehouden, in aanwezigheid van meerdere cytokines die een reeks myeloïde voorlopers en voorlopers kunnen ondersteunen. Panelen 2A tot 2D vertegenwoordigen de gating die nodig is om de verwantschap van elk van de individuele cellen vast te stellen, terwijl panelen 2E tot 2G cellulaire fenotypering mogelijk maken. De verminderde aanwezigheid van europarlementariërs in de figuur is waarschijnlijk het gevolg van de kweekomstandigheden die voor dit representatieve experiment zijn gebruikt (figuur 2F). Het gebruik van verschillende cytokines en kweekomstandigheden verandert het relatieve percentage van elke subset, vergelijkbaar met het selecteren van verschillende startcellen voor het experiment.

Figure 2
Figuur 2: Gating strategie voor de flow cytometrie analyse. (A) FSC-A versus SSC-A, om puin en verontreinigende cellen uit te sluiten. (B) FSC-A versus FSC-H, om doubletten en celklonten uit te sluiten. (C) CTV versus CFSE, de poort gelabeld maakt het mogelijk om elke auto-fluorescerende gebeurtenis uit te sluiten die de gegevensresolutie zou kunnen beïnvloeden. (D) CTV versus CFSE. Het is uiterst belangrijk om de vier populaties strikt te sluiten, op basis van de verdunningen van de celdelingskleurstof. (E) CD34 versus CD38, om onderscheid te maken tussen toegewijde voorlopers (CD34-), beperkte voorlopers (HPC) (CD34+CD38+) en onvolwassen voorlopers (CD34+CD38-). (F) CD45RA versus CD123, om drie soorten beperkte voorlopers te onderscheiden: CMP (CD123+CD45RA-), MEP (CD123-CD45RA-) en GMP (CD123+CD45RA+). (G) CD45RA versus CD90, van de CD34+CD38-, om HSC's, LMPP's en MPP's te identificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De piekdefinitie- en toewijzingsstappen (figuur 3 en figuur 4) zijn cruciale aspecten van het protocol en vereisen de definitie van strikte poorten. Voor de piekdefinitie (figuur 3) zijn minimaal 1.000 gebeurtenissen nodig voor een betrouwbare identificatie. In die zin kan het nuttig zijn om meer cellen te isoleren tijdens de celsorteerstap voor de "Bulk" -putten. Figuur 4 beschrijft vier voorbeelden van enkele putten met meerdere families. Deze figuur verduidelijkt het belang van figuur 2D en figuur 3 gating, vooral voor de identificatie van elke familie en elke piek. Figuur 4A illustreert een eenvoudig voorbeeld, omdat alle cellen in de poort CF zeer dicht bij elkaar liggen en gemakkelijk aan een enkele piek kunnen worden toegewezen. Figuur 4C toont een ander voorbeeld van een familie die eenduidig verdeeld is over twee goed gescheiden pieken, zoals duidelijk wordt weergegeven in het histogram van figuur 4D. Figuur 4E,G laat het belang zien van strikte gating op basis van een groot aantal gebeurtenissen; Ze vertonen allebei weinig evenementen die dichtbij zijn, maar buiten de verfcombinatiepoorten. Deze gebeurtenissen kunnen ten onrechte worden opgenomen in de VI- en CF-poorten, uitsluitend op basis van de analyse van één put. Ten slotte toont figuur 4F,H twee verschillende voorbeelden van families verspreid over meerdere pieken, met één voorbeeld van twee vergelijkbare intensiteitspieken (figuur 4F) en één met twee ongelijke intensiteitspieken (figuur 4H).

Figure 3
Figuur 3: Piekdefinitie voor de flowcytometrie-analyse. (A-D) Pieken moeten worden gedefinieerd door ten minste 500 gebeurtenissen te registreren, om een goede weergave voor elke individuele piek te garanderen. (A) Histogram voor de CFSE-A-intensiteit. Er kunnen verschillende pieken worden geïdentificeerd, die elk overeenkomen met een andere populatie van delende cellen. (B,C) Histogrammen voor de intensiteit van de afgeleide parameter, die respectievelijk het CFSE-CTV-mengsel, CV (B) en VC (C) vertegenwoordigen. (D) Histogram voor de CTV-A-intensiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Piektoewijzing . (A,B) Voor deze put kan slechts één piek worden gedetecteerd, in de CF-poort. (C,D) Twee pieken van bijna gelijke intensiteit kunnen worden gedetecteerd in deze put, in de VI-poort. De pieken zijn goed opgelost. (E,F) In deze put, in de VI-poort, zijn twee pieken van vergelijkbare intensiteit te bespeuren. Alleen de gebeurtenissen in de poort zijn overwogen, op basis van de strategie die is ingesteld met behulp van de bulkputten. (G-H) Twee pieken van ongelijke intensiteit kunnen worden gedetecteerd in deze put, in de poort CF. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Gegevensrepresentatie en statistische toetsing
Figuur 5 toont verschillende soorten gegevensrepresentatie van twee afzonderlijke experimenten, beide uitgevoerd na 72 uur celkweek. HSC's en MPP's zijn gekweekt in twee verschillende celkweekmedia, verondersteld om de celdeling en differentiatie-eigenschappen te veranderen. Deze media heten "Diff" (Differentiatie)32 en "GT"33; de eerste bevordert myeloïde en erytroïde differentiatie, omdat het erytropoëtine (EPO) en granulo-monocytische koloniestimulerende factor (GM-CSF) bevat, terwijl de tweede is ontwikkeld in de context van klinische onderzoeken naar gentherapie, met als doel een hoog percentage HSPC's te behouden en te versterken. Figuur 5A is een representatieve heatmap voor de aandoening "Diff", die een verscheidenheid aan celfamilies vertegenwoordigt, zowel in cel lotgevallen als delingen. In deze heatmap vertegenwoordigt elke rij een individuele familie, elk vierkant een individuele cel en de kolommen groeperen alle cellen die zich in dezelfde generatie bevinden (bijvoorbeeld cellen in generatie 2 die minstens twee keer zijn gedeeld). Het is mogelijk om zeer homogene families te onderscheiden, samengesteld uit een enkel celtype en met hetzelfde aantal delingen (bijv. Familie # 63), en heterogene families, waaronder drie celtypen over twee generaties (bijv. Familie # 84). Omdat het cellulaire herstelpercentage voor deze analyse ongeveer 70% is, worden complete families, die worden gedefinieerd door al hun cellen te laten herstellen in mogelijk verschillende generaties (bijvoorbeeld een familie van één cel in generatie 1 en twee cellen in generatie 2), zelden waargenomen (met een hashtag naast hun ID-nummer in figuur 5A). Er zijn meerdere verklaringen voor de onvolledige detectie, die technisch (kleuringsprobleem, celverlies als gevolg van het protocol) of biologisch (celdood en / of apoptose) kunnen zijn. Technische beperkingen kunnen worden overwonnen met behulp van een analysator die is ontworpen om het dode volume van het individuele monster te verminderen en door de celkleuring rechtstreeks in de celkweekplaat uit te voeren om het volumepipetteren te verminderen. Omgekeerd kunnen orthogonale methoden om de hoeveelheid celdood te bepalen (bijvoorbeeld via live-cell imaging-experimenten) helpen om de technische en biologische factoren te onderscheiden die resulteren in onvolledige detectie.

Figuur 5Bi laat zien hoe het effect van de kweekconditie op de celtypesamenstelling kan worden gevisualiseerd, alsof men een bulktest heeft uitgevoerd. Hier bevordert de Diff-conditie een groter aantal lotgevallen en een hoger percentage CD34+ -cellen (gedefinieerd als alle celtypen behalve CD34-). De betrouwbaarheidsintervallen worden in het script berekend via basic bootstrap, met 250.000 bootstrapped datasets34. Het is vermeldenswaard dat alle andere histogrammen in figuur 5 betrouwbaarheidsintervallen weergeven die op dezelfde manier zijn berekend. Tabel 5 geeft een overzicht van alle informatie over het aantal families en het aantal cellen in elke generatie.

Figuur 5Bii geeft grafisch de output weer van de statistische tests die zijn uitgevoerd in het script "2_bar_plot". Een formele beschrijving van het statistisch kader is beschikbaar26. Kortom, dit raamwerk maakt statistische hypothesetests mogelijk terwijl wordt aangenomen dat cellen uit dezelfde familie afhankelijk zijn (een aanname die zelf testbaar is), in tegenstelling tot klassieke statistieken die onafhankelijkheid tussen alle waargenomen cellen zouden vereisen. In het specifieke geval dat in de figuur wordt gepresenteerd, daagt de statistische test de hypothese uit dat de cellotkeuzes van MPP's, gemeten als de frequenties van de verschillende celtypen die in de cultuur aanwezig zijn, onafhankelijk zijn van de gebruikte celkweekomstandigheden. Ten eerste wordt de G-teststatistiek gebruikt om de discrepantie tussen celtypefrequenties van verschillende celmedia te evalueren (voor het voorbeeld in Bii wordt deze statistiek weergegeven met de rode balk). Vervolgens wordt een randomisatie van de gegevens uitgevoerd via permutatie, waarbij hele families van cellen worden uitgewisseld tussen de twee celkweekomstandigheden. Dit is om de afhankelijkheid tussen familiegerelateerde cellen te behouden, terwijl het aantal families in elke set consistent blijft met de oorspronkelijke gegevens. De G-test statistiek wordt berekend op basis van de gerandomiseerde dataset. De blauwe waarden weergegeven in 5Bii zijn de G-test statistiek voor 250.000 permutaties. Ten slotte wordt de p-waarde berekend om te beoordelen in hoeverre de oorspronkelijke dataset afwijkt van de verdeling van de gepermuteerde datasets. In het voorbeeld wijkt de oorspronkelijke statistiek grotendeels af van de verdeling, wat resulteert in een kleine p-waarde en daarmee de hypothese verwerpt dat het cellot van MPP's onafhankelijk is van de kweekomstandigheden.

Figuur 5C geeft het percentage celfamilies per maximale generatie weer, om te onderzoeken hoe verschillende omstandigheden de celdeling per celfamilie veranderen. Deze gegevensgrafiek laat zien dat de cellen gekweekt in de Diff-toestand na 72 uur een groter aantal delingen voltooien dan cellen in de GT-toestand. Vertegenwoordigd is het aantal maximale generaties per familie, dus één familie die cellen in generaties 1 en 2 vertoont, wordt beschouwd als generatie 2. Hetzelfde statistische kader dat voor figuur 5B wordt gebruikt, kan worden gebruikt om de onafhankelijkheid tussen cellulaire deling en cultuurconditie statistisch te testen.

Figuur 5D verkent het type symmetrie/asymmetrie van de eerste deling voor de verschillende vooroudertypen (HSC's of MPP's). Voor de volledige celfamilies in generatie 1 - de enige generatie waar het mogelijk is om de twee dochtercellen definitief als zustercellen vast te stellen- kunnen vier verschillende soorten symmetrie/asymmetrie worden gedefinieerd: het label "Sym Undiff" beschrijft families waar beide dochters het fenotype van de cel van oorsprong behouden. "Sym Diff" betekent dat beide dochters hetzelfde fenotype hebben en dat het verschilt van de cel van herkomst. "Asym Undiff" betekent dat één dochter alleen het fenotype van de cel van oorsprong behoudt. Ten slotte beschrijft "Asym Diff" families waar beide dochters verschillende fenotypen hebben, en geen van hen is hetzelfde als de cel van herkomst. Om statistische kracht te krijgen bij het beoordelen van deze symmetrische / asymmetrische lotgevallen, is het wenselijk om de MultiGen-analyse op vroege tijdstippen uit te voeren, om meer families te observeren waarvan de nakomelingen worden gevonden in generatie 1.

Ten slotte geeft figuur 5E de percentages celtypen weer als functie van het aantal delingen, om inzicht te krijgen in de progressie van het differentiatiepatroon tussen delingen. De gegevens die in de figuur worden weergegeven, suggereren bijvoorbeeld dat cellen doorgaan naar de CD34-toestand , met meer dan 50% van de gedetecteerde cellen in deze klasse na slechts drie delingen. Bovendien is het mogelijk om af te leiden dat MPP's geen zelfvernieuwingsdeling bevorderen, omdat een klein percentage cellen het oorspronkelijke fenotype behoudt. Sommige van deze conclusies kunnen vervolgens worden getoetst aan de hand van het statistische kader dat in de vorige cijfers is gepresenteerd.

Figure 5
Figuur 5: Voorbeeld van gegevensrepresentatie voor een 72 uurs experiment met HSPC's voor navelstrengbloed. (A) Heatmaps voor een geselecteerde dataset (HSC, in "Diff"-medium, na 72 uur cultuur). De plots vertegenwoordigen alle individuele cellen (vierkanten) op basis van hun verwantschap (rijen), het aantal uitgevoerde delingen (kolommen, generatie genoemd) en fenotype (kleuren). (Bi) Histogram waarin de verhoudingen van de celtypen van de celprogenies van HSC's en MPP's worden vergeleken, tussen de aandoening GT en de aandoening Diff. (Bii) De grafiek geeft de statistische tests weer die zijn uitgevoerd in het "2_bar_plot" -script voor MPP's op 72 uur cultuur, waarbij wordt vergeleken tussen de "Diff" en de "GT" cytokinecocktails. De experimentele waarde wordt in rood weergegeven en de waarden gegenereerd via 250.000 permutaties in blauw. De p . waarde van de G-test wordt in de rechterbovenhoek aangegeven met het aantal gezinnen dat voor de test is gebruikt. (C) Histogram waarin het percentage families (314 families in totaal) in elke generatie (kleurgecodeerd) wordt vergeleken voor HSC's en MPP's per cultuurconditie. De betrouwbaarheidsintervallen worden berekend met 250.000 bootstrapped datasets. (D) Histogram dat het type symmetrie/asymmetrie weergeeft tussen het lot van de dochtercellen voor de families met twee cellen in generatie 1: Sym Undiff (beide dochters behouden het fenotype van de cel van oorsprong), Sym Diff (beide dochters hebben hetzelfde fenotype en het verschilt van de cel van oorsprong), Asym Undiff (slechts één dochter behoudt het fenotype van de cel van oorsprong), en Asym Diff (beide dochters hebben verschillende fenotypen en geen van hen lijkt op de cel van oorsprong). e) histogrammen van de bijdrage van celtypen die per generatie zijn ingedeeld voor MPP's die zijn gekweekt met de "Diff"-cocktail; n = 204 cellen en 97 families. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 5: Beschrijving van het aantal geanalyseerde families en cellen per experimentele aandoening (cel van oorsprong en celkweekmedium). Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De MultiGen-test is een high-throughput, gemakkelijk uit te voeren en niet-dure test, die instrumenteel is geweest voor het bestuderen van lymfocyten 23,24,35 en murine hematopoietische cellen 26,27. Hier presenteren we een nieuwe ontwikkeling van de aanpak die het mogelijk maakt om ex vivo de vroege fase van menselijke HSPC-toewijding te ontcijferen, op het niveau van één cel met behulp van kortetermijncultuur (figuur 6). Eencellige ex vivo kweeksystemen worden meestal gebruikt om het lot op lange termijn van HSPC's in volwassen cellen te beoordelen, maar sommige lotgevallen treden eerder op dan andere36, waardoor de analyse mogelijk naar minder lotgevallen wordt vertekend. Bovendien missen deze cultuursystemen meestal informatie over verdeeldheid tijdens het lot van het lot. Het is aangetoond dat de eerste verbintenisstappen al aan het begin van de cultuur plaatsvinden, soms zonder divisie26,37, waardoor kortetermijncultuur en het volgen van divisie essentieel zijn om vroege lotsverbintenis te bestuderen. Door tegelijkertijd het lot, de verdeling en de verwantschap te volgen, maakt deze test het mogelijk om de rol van de eerste divisie en de beslissing over het lot in menselijke HSPC's te begrijpen. Met behulp van de test is het mogelijk om af te leiden na hoeveel delingen het verbintenisproces plaatsvindt, de balans tussen zelfvernieuwing en differentiatie voor die vroege voorlopers, en hoe die eigenschappen van generatie op generatie worden geërfd. Voor zover wij weten, is dit de enige test die dit soort metingen voor menselijke HSPC's mogelijk maakt, met een eencellige resolutie. Daarnaast hebben we met behulp van verschillende combinaties van celdelingskleurstoffen de doorvoer van de analyse verhoogd, waardoor deze test een waardevol hulpmiddel is om snel grote datasets te genereren. De kleurstofcombinaties maken het mogelijk om verschillende families in dezelfde putten te volgen, waardoor het aantal cellen dat beschikbaar is voor analyse in kortetermijncultuur toeneemt. Het aantal combinaties kan mogelijk nog meer worden verhoogd, door de toevoeging van andere kleurstoffen (bijvoorbeeld gele kleurstof) of door de verhouding tussen CFSE en CTV te wijzigen. Dit vermindert echter het aantal andere parameters dat kan worden geanalyseerd.

Figure 6
Figuur 6: Schematische weergave van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de analyse met succes uit te voeren, vanwege het grote aantal putten en het verminderde aantal te analyseren cellen, is het noodzakelijk om de flowcytometrie-analyse uit te voeren op een analysator die is uitgerust met een plaatlezer. De nieuwe generatie bench analyzers is bijzonder aangepast aan deze test, omdat de meeste van hen een kleiner dood volume hebben om het percentage celverlies te verminderen. Dit garandeert op zijn beurt een hogere efficiëntie bij het terugwinnen van het geheel van elke put, wat leidt tot een geschatte efficiëntie in het bereik van 70%26. Het schatten van het celverlies tijdens de flowcytometrie-acquisitie is cruciaal voor de analyse van elke individuele familie. Bijvoorbeeld, uitgaande van geen celdood en het tellen van het aantal delingen, is het mogelijk om het aantal cellen per familie te schatten. Niettemin is het wenselijk enkele bevestigende experimenten uit te voeren, met name bij de schatting van de celdood in de geteste kweekomstandigheden en het experimenteel meten van de herstelsnelheid met behulp van een bepaald aantal cellen.

Een van de cruciale stappen van dit protocol is de piektoewijzing. Zoals gezegd is een kwalitatief goede piekverdeling sterk afhankelijk van de isolatie van zeer smalle pieken bij celsortering. Toch is het nog steeds moeilijk om het juiste aantal divisies toe te wijzen op basis van de verdeling. Omdat celsortering en flowcytometrie-analyse op twee verschillende machines worden uitgevoerd, is het niet mogelijk om de intensiteit van elk signaal direct te vergelijken, dus het kan moeilijk zijn om te weten of de eerste piek die aan de rechterkant van het histogram wordt waargenomen, piek 0 of piek 1 is. In dit opzicht zijn er weinig oplossingen mogelijk; Een manier is om een orthogonaal experiment uit te voeren om het aantal delingen dat door deze cellen wordt uitgevoerd nauwkeurig te meten (bijv. Live-cell Imaging). Een andere mogelijkheid is om eenvoudig het aantal cellen in de put te tellen onder een omgekeerde brightfield-microscoop, voordat de flowcytometrie-analyse wordt uitgevoerd. Dit zal een gemiddeld aantal delingen afleiden (ervan uitgaande dat er geen celdood is). Ten slotte is een post-hoc oplossing voor piektoewijzing de detectie van een ongewoon aantal "onmogelijke gezinnen"; Deze families zijn samengesteld uit een groter dan mogelijk aantal cellen per generatie (bijvoorbeeld vijf cellen in generatie 2, of twee cellen in generatie 1 en één cel in generatie 2). De mogelijkheid om onmogelijke families uit te sluiten wordt gecodeerd in de statistische analysestap en markeert de onmogelijke familie. Als het voorkomen van deze fouten te hoog is, is het redelijk om aan te nemen dat de piektoewijzing moet worden herzien.

In dit protocol hebben we enkele voorbeelden van gegevensrepresentatie en -analyse voor de test opgenomen, omdat dit een essentiële stap is geworden in het genereren en interpreteren van grote datasets38. Het eerste voorbeeld is de heatmap met de totaliteit van alle geanalyseerde cellen, georganiseerd per familie. Dit is een efficiënt hulpmiddel om de algemene eigenschappen van de gegevens en mogelijke conclusies te onderzoeken: zijn families samengesteld uit meerdere celtypen of hebben ze de neiging homogeen van samenstelling te zijn? Zijn families verspreid over meerdere generaties, of delen ze meestal hetzelfde aantal keren? Deze verkennende analyse moet vervolgens worden aangevuld met meer specifieke waarnemingspunten en statistische tests. Het kan worden gebruikt om symmetrische en asymmetrische lotsverbintenis, differentiatie zonder deling, de balans tussen zelfvernieuwing en differentiatie en het aantal divisies voor een bepaald lot te beoordelen. Het is van fundamenteel belang om tijdens de experimentele planning de lengte van de celkweek in te stellen op basis van het type vraag dat wordt gesteld; Bijvoorbeeld, voor de eerste twee vragen (symmetrisch / asymmetrisch evenwicht en differentiatie zonder deling), maakt het plannen van zeer korte culturen stappen de isolatie mogelijk van een groot aantal families die slechts één of helemaal geen delingen hebben uitgevoerd26. Omgekeerd maken langere experimenten het mogelijk om het aantal delingen te onderzoeken dat nodig is voor een specifieke celverbintenis, omdat ze families in verschillende stadia van differentiatie bemonsteren. Toch is deze methode niet ontworpen voor langdurige culturen (2-3 weken), omdat celkleurstofverdunning niet in staat is om meer dan zeven of acht delingen nauwkeurig te volgen22. Als gevolg hiervan is deze tool meestal aangepast om de vroege betrokkenheid van hematopoietische voorlopercellen te bestuderen en is niet ontworpen om robuuste conclusies te trekken over de differentiatie-eigenschappen van deze cellen op lange termijn.

Het statistisch kader is speciaal ontwikkeld voor de analyse van dit soort gegevens en gebaseerd op het concept van permutaties26. Dit was nodig vanwege de waarneming van een familiale afhankelijkheid van de celtypeverdeling en van het aantal uitgevoerde delingen. Met andere woorden, cellen die deel uitmaken van dezelfde familie hebben ook meer kans om vergelijkbare fenotypen te vertonen en hetzelfde aantal keren te delen. Hoewel een diepgaande analyse buiten het bestek van deze werkzaamheden valt, moet de verstrekte reeks statistische tests voldoende zijn bij de beoordeling van verschillende omstandigheden.

Kortom, dit protocol vormt een waardevol hulpmiddel om de cellulaire dynamiek van hematopoëtische stam- en voorlopercellen ex vivo te beoordelen, op een snelle en goedkope manier. Vanwege de flexibiliteit en veelzijdigheid met betrekking tot het tijdspunt, de kweekomstandigheden en het type geanalyseerde HSPC's, maakt het het mogelijk om een verscheidenheid aan experimentele omstandigheden te testen. Als een op flowcytometrie gebaseerde test kan het in de meeste laboratoria worden geïmplementeerd en vereist het geen uitgebreide voorkennis, waardoor het een goede kandidaat is voor screenings en pilotexperimenten.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflict dat relevant is voor dit werk. De financiers hadden geen rol in het ontwerp van de studie, het verzamelen en interpreteren van gegevens, of de beslissing om het werk voor publicatie in te dienen.

Acknowledgments

We willen de leden van het Institut Curie Flow Facility bedanken voor hun hulp bij het opzetten van de flowcytometrie-experimenten. We willen ook de bijdragen van de andere leden van het Team Perié bedanken, tijdens meerdere discussies. We bedanken Dr. Julia Marchingo en Prof. Phil Hodgkin (Walter end Eliza Hall Institute of Medical Research) voor het delen van hun protocol van de multiplexing van celdelingskleurstoffen op lymfocyten. Wij danken de biobank van het Saint Louis ziekenhuisbloed voor het verstrekken van de biologische middelen die nodig zijn voor de ontwikkeling van dit protocol. De studie werd ondersteund door een ATIP-Avenir-subsidie van CNRS en Bettencourt-Schueller Foundation (aan L.P.), subsidies van de Labex CelTisPhyBio (ANR-10-LBX-0038) (aan L.P. en A.D.), Idex Paris-Science-Lettres Program (ANR-10-IDEX-0001-02 PSL) (aan L.P.), de Canceropole INCA Emergence (2021-1-EMERG-54b-ICR-1, aan L.P.), en de ITMO MIIC-subsidie (21CM044, aan L.P.). Naast financiering van de European Research Council (ERC) in het kader van het Horizon 2020 onderzoeks- en innovatieprogramma ERC StG 758170-Microbar (naar L.P.) van de Europese Unie, werd a.d. ondersteund door een fellowship van de Fondation de France.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes vWR 87003-294
15-mL polypropylene tubes vWR 734-0451
50-mL polypropylene tubes vWR 734-0448
96-well U-bottom culture plate  Falcon 353077
Anti-human Lin APC Thermo Fisher 22-7776-72 Dilution 1/40
ARIA III BD Can be replaced with any FACS sorter able to sort individual cells in 96-wells plate
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) Life Technologies C34570
Cell Trace Violet (CTV)  Life Technologies C34571
Compensation beads  BD 552843
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Life Technologies 11320033
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Thermo Scientific J62948-36 Prepare a solution 0.5 M, in sterilised water
FC block Fc1.3216 BD 564220 Dilution 1/50
Fetal Bovine Serum (FBS) Dutscher S1900-500C Batch S00CH
FlowJo v10.8.1 BD
Mouse anti-human CD10 PerCP-5.5, clone HI10a Biolegend 312216 Dilution 1/20
Mouse anti-human CD123 BUV395, clone 7G3 BD 564195 Dilution 1/15
Mouse anti-human CD34 APC-Cy7, clone 581 Biolegend 343513 Dilution 1/40
Mouse anti-human CD38 BV650, clone HB7 Biolegend 356620 Dilution 1/40
Mouse anti-human CD45RA AF700, clone HI100 BD 560673 Dilution 1/20
Mouse anti-human CD45RA PE-Cy7, clone HI100 BD 560675 Dilution 1/20
Mouse anti-human CD90 PE, clone 5E10 Biolegend 328110 Dilution 1/20
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X Life Technologies 10010001
Python
R
Sterile 12x75 mm conical polypropylene tubes Falcon
ZE5  Biorad Can be replaced with any flow cytometry analyzer equipped with a plate reader
Laboratory prepared
Cell culture media Depends from the specific experiment. Prepare fresh daily and store at +4 °C until use
DMEM + 10% FBS Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 50 mL of FBS to 450 mL DMEM
PBS 1X + EDTA 0.1% Can be stored in sterile conditions, at room temperature, up to 1 year. To prepare 500 mL, add 3.42 mL of EDTA 0.5 M to 500 mL PBS 1X
Staining buffer Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 2 mL of EDTA 0.5 M and 1 mL FBS to 500 mL PBS 1X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ginhoux, F., Yalin, A., Dutertre, C. A., Amit, I. Single-cell immunology: Past, present, and future. Immunity. 55 (3), 393-404 (2022).
  2. Ke, M., Elshenawy, B., Sheldon, H., Arora, A., Buffa, F. M. Single cell RNA-sequencing: A powerful yet still challenging technology to study cellular heterogeneity. Bioessays. 44 (11), 2200084 (2022).
  3. Regev, A., et al. The human cell atlas. Elife. 6, 27041 (2017).
  4. Laurenti, E., Göttgens, B. From haematopoietic stem cells to complex differentiation landscapes. Nature. 553 (7689), 418-426 (2018).
  5. Haas, S., Trumpp, A., Milsom, M. D. Causes and consequences of hematopoietic stem cell heterogeneity. Cell Stem Cell. 22 (5), 627-638 (2018).
  6. Loughran, S. J., Haas, S., Wilkinson, A. C., Klein, A. M., Brand, M. Lineage commitment of hematopoietic stem cells and progenitors: insights from recent single cell and lineage tracing technologies. Experimental Hematology. 88, 1-6 (2020).
  7. Perié, L., Duffy, K. R. Retracing the in vivo haematopoietic tree using single-cell methods. FEBS Letters. 590 (22), 4068-4083 (2016).
  8. Yu, V. W. C., et al. Epigenetic memory underlies cell-autonomous heterogeneous behavior of hematopoietic stem cells. Cell. 167 (5), 1310-1322 (2016).
  9. Ganuza, M., et al. Lifelong haematopoiesis is established by hundreds of precursors throughout mammalian ontogeny. Nature Cell Biology. 19 (10), 1153-1163 (2017).
  10. Naik, S. H., Schumacher, T. N., Perié, L. Cellular barcoding: A technical appraisal. Experimental Hematology. 42 (8), 598-608 (2014).
  11. Quek, L., et al. Genetically distinct leukemic stem cells in human CD34 − acute myeloid leukemia are arrested at a hemopoietic precursor-like stage. The Journal of Experimental Medicine. 213 (8), 1513-1535 (2016).
  12. Karamitros, D., et al. Single-cell analysis reveals the continuum of human lympho-myeloid progenitor cells. Nature Immunology. 19 (1), 85-97 (2018).
  13. Boitano, A. E., et al. Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells. Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).
  14. Delaney, C., et al. Notch-mediated expansion of human cord blood progenitor cells capable of rapid myeloid reconstitution. Nature Medicine. 16 (2), 232-236 (2010).
  15. Fares, I., et al. Cord blood expansion. Pyrimidoindole derivatives are agonists of human hematopoietic stem cell self-renewal. Science. 345 (6203), 1509-1512 (2014).
  16. Guo, B., Huang, X., Lee, M. R., Lee, S. A., Broxmeyer, H. E. Antagonism of PPAR-γ 3 signaling expands human hematopoietic stem and progenitor cells by enhancing glycolysis. Nature Medicine. 24 (3), 360-367 (2018).
  17. Vannini, N., et al. The NAD-booster nicotinamide riboside potently stimulates hematopoiesis through increased mitochondrial clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405-418 (2019).
  18. Gupta, R., et al. Nov/CCN3 enhances cord blood engraftment by rapidly recruiting latent human stem cell activity. Cell Stem Cell. 26 (4), 527-541 (2020).
  19. Horwitz, M. E., et al. Omidubicel vs standard myeloablative umbilical cord blood transplantation: results of a phase 3 randomized study. Blood. 138 (16), 1429-1440 (2021).
  20. Weinreb, C., Rodriguez-Fraticelli, A., Camargo, F. D., Klein, A. M. Lineage tracing on transcriptional landscapes links state to fate during differentiation. Science. 367 (6479), 3381 (2020).
  21. Loeffler, D., Schroeder, T. Understanding cell fate control by continuous single-cell quantification. Blood. 133 (13), 1406-1414 (2019).
  22. Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. Journal of Visualized Experiments. (70), e4287 (2012).
  23. Marchingo, J. M., et al. T-cell stimuli independently sum to regulate an inherited clonal division fate. Nature Communications. 7, 13540 (2016).
  24. Horton, M. B., et al. Multiplexed division tracking dyes for proliferation-based clonal lineage tracing. Journal of Immunology. 201 (3), 1097-1103 (2018).
  25. Lehmann, E. L., Romano, J. P., Casella, G. Testing statistical hypotheses. , Springer. New York. 784 (2005).
  26. Tak, T., et al. HSPCs display within-family homogeneity in differentiation and proliferation despite population heterogeneity. Elife. 10, 360624 (2021).
  27. Sommerkamp, P., et al. Mouse multipotent progenitor 5 cells are located at the interphase between hematopoietic stem and progenitor cells. Blood. 137 (23), 3218-3224 (2021).
  28. Kato, K., Radbruch, A. Isolation and characterization of CD34+ hematopoietic stem cells from human peripheral blood by high-gradient magnetic cell sorting. Cytometry. 14 (4), 384-392 (1993).
  29. Miltenyi, S., Müller, W., Weichel, W., Radbruch, A. High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry. 11 (2), 231-238 (1990).
  30. Doulatov, S., et al. Revised map of the human progenitor hierarchy shows the origin of macrophages and dendritic cells in early lymphoid development. Nature Immunology. 11 (7), 585-593 (2010).
  31. Goardon, N., et al. Coexistence of LMPP-like and GMP-like leukemia stem cells in acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 19 (1), 138-152 (2011).
  32. Laurenti, E., et al. CDK6 levels regulate quiescence exit in human hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 16 (3), 302-313 (2015).
  33. Aiuti, A., et al. Lentiviral hematopoietic stem cell gene therapy in patients with Wiskott-Aldrich syndrome. Science. 341 (6148), 1233151 (2013).
  34. Davison, A. C., Hinkley, D. V. Bootstrap Methods and their Application. , Cambridge University Press. (1997).
  35. Horton, M. B., et al. Lineage tracing reveals B cell antibody class switching is stochastic, cell-autonomous, and tuneable. Immunity. 55 (10), 1843-1855 (2022).
  36. Notta, F., et al. Distinct routes of lineage development reshape the human blood hierarchy across ontogeny. Science. 351 (6269), 2116 (2016).
  37. Grinenko, T., et al. Hematopoietic stem cells can differentiate into restricted myeloid progenitors before cell division in mice. Nature Communications. 9 (1), 1898 (2018).
  38. Saeys, Y., Van Gassen, S., Lambrecht, B. N. Computational flow cytometry: Helping to make sense of high-dimensional immunology data. Nature Reviews Immunology. 16 (7), 449-462 (2016).

Tags

Intrekking Nummer 193
Gelijktijdige beoordeling van verwantschap, delingsgetal en fenotype <em>via</em> flowcytometrie voor hematopoëtische stam- en voorlopercellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donada, A., Tak, T., Prevedello, G., … More

Donada, A., Tak, T., Prevedello, G., Milo, I., Duffy, K. R., Perié, L. Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (193), e64918, doi:10.3791/64918 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter