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Immunology and Infection

हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं के लिए फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से रिश्तेदारी, विभाजन संख्या और फेनोटाइप का एक साथ मूल्यांकन

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64918
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4, 1, 2, 1
1Quantitative Immuno-hematology, CNRS UMR168, Institut Curie, 2Hamilton Institute, Maynooth University, 3Institut Curie, PSL Research University, CNRS UMR 3348, Orsay, 4Université Paris-Sud, Université Paris-Saclay, CNRS UMR 3348, Orsay

Summary

यहां प्रस्तुत एक फ्लो साइटोमेट्री-आधारित तकनीक है जो एक साथ सेल डिवीजनों, सतह सेल फेनोटाइप और सेलुलर रिश्तेदारी की संख्या को मापने की अनुमति देती है। उन गुणों को क्रमपरिवर्तन-आधारित ढांचे का उपयोग करके सांख्यिकीय रूप से परीक्षण किया जा सकता है।

Abstract

कुछ तकनीकें एक ही सेल के लिए फेनोटाइप और भाग्य का एक साथ आकलन कर सकती हैं। फेनोटाइप को चिह्नित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले अधिकांश वर्तमान प्रोटोकॉल, हालांकि बड़े डेटासेट उत्पन्न करने में सक्षम हैं, रुचि के सेल के विनाश की आवश्यकता होती है, जिससे इसके कार्यात्मक भाग्य का आकलन करना असंभव हो जाता है। हेमटोपोइजिस जैसी विषम जैविक विभेदक प्रणालियों का वर्णन करना इसलिए मुश्किल है। सेल डिवीजन ट्रैकिंग रंगों पर निर्माण करते हुए, हमने कई एकल हेमटोपोइएटिक पूर्वजों के लिए रिश्तेदारी, विभाजन संख्या और भेदभाव की स्थिति को एक साथ निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया। यह प्रोटोकॉल विभिन्न जैविक स्रोतों से अलग मुराइन और मानव हेमटोपोइएटिक पूर्वजों की पूर्व विवो भेदभाव क्षमता के आकलन की अनुमति देता है। इसके अलावा, जैसा कि यह फ्लो साइटोमेट्री और सीमित संख्या में अभिकर्मकों पर आधारित है, यह अपेक्षाकृत सस्ती तरीके से एकल-सेल स्तर पर बड़ी मात्रा में डेटा उत्पन्न कर सकता है। हम एक मजबूत सांख्यिकीय ढांचे के साथ संयुक्त एकल-सेल विश्लेषण के लिए विश्लेषणात्मक पाइपलाइन भी प्रदान करते हैं। जैसा कि यह प्रोटोकॉल एकल-कोशिका स्तर पर कोशिका विभाजन और भेदभाव को जोड़ने की अनुमति देता है, इसका उपयोग मात्रात्मक रूप से सममित और असममित भाग्य प्रतिबद्धता, आत्म-नवीकरण और भेदभाव के बीच संतुलन और किसी दिए गए प्रतिबद्धता भाग्य के लिए विभाजन की संख्या का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल का उपयोग प्रयोगात्मक डिजाइनों में किया जा सकता है जिसका उद्देश्य एकल-कोशिका परिप्रेक्ष्य से हेमटोपोइएटिक पूर्वजों के बीच जैविक अंतर को उजागर करना है।

Introduction

पिछले दशक को सेलुलर और आणविक जीव विज्ञान के लिए एकल-कोशिका दृष्टिकोण के विश्वव्यापी प्रसार द्वारा चिह्नित किया गया था। एकल-कोशिका जीनोमिक्स1,2 के चरणों का पालन करते हुए, आजकल एक एकल कोशिका (जैसे, डीएनए, आरएनए, प्रोटीन) के कई घटकों का अध्ययन करना संभव है, जिसमें हर साल नई एकल कोशिका-ओमिक्स तकनीक ें बढ़ रही हैं। इन तकनीकों ने इम्यूनोलॉजी, न्यूरोबायोलॉजी, ऑन्कोलॉजी और अन्य के क्षेत्रों के लिए पुराने और नए प्रश्नों पर प्रकाश डाला है, दोनों मानव और मॉडल जीव कोशिकाओंका उपयोग करते हैं। व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच अंतर को उजागर करके, एकल सेल-ओमिक्स ने हेमटोपोइजिस के एक नए मॉडल की परिभाषा को प्रेरित किया, जो हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं (एचएसपीसी) की विविधता पर केंद्रित है और असतत सजातीय आबादी 4,5 के शास्त्रीय मॉडल से दूर जा रहा है।

सभी -ओमिक्स तकनीकों की कुछ कमियों में से एक रुचि के सेल का विनाश है, जो इसकी कार्यक्षमता का आकलन करने की संभावना को दर्शाता है। इसके विपरीत, अन्य एकल-कोशिका विधियां, जैसे एकल-कोशिका प्रत्यारोपण परख और वंश अनुरेखण प्रौद्योगिकियां, विवो 6,7 में व्यक्तिगत कोशिकाओं के भाग्य का आकलन करके पूर्वज कोशिका की कार्यक्षमता का रीडआउट प्रदान करती हैं। वंशावली अनुरेखण प्रौद्योगिकियों में एक आनुवंशिकआनुवंशिक 7 या फ्लोरोसेंट लेबल 8,9 के साथ रुचि के सेल को लेबल करना शामिल है, जिससे एक ही समय में कई एकल कोशिकाओं के भाग्य का पालन किया जा सकता है। हालांकि, शुरुआती कोशिकाओं का लक्षण वर्णन आमतौर पर मापदंडों की एक सीमित संख्या तक सीमित होता है, जैसे कि फ्लो साइटोमेट्री10 द्वारा मूल्यांकन किए गए कुछ सतह प्रोटीन की अभिव्यक्ति। इसके अलावा, एकल-कोशिका वंश अनुरेखण प्रौद्योगिकियों को सेलुलर लेबल का श्रमसाध्य पता लगाने की आवश्यकता होती है, आमतौर पर डीएनए / आरएनए अनुक्रमण या इमेजिंग के माध्यम से। यह अंतिम बिंदु विशेष रूप से उन स्थितियों की संख्या को सीमित करता है जिन्हें एक ही प्रयोग में परीक्षण किया जा सकता है।

एकल कोशिकाओं की कार्यक्षमता का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियों का एक अन्य वर्ग एकल एचएसपीसी की पूर्व विवो सेल संवर्धन प्रणाली है। प्रदर्शन करने में आसान, इन स्वर्ण मानक परखों में व्यक्तिगत कोशिकाओं को 96-वेल्स सेल कल्चर वाहिकाओं में क्रमबद्ध करना शामिल है, और संस्कृति के बाद, सेल संतति फेनोटाइप को चिह्नित करना, आमतौर पर फ्लो साइटोमेट्री या रूपात्मक विश्लेषण द्वारा। इन परखों का उपयोग ज्यादातर परिपक्व कोशिकाओं में एचएसपीसी के दीर्घकालिक भेदभाव को चिह्नित करने के लिए किया गया है, आमतौर पर संस्कृति11,12 के 2-3 सप्ताह के बाद। वैकल्पिक रूप से, उनका उपयोग मानव स्टेम सेल प्रत्यारोपण19 के लिए चिकित्सा लाभ के वादे के साथ पूर्व विवो एचएसपीसी 13,14,15,16,17,18 को बनाए रखने और विस्तारित करने की कोशिश करने के लिए किया गया है। अंत में, उनका उपयोग अल्पकालिक संस्कृति20 का उपयोग करके एचएसपीसी की प्रारंभिक प्रतिबद्धता का अध्ययन करने के लिए किया गया है, इस संस्कृति में उत्पन्न कोशिकाओं की कम संख्या मुख्य सीमित कारक है। इन विभिन्न प्रकार के पूर्व विवो परखों का एक दोष यह है कि वे केवल आंशिक रूप से विवो जटिलता को दर्शाते हैं; फिर भी, वे मानव एचएसपीसी भेदभाव का अध्ययन करने के दुर्लभ तरीकों में से एक हैं।

मौजूदा एकल-कोशिका विधियों (एकल सेल-ओमिक्स, वंश अनुरेखण और पूर्व विवो संस्कृति) से जानकारी का एक लापता टुकड़ा सेल डिवीजनों का सटीक पता लगाना है, एचएसपीसी डायनामिक्स21 का अध्ययन करते समय विचार करने के लिए एक आवश्यक पैरामीटर। फ्लो साइटोमेट्री के माध्यम से विभाजन की संख्या का आकलन करने का एक सरल तरीका घुलनशील "प्रोटीन रंजक" का उपयोग है, जैसे 5-(और 6)-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन डायसेटेट सक्सिनिमिडिल एस्टर (सीएफएसई)22। ये विभाजन रंजक दाग वाली कोशिकाओं के साइटोप्लाज्म के अंदर फैलते हैं, और आधे से पतला होते हैं और हर कोशिका विभाजन में दो बेटी कोशिकाओं में पारित होते हैं, जिससे 10 डिवीजनों तक की गणना करने की अनुमति मिलती है। कई विभाजन रंगों के संयोजन से, एक ही कुएं में कई अलग-अलग पूर्वजों को बीज देना संभव है, क्योंकि प्रत्येक व्यक्तिगत डाई विभिन्न वंशजों को अलग करने की अनुमति देता है। यह मल्टीप्लेक्स क्लोनल और डिवीजन-ट्रैकिंग के लिए सेल रंगों के उपयोग के पीछे का सिद्धांत है जिसे पहली बार मुराइन लिम्फोसाइट्स23,24 के लिए पेश किया गया था।

यहां, हम म्यूरिन और मानव एचएसपीसी के साथ उपयोग के लिए मल्टीजेन परख के विकास को प्रस्तुत करते हैं। यह विभेदन, विभाजन और रिश्तेदारी के गुणों के लिए एक साथ कई एकल कोशिकाओं के परीक्षण की अनुमति देता है। यह उच्च-थ्रूपुट, प्रदर्शन करने में आसान, और सस्ती परख सेलुलर फेनोटाइप, प्रदर्शन किए गए विभाजनों की संख्या, और सेल रिश्तेदारी और कुएं में अन्य कोशिकाओं के साथ क्लोनल संबंध को मापने की अनुमति देती है, सभी एक ही समय में। इसका उपयोग मात्रात्मक रूप से सममित और असममित भाग्य प्रतिबद्धता, आत्म-नवीकरण और भेदभाव के बीच संतुलन और किसी दिए गए प्रतिबद्धता भाग्य के लिए आवश्यक विभाजनों की संख्या का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। प्रोटोकॉल के लिए एक प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टर (एफएसीएस) और एक प्लेट रीडर के साथ एक फ्लो साइटोमीटर की आवश्यकता होती है, साथ ही सेल कल्चर करने के लिए आवश्यक उपकरण भी। मानव एचएसपीसी पर परख के निष्पादन के लिए तकनीकी प्रोटोकॉल के अलावा, हम विस्तृत विश्लेषण ढांचा भी प्रदान करते हैं, जिसमें सेल परिवार25 की अवधारणा से संबंधित सेलुलर गुणों का आकलन करने के लिए आवश्यक सांख्यिकीय परीक्षण शामिल है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग पहले से ही मुराइन एचएसपीसी डिब्बे26,27 का वर्णन करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है।

निम्नलिखित प्रोटोकॉल प्रारंभिक सामग्री28 के रूप में चुंबकीय रूप से समृद्ध सीडी 34 + कोशिकाओं का उपयोग करता है। इस तरह, विभिन्न रक्त स्रोतों (जैसे, गर्भनाल रक्त, अस्थि मज्जा, परिधीय रक्त) से मानव एचएसपीसी को कुशलतापूर्वक दाग और अलग करना संभव है। सीडी 34- अंश को त्यागना महत्वपूर्ण नहीं है, क्योंकि इसका उपयोग विभिन्न प्रकार के प्रयोगात्मक नियंत्रणों को सेट करने के लिए प्रोटोकॉल के हिस्से के रूप में किया जाएगा। प्रयोगात्मक वर्कफ़्लो और आवश्यकताओं के अनुसार, उल्लिखित सेल मात्रा और वॉल्यूम को ऊपर या नीचे बढ़ाया जा सकता है। इसी तरह, प्रोटोकॉल को विभिन्न प्रकार के पूर्वजों के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, बस सेल सॉर्टिंग और फ्लो साइटोमेट्री चरणों के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी को संशोधित करके।

Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए, डी-आइडेंटिफाइड गर्भनाल रक्त का उपयोग एचएसपीसी स्रोत के रूप में किया गया था और सेंट-लुइस अस्पताल कॉर्ड ब्लड बायोबैंक (प्राधिकरण एसी -2016-2759) और हेलसिंकी की घोषणा के साथ परिभाषित दिशानिर्देशों के अनुसार एकत्र किया गया था।

नोट: शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि इस प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक सभी अभिकर्मक और उपकरण उपलब्ध हैं, जैसा कि सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध है और प्रोटोकॉल में उल्लिखित है। संबंधित अभिकर्मकों को ताजा तैयार करें और उन्हें स्टोर न करें, जब तक कि स्पष्ट रूप से उल्लेख न किया गया हो।

1. सेल डाई धुंधला

नोट: यह खंड सीएफएसई और वायलेट डाई (सीटीवी) सेल डिवीजन रंगों के चार संयोजनों के साथ धुंधला होने का वर्णन करता है। सभी ट्यूबों को एक साथ संसाधित करें, भले ही कोई सेल डाई समाधान न जोड़ा जाए। निम्नलिखित सेल कल्चर चरण की अनुमति देने के लिए सभी चरणों को बाँझ स्थितियों में किया जाता है। आवश्यक समय: लगभग 100 मिनट।

  1. चुंबकीय सॉर्टिंग प्रोटोकॉल29 के अनुसार कॉर्ड रक्त इकाई को संसाधित करें। सुनिश्चित करें कि दो अंश उपलब्ध हैं: एक बड़ा CD34- अंश और एक छोटा CD34+ अंश। दोनों ट्यूबों को 300 x g पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें। गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को उत्तेजित करें।
  2. सीडी 34 + अंश के लिए, भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के बिना डलबेकको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के 1 एमएल में इसे फिर से निलंबित करें। हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें; सेल घनत्व 3 x 106 सेल / एमएल से अधिक नहीं होना चाहिए। यदि यह मामला है, तो तदनुसार वॉल्यूम को अनुकूलित करें। CD34- अंश के लिए, DMEM w/o FBS में पुन: निलंबन करें, और वॉल्यूम को अधिकतम 6 x 106 कोशिकाओं /mL तक समायोजित करें।
  3. सीडी 34+ अंश के एलिकोट 250 μL को चार 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में विभाजित करें। ट्यूबों को निम्नानुसार लेबल करें: CD34+/CF (CFSE_only), CD34+/CV (CFSE_high CTV_low), CD34+/VC (CFSE_low CTV_high), और CD34+/VI (CTV_high). सीडी 34 के एलिकोट 250 μL- अंश को अन्य चार 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में विभाजित करें। ट्यूबों को निम्नानुसार लेबल करें: CD34-/CF (CFSE_only), CD34-/CV (CFSE_high CTV_low), CD34-/VC (CFSE_low CTV_high), और CD34-/VI (CTV_high). सीडी 34- अंश से शेष कोशिकाओं को त्याग दिया जा सकता है।
  4. दो सीएफएसई समाधान तैयार करें, जिनका नाम CFSE_high और CFSE_low है। CFSE_high (10 μM) के लिए, 1.1 mL DMEM w/o FBS को CFSE स्टॉक (5 mM) समाधान के 2.2 μL के साथ मिलाएं। CFSE_low (5 μM) के लिए, 550 μL DMEM w/o FBS और 0.55 μL CFSE स्टॉक (5 mM) घोल मिलाएं।
  5. सीएफ और सीवी ट्यूबों में CFSE_high समाधान के 250 μL, VC ट्यूबों के लिए CFSE_low समाधान के 250 μL, और VI ट्यूब में FBS के लिए DMEM के 250 μL जोड़ें। सेल सस्पेंशन और सेल डाई का एक कुशल मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए, ट्यूब को लगभग 90 डिग्री तक झुकाएं, और ट्यूब की दीवार पर सीएफएसई समाधान जमा करें। फिर, दो समाधानों को मिलाने के लिए ट्यूब को लंबवत रखें, और पुन: निलंबित कोशिकाओं के साथ सीएफएसई समाधानों के तेजी से मिश्रण को सुनिश्चित करने के लिए तीन या चार बार पिपेट करें। ठीक 8 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. इनक्यूबेशन के बाद, डीएमईएम + 10% एफबीएस के 5 एमएल जोड़ें। ट्यूबों को 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  7. ट्यूबों को 300 x g पर 5 मिनट के लिए स्पिन करें। गोली को परेशान किए बिना आकांक्षा के माध्यम से सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और गोली को 5 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन 1x / एथिलीनडायमाइनटेट्राएसिटिक एसिड (पीबीएस 1एक्स / ईडीटीए) के साथ धो लें। 300 x g पर 5 मिनट के लिए फिर से स्पिन करें। गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को छोड़ दें, और सेल गोली को 1x PBS / EDTA के 250 μL में फिर से निलंबित करें।
  8. दो सीटीवी समाधान तैयार करें, जिनका नाम CTV_high और CTV_low है। CTV_high (10 μM) के लिए, 1.1 mL PBS 1x/EDTA और 2.2 μL CTV स्टॉक (5 mM) मिलाएं। CTV_low (5 μM) के लिए, 550 μL PBS 1x/EDTA को 0.55 μL CTV स्टॉक (5 mM) के साथ मिलाएं।
  9. VC और VI ट्यूबों में CTV_high समाधान के 250 μL, CV ट्यूब के CTV_low समाधान के 250 μL, और CF ट्यूब में 1x PBS / EDTA के 250 μL जोड़ें। चरण 1.5 में वर्णित एक ही तकनीक का उपयोग करें। ठीक 8 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  10. इनक्यूबेशन के बाद, डीएमईएम + 10% एफबीएस के 5 एमएल जोड़ें। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  11. ट्यूबों को 300 x g पर 5 मिनट के लिए घुमाएं, गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरने वाले को छोड़ दें, और फिर 1x PBS / EDTA के 5 मिलीलीटर के साथ गोली को धो लें। 300 x g पर 5 मिनट के लिए फिर से स्पिन करें।
  12. गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटा दें, और 1.5 x 106 कोशिकाओं / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए 1x PBS / EDTA में CD34- अंशों को फिर से निलंबित करें। 40 μL धुंधला बफर में CD34+ अंशों को पुन: निलंबित करें, और कोशिकाओं को 1.5 mL ट्यूबों में स्थानांतरित करें।

2. एंटीबॉडी धुंधला होना

नोट: एंटीबॉडी धुंधला प्रयोगात्मक आवश्यकताओं के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है। केवल सीडी 34+ अंश एंटीबॉडी धुंधला पन से गुजरते हैं; सीडी 34- अंशों का उपयोग कोशिका विभाजन डाई संयोजनों (सीवी, वीसी, सीएफ, और वीआई अंशों) के लिए एकल धुंधला नियंत्रण के रूप में किया जाता है। निम्नलिखित पैनल चार प्रकार के एचएसपीसी का पता लगाने के लिए तैयार किया गया है: हेमटोपोइएटिक स्टेम सेल (एचएससी), मल्टीपोटेंट पूर्वज (एमपीपी), लिम्फोइड-प्राइमेड मल्टीपोटेंट पूर्वज (एलएमपीपी), और हेमटोपोइएटिक पूर्वज कोशिकाएं (एचपीसी)12। तथापि, एचएससी और एमपीपी की पहचान प्रस्तुत की गई है। आवश्यक समय: 75 मिनट।

  1. मुआवजे के मोतियों का उपयोग करके, सतह के धुंधलापन के लिए एकल धुंधलापन तैयार करें। नकारात्मक मोतियों और इम्युनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) मोतियों को 1: 1 अनुपात में मिलाएं, कुल मात्रा के लिए 20 μL x सतह मार्करों की संख्या (उदाहरण के लिए, 120 μL यदि धुंधला पैनल में छह एंटीबॉडी हैं)।
  2. प्रत्येक मार्कर के लिए अलग-अलग 1.5 एमएल ट्यूबों में 20 μL मोती भेजें। संबंधित ट्यूब में प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए कमजोर पड़ने वाले कारक के अनुरूप मात्रा जोड़ें (उदाहरण के लिए, यदि कमजोर पड़ने वाला कारक 1: 20 है, तो 1 μL जोड़ें)।
  3. सीडी 34+ कोशिकाओं को दागने के लिए, तालिका 1 के आधार पर एंटीबॉडी12 का एक मास्टर मिश्रण तैयार करें। एंटीबॉडी को एक 0.5 एमएल ट्यूब में मिलाएं। चार सीडी 34+ स्थितियों में से प्रत्येक में एंटीबॉडी मास्टर मिश्रण से 7 μL जोड़ें।
  4. मुआवजा मोतियों और सीडी 34 + नमूनों को कम से कम 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: इनक्यूबेशन समय को धुंधला करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के तकनीकी विवरण के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  5. इनक्यूबेशन दौरान, छंटाई के लिए उपयोग की जाने वाली 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे प्लेट तैयार करें, मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करके प्रत्येक कुएं में 100 μL सेल कल्चर माध्यम जोड़ें।
    नोट: कुएं H8-H12 खाली छोड़ दें।
  6. सतह धुंधला नियंत्रण (5, मोतियों का उपयोग करके), कोशिका विभाजन रंजक नियंत्रण (4, सीडी 34- अंशों का उपयोग करके), और सीडी 34+ नमूने (4) के लिए 5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब लेबल करें।
  7. इनक्यूबेशन के अंत में, कोशिकाओं और मोतियों को 1 एमएल धुंधला बफर के साथ धो लें। कुल मात्रा को 5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में स्थानांतरित करें। ट्यूबों को 300 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, फिर गोली को परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला की इच्छा करें।
  8. मोतियों और सीडी 34+ कोशिकाओं के लिए लगभग 500 μL और CD34- ट्यूबों के लिए 1 mL का उपयोग करके, बफर को धुंधला करने में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें।

तालिका 1: सेल सॉर्टिंग प्रयोग के लिए एंटीबॉडी मास्टरमिक्स तैयार करने के लिए टेम्पलेट। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

3. सेल सॉर्टिंग

नोट: सॉर्ट किए गए सेल नंबर उपलब्ध कोशिकाओं की कुल मात्रा के अनुसार भिन्न हो सकते हैं। प्रोटोकॉल में, प्रत्येक नियंत्रण के लिए एक न्यूनतम सेल नंबर प्रदान किया जाता है। आवश्यक समय (एक प्लेट के लिए): 100 मिनट।

  1. टेम्पलेट प्रयोग खोलें या कोई नया प्रयोग सेट करें. एक एकल नमूना और कई ट्यूब बनाएं, प्रत्येक स्थिति के अनुसार एक।
  2. चित्रा 1 में विस्तृत गेटिंग रणनीति सेट करें, छह डॉट प्लॉट आरेख बनाएं। सबसे पहले, एफएससी-ए / एसएससी-ए डॉट प्लॉट पर कोशिकाओं की कल्पना करें, और कम साइड स्कैटर (चित्रा 1 ए) वाली आबादी का चयन करने के लिए बहुभुज गेटिंग टूल पर डबल क्लिक करें। निम्नलिखित डॉट प्लॉट (एफएससी-ए / एफएससी-एच) में, प्लॉट पर राइट क्लिक करें और उस पर क्लिक करके ड्रॉपडाउन मेनू से गेट "सेल" का चयन करें। दो अक्ष (चित्रा 1 बी) के बीच विकर्ण पर एक तंग आबादी का चयन करने के लिए एक ही गेटिंग टूल का उपयोग करें।
  3. तीसरे डॉट प्लॉट (एपीसी बनाम एफएसएच-एच) में, जनसंख्या "एकल कोशिकाओं" को प्रदर्शित करें और एपीसी वंश (लिन) (चित्रा 1 सी) की अभिव्यक्ति के लिए नकारात्मक कोशिकाओं को गेट करें। चौथे प्लॉट (सीएफएसई बनाम सीटीवी) में, जनसंख्या "लिन-" प्रदर्शित करें और चार अलग-अलग गेट बनाएं, प्रत्येक डाई संयोजन के लिए एक (चित्रा 1 डी)।
    नोट: सजातीय रूप से सना कोशिकाओं के केवल एक छोटे से अंश का चयन करने के लिए, इन द्वारों को तंग होना चाहिए।
  4. रुचि के पूर्वजों की पहचान करने के लिए पांचवें और छठे प्लॉट (एपीसी-Cy7 बनाम BV650 और PE-Cy7 बनाम PE) का उपयोग करें। पांचवें प्लॉट में CD34+CD38- जनसंख्या और CD34+CD38+ को उदारतापूर्वक गेट करें (चित्र 1E)। फिर, छठे प्लॉट में CD34 + CD38- जनसंख्या का चयन करें, और चित्र 1F के अनुसार तीन द्वार खींचें।
  5. क्षतिपूर्ति मोतियों वाले एकल धुंधला ट्यूब चलाएं, अधिग्रहण बटन पर क्लिक करें। पैरामीटर ड्रॉपडाउन मेनू से फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब (पीएमटी) वोल्टेज को समायोजित करें, विशेष रूप से सेल डिवीजन रंगों के लिए (द्विघातीय पैमाने पर 104 और 105 के बीच)।
  6. मुआवजा टैब का उपयोग करके सॉर्टिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले पैनल के अनुसार मुआवजा मैट्रिक्स को परिष्कृत करें। रिकॉर्ड बटन पर क्लिक करते हुए, मोतियों के गेट में कम से कम 5,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें।
  7. सीडी 34- अंश चलाएं और मुआवजा मैट्रिक्स को फिर से जांचें। एकल-सेल गेट में कम से कम 10,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करें।
  8. एकल-सेल गेट में कम से कम 5,000 घटनाओं को रिकॉर्ड करते हुए सीडी 34+ अंशों को चलाएं। प्रत्येक डाई संयोजन के लिए गेट को समायोजित करें, एक सजातीय आबादी का चयन करने के लिए एक तंग गेट सेट करें (चित्रा 1 डी)। इसी तरह, एचएससी और एमपीपी का चयन करने के लिए गेटिंग को समायोजित करें।
  9. एक बार विश्लेषण पूरा हो जाने और सभी ट्यूबों को रिकॉर्ड करने के बाद, 96-वेल प्लेटों पर छंटाई के लिए मानक एरिया अंशांकन करने के बाद, प्लेट को उपयुक्त धारक में डालें। प्लेट को ठंडा करने की सलाह दी जाती है।
  10. प्रयोग सॉर्ट लेआउट का उपयोग करते हुए, तालिका 2 में प्रस्तुत योजना के अनुसार प्लेट सॉर्टिंग टेम्पलेट तैयार करें। "सीडी 34-" नामक कुओं में 5,000-10,000 कोशिकाएं होती हैं, जिन्हें सीएफ / सीवी / वीसी / वीआई गेट पर क्रमबद्ध किया जाता है। "बल्क" कुओं में कम से कम 500 कोशिकाएं होती हैं, जिन्हें गेट CD34 + CD38- पर क्रमबद्ध किया जाता है। अंत में, एकल-कोशिका कुओं में प्रति कोशिका विभाजन डाई संयोजन में केवल एक घटना होती है, इसलिए कुल मिलाकर प्रति अच्छी तरह से चार घटनाएं होती हैं।
    नोट: "थोक" आबादी को विशिष्ट पूर्वजों के उप-समूह के लिए अनुकूलित किया जा सकता है; 500 से कम कक्षों को सॉर्ट न करें।
  11. छंटाई के लिए, क्रम में आगे बढ़ें, अगले एक पर जाने से पहले हर सेल डिवीजन डाई संयोजन को पूरा करें। उदाहरण के लिए, उपज शुद्धता मोड में सीडी 34- सीएफ को सॉर्ट करने के साथ शुरू करें। अधिग्रहण बटन पर क्लिक करें, फिर सॉर्ट बटन पर।
  12. CD34- सॉर्टिंग के अंत में, CF CD34+ ट्यूब डालें। प्राप्त करें, फिर सॉर्ट बटन पर क्लिक करें, सुनिश्चित करें कि 0/ 16/0 शुद्धता ग्रेड के रूप में टिक किया गया है। अंत में, एकल-सेल शुद्धता में रुचि की कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें, एक सेल प्रति अच्छी तरह से, इंडेक्स सॉर्टिंग विकल्प को टिक करना सुनिश्चित करें।
  13. उसी क्रम को दोहराते हुए निम्नलिखित सेल डिवीजन डाई संयोजन पर जाएं। संदर्भ के रूप में, तालिका 2 एक क्रमबद्ध प्लेट का एक उदाहरण प्रदान करती है।
    नोट: अनुक्रमणिका सॉर्टिंग फ़ंक्शन प्रत्येक क्रमबद्ध स्थिति के लिए अलग-अलग फ़ाइलें उत्पन्न करता है।
  14. सॉर्टिंग के अंत में, फ़ाइलों को .fcs 3.0 फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें। कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें। कोशिकाओं को प्रयोगात्मक डिजाइन के अनुसार, कम से कम 24 घंटे26 के लिए कई दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जाता है।

तालिका 2: लगातार प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए विशिष्ट आवश्यकताओं के आधार पर 96-वेल प्लेट को सॉर्ट करने वाले सेल के लिए टेम्पलेट। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

4. सेल सॉर्टिंग डेटा विश्लेषण

नोट: सेल सॉर्टिंग की गुणवत्ता को मान्य करने के लिए, आगे बढ़ने से पहले एफएसीएस डेटा विश्लेषण आवश्यक है। इस चरण का मुख्य आउटपुट एक स्प्रेडशीट की पीढ़ी है जिसमें प्रत्येक क्रमबद्ध व्यक्तिगत सेल की मार्कर तीव्रता होती है।

  1. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में .fcs 3.0 फ़ाइलें अपलोड करें।
  2. वास्तविक सॉर्टिंग से पहले रिकॉर्ड की गई एकल धुंधला फ़ाइलों का उपयोग करके, सेल सॉर्टिंग के दौरान उपयोग की जाने वाली मुआवजा सेटिंग को सत्यापित करें।
  3. विभिन्न थोक के अनुरूप फ़ाइलों का उपयोग करके संशोधित गेटिंग रणनीति सेट करें। अनुक्रमणिका सॉर्टिंग फ़ाइलों पर उन द्वारों की प्रतिलिपि बनाएँ और चिपकाएँ.
  4. जाँचें कि अनुक्रमणिका क्रमबद्ध कक्ष सेट गेट में गिर गए हैं. यदि कुछ क्रमबद्ध कोशिकाएं हैं जिन्हें गलत तरीके से गेट किया गया था, तो उन्हें इंडेक्स सॉर्टिंग के दौरान दर्ज किए गए प्लेट निर्देशांक को निर्यात करके पहचाना जा सकता है, और बाद में विश्लेषण में हटा दिया जा सकता है।
  5. अनुक्रमणिका सॉर्टिंग फ़ाइलों से इवेंट को क्षतिपूर्ति पैरामीटर के रूप में निर्यात करें. उन्हें .csv फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें, विकल्पों "स्केल मानों" और "क्षतिपूर्ति पैरामीटर" पर टिक करें। इन फ़ाइलों को "निर्यात की गई फ़ाइलें" नामक फ़ोल्डर में निर्यात किया जाना चाहिए।
  6. पूरक फ़ाइल 1 में स्क्रिप्ट का उपयोग करते हुए, सभी फ़ाइलों को एक ही .csv फ़ाइल में संयोजित करें। फ़ंक्शन "setwd" के साथ सही पथ सेट करें। इस स्क्रिप्ट का आउटपुट एक स्प्रेडशीट है जिसमें सभी अलग-अलग गेटेड घटनाएं और सभी मापदंडों के लिए सापेक्ष तीव्रता होती है।

5. कल्चर एंटीबॉडी धुंधला होने के बाद।

नोट: बाँझ स्थितियों में प्रोटोकॉल के इस हिस्से का प्रदर्शन करें; कई अभिकर्मकों को पूर्व चरणों के साथ साझा किया जाता है, और बाँझ रहने की आवश्यकता होती है। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए, प्लेट रीडर के साथ फ्लो साइटोमीटर का उपयोग करें। यह ऊतक संवर्धन प्लेट में सीधे धुंधलापन करने की अनुमति देता है, पाइपिंग और स्पिनिंग की मात्रा को सीमित करके सेल हानि को कम से कम करता है। कुएं ए 1-ए 4 को छोड़कर, क्षतिपूर्ति मोतियों का उपयोग करके सतह मार्कर एकल रंग धुंधला तैयार करें, जो सीएफ / सीवी / वीसी / वीआई रंगों के लिए एकल धुंधलापन का प्रतिनिधित्व करते हैं और पहले से ही 96-वेल प्लेट में मौजूद हैं। सेल डाई के अनुसार क्रमबद्ध थोक आबादी डिवीजनों की संख्या और सामान्य गेटिंग के लिए गेटिंग रणनीति निर्धारित करने में मदद करती है। समय की आवश्यकता: 120 मिनट।

  1. प्रोटोकॉल शुरू करने से पहले, उल्टे माइक्रोस्कोप के तहत प्लेट की जांच करके उन कुओं को चिह्नित करें जिनमें कम से कम एक सेल हो। यह कदम धुंधला होने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी की मात्रा को अनुकूलित करने की अनुमति देता है और प्रक्रिया को गति देता है।
  2. तालिका 3 के अनुसार, एंटीबॉडी मास्टरमिक्स तैयार करें। चूंकि पाइपिंग की एक महत्वपूर्ण मात्रा है, तालिका पाइपिंग के कारण तकनीकी त्रुटि पर विचार करती है, जिसमें अतिरिक्त 5% मात्रा शामिल है। तालिका में वर्णित एंटीबॉडी मानव गर्भनालरक्त के नमूनों से एचएसपीसी की एक श्रृंखला को चिह्नित करने की अनुमति देते हैं।
  3. प्लेट को 300 x g पर 5 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। सतह पर तैरने वाले को हटाने के लिए, प्लेट को हुड के नीचे और पेपर टॉवल पर तेजी से घुमाएं।
  4. कुओं A1-A4 में धुंधला बफर के 8 μL जोड़ें। मिश्रण के 8 μL अन्य कुओं में जोड़ें।
  5. 120 μL के बराबर कुल मात्रा के लिए 1: 1 अनुपात में नकारात्मक मोती और आईजीजी मुआवजा मोती मिलाएं। प्रत्येक मार्कर के लिए एक 1.5 एमएल ट्यूब में 20 μL भेजें। कमजोर पड़ने वाले कारक के अनुरूप एंटीबॉडी की मात्रा जोड़ें (उदाहरण के लिए, यदि कमजोर पड़ने वाला कारक 1: 20 है, तो 1 μL जोड़ें)।
    नोट: धुंधला होने के लिए उपयोग किए जाने वाले मार्करों की संख्या के लिए कुल मात्रा को अनुकूलित करें (उदाहरण के लिए, 100 μL यदि धुंधला पैनल में पांच एंटीबॉडी हैं)।
  6. प्लेट और एकल धुंधला मुआवजा नियंत्रण को कम से कम 30 मिनट के लिए +4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: इनक्यूबेशन समय को धुंधला करने के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के तकनीकी विवरण के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए।
  7. मोतियों को 1 एमएल धुंधला बफर के साथ धो लें। कुल मात्रा को पहले लेबल किए गए 5 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में स्थानांतरित करें। 300 x g पर 5 मिनट के लिए ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करें, फिर एस्पिरेशन के माध्यम से सुपरनैटेंट को हटा दें।
  8. मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके प्रति कुएं 100 μL धुंधला बफर जोड़कर प्लेट में कोशिकाओं को धोएं। प्लेट को 5 मिनट के लिए 300 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें, फिर सतह पर तैरने वाले को हटाने के लिए प्लेट को हुड के नीचे और पेपर टॉवल पर तेजी से घुमाएं।
  9. मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके, बफर को धुंधला करने के 85 μL में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें।
  10. समर्पित टेम्पलेट का उपयोग करके और कस्टम पर क्लिक करके, फ्लो साइटोमीटर (अधिग्रहण मोड) पर विश्लेषण शुरू करें। यह अनुकूलित टेम्पलेट 96-अच्छी तरह से गोल-नीचे प्लेट की तकनीकी विशेषताओं को ध्यान में रखता है, विशेष रूप से प्रत्येक कुएं के आयाम (व्यास, गहराई और मोटाई)। जांच को कुएं के तल तक पहुंचना चाहिए, इसलिए इसे कुएं ए 1 और एच 12 के सटीक केंद्र पर सेट करें।
  11. सॉफ्टवेयर द्वारा प्रस्तावित सूची से रुचि के फ्लोरोफोर का चयन करने के बाद, तालिका 2 के प्लेट टेम्पलेट का पालन करते हुए प्लेट सेटअप सेट करें, जिसमें कम से कम एक सेल वाले कुओं की संख्या के लिए सही किया गया है।
  12. अधिग्रहण वॉल्यूम सीमा के रूप में 100 μL का चयन करें। आंदोलन विकल्प पर टिक करें। अधिग्रहण दर को 1 μL / s अधिकतम पर सेट करें, क्योंकि कम गति प्रति कुएं विश्लेषण की गई कुल मात्रा में सुधार करती है।
  13. कुओं H8-H12 में उपयुक्त सफाई और धोने के समाधान जोड़ें। तालिका 2 में टेम्पलेट विशेष रूप से कुएं एच 8-एच 12 को खाली छोड़ देता है, क्योंकि प्रवाह साइटोमीटर को विश्लेषण के अंत में धोने की स्थिति की एक श्रृंखला चलाने की आवश्यकता होती है।
    नोट: यह चरण उपयोग किए गए प्रवाह साइटोमीटर की बारीकियों के लिए अनुकूलित है।
  14. प्लॉट और गेट सेक्शन में, पहले एफएससी-ए/एसएससी-ए स्कैटरप्लॉट का उपयोग करके सिंगल-सेल गेट सेट करें, फिर एफएससी-एच/एफएससी-ए स्कैटरप्लॉट का उपयोग करें। रुचि के प्रत्येक मार्कर के लिए एक हिस्टोग्राम बनाएं।
  15. एक बार सेटिंग्स की पुष्टि हो जाने के बाद, विश्लेषण अनुभाग पर आगे बढ़ें। पहले एकल धुंधलापन का विश्लेषण करें, मुआवजे के मोतियों और सीडी 34- दाग वाले अंशों के लिए कम से कम 5,000 घटनाओं (इष्टतम सीमा: 5,000-15,000 घटनाओं) को रिकॉर्ड करें। यदि आवश्यक हो तो वोल्टेज समायोजित करें।
  16. एक बार एकल धुंधला पन दर्ज होने के बाद, अधिग्रहण फ़ंक्शन पर क्लिक करके वास्तविक अधिग्रहण शुरू करना संभव है।

तालिका 3: फ्लो साइटोमेट्री प्रयोग के लिए एंटीबॉडी मास्टरमिक्स, विशेष रूप से मानव गर्भनाल रक्त से एचएसपीसी की पहचान के लिए। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

6. पोस्ट-कल्चर फ्लो साइटोमेट्री डेटा विश्लेषण।

नोट: वर्णित डेटा विश्लेषण सामग्री की तालिका में उल्लिखित सॉफ़्टवेयर के लिए विशिष्ट है। मुख्य आउटपुट एक स्प्रेडशीट की पीढ़ी है जिसमें सतह मार्कर तीव्रता, डिवीजनों की संख्या और प्रत्येक विश्लेषण किए गए सेल के लिए रिश्तेदारी के लिए जानकारी होती है। प्रोटोकॉल के इस भाग में शामिल आर में लिखी गई एक स्क्रिप्ट है, जो अंतिम विश्लेषण स्प्रेडशीट उत्पन्न करने के लिए इस वर्कफ़्लो के लिए आवश्यक है।

  1. प्रवाह साइटोमीटर से फ़ाइलों को .fcs फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें। उन्हें विश्लेषण सॉफ़्टवेयर पर अपलोड करें, उन्हें "सिंगल स्टेनिंग", "थोक" और "सिंगल सेल" के रूप में एक साथ समूहीकृत करें।
  2. एकल धुंधला फ़ाइलों का उपयोग करके एक मुआवजा मैट्रिक्स तैयार करें, और इसे ड्रैग और ड्रॉप द्वारा अन्य दो समूहों पर लागू करें।
    नोट: यदि एक स्वचालित मुआवजा उपकरण का उपयोग किया जाता है, तो आगे बढ़ने से पहले हाथ से गुणवत्ता की जांच करें।
  3. एक प्रतिनिधि गेटिंग करने के लिए, एक ही फ़ाइल में विभिन्न थोक कुओं को व्यवस्थित करें। यह कदम तेजी से इस बात पर प्रकाश डालता है कि क्या दो रंग अतिव्यापी हैं (आमतौर पर सीवी और वीसी) या अन्य विसंगतियां, और इसलिए उन्हें बाहर रखने की आवश्यकता है। कॉन्केटेनेट आबादी विकल्प पर क्लिक करने के बाद, "पैरामीटर" मेनू से सभी क्षतिपूर्ति रहित मापदंडों का चयन करें, फिर कॉन्केटेनेट पर क्लिक करें।
  4. कॉन्केटेनेटेड फ़ाइल को कार्यस्थान पर अपलोड करें, फिर ड्रैग एंड ड्रॉप के माध्यम से मुआवजा मैट्रिक्स लागू करें।
  5. कॉन्केटेनेटेड फ़ाइल का उपयोग करके चित्रा 2 में परिभाषित गेटिंग रणनीति तैयार करें। एकल-सेल गेट में, सीएफएसई और सीटीवी के साथ स्कैटर प्लॉट पर घटनाओं को प्रदर्शित करें। लेबल नामक एक पहला गेट बनाएं, जिसमें सभी चार रंग शामिल हैं और संभावित ऑटो-फ्लोरेसेंस (चित्रा 2 सी) को छोड़कर। फिर, प्रत्येक रंग को अलग-अलग गेट करें।
  6. सीवी और वीसी के साथ लेबल किए गए कोशिकाओं को एक रूपांतरित मूल्य की आवश्यकता होती है, यह देखते हुए कि रंग सीएफएसई और सीटीवी संकेतों का परिणाम है। इसलिए दो समन्वित संकेतों को 45 ° द्वारा लघुगणकीय पैमाने पर घुमाया जाता है, ताकि विभाजन कमजोर पड़ने को एक्स-अक्ष के समानांतर आगे बढ़ने की अनुमति मिल सके। यह रूपांतरित मान मैन्युअल रूप से प्राप्त किया जाता है, उपकरण पर क्लिक करें और फिर पैरामीटर प्राप्त करें। सूत्र बॉक्स में निम्न सूत्र चिपकाएँ:
    Equation 1
    नोट: समीकरण26 मानता है कि सीएफएसई और सीटीवी पैरामीटर 03 और 17 हैं।
  7. व्युत्पन्न पैरामीटर नामक इस उपन्यास पैरामीटर को सही ढंग से कल्पना करने के लिए, ~ 3-7 तक एक रैखिक अक्ष सेट करें, एक्सिस पैरामीटर विकल्प पर क्लिक करें और अनुकूलित अक्ष का चयन करें।
  8. प्रत्येक रंग पर गेटिंग को हिस्टोग्राम प्लॉट के रूप में व्यक्तिगत रूप से लागू करें: सीएफ और वीआई के लिए, क्रमशः एक्स-अक्ष पर सीएफएसई-ए और सीटीवी-ए सेट करें। CV और VC के लिए, x-अक्ष पर नया व्युत्पन्न पैरामीटर सेट करें। प्रत्येक चोटी के अनुरूप गेट सेट करें, जैसा कि चित्र 3 में प्रदर्शित किया गया है।
  9. गेटिंग को प्रत्येक एकल-कोशिका पर अच्छी तरह से लागू करें। प्रत्येक विश्लेषण किए गए कुएं में व्युत्पन्न पैरामीटर जोड़ना सुनिश्चित करें। प्रत्येक कुएं के लिए प्रत्येक रंग द्वार को मैन्युअल रूप से सत्यापित करें, उन घटनाओं का पता लगाने के लिए जो किसी दिए गए शिखर को गलत तरीके से असाइन की गई हैं। गेटिंग के उदाहरण चित्र 4 में प्रदर्शित किए गए हैं।
  10. विश्लेषण पूरा होने के बाद, और सभी कुओं को सत्यापित करने के बाद, उन सभी CF/CV/VC/VI द्वारों का चयन करें जिनमें कम से कम एक सेल हो। उन्हें .csv फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें, विकल्पों "स्केल मानों" और "क्षतिपूर्ति पैरामीटर" पर टिक करें। इन फ़ाइलों को "निर्यात की गई फ़ाइलें" नामक फ़ोल्डर में निर्यात किया जाता है।
  11. पूरक फ़ाइल 1 में आर स्क्रिप्ट का उपयोग करते हुए, सभी फ़ाइलों को एक ही .csv में संयोजित करें। फ़ंक्शन "सेटड" के साथ सही पथ निर्धारित करना याद रखें। इस स्क्रिप्ट का आउटपुट एक स्प्रेडशीट है जिसमें सभी अलग-अलग गेटेड घटनाएं और सभी मापदंडों के लिए सापेक्ष तीव्रता होती है।
  12. स्प्रेडशीट खोलें और प्रत्येक पैरामीटर के लिए स्तंभों का नाम बदलें, उदाहरण के लिए, निम्न नामों का उपयोग करके: CFSE, CTV, CD90, CD123, CD45RA, CD34, CD38. इन नामों का उपयोग गेटिंग थ्रेशोल्ड की पहचान करने के लिए किया जाएगा ताकि प्रत्येक सेल को उनकी पहचान सही ढंग से असाइन की जा सके।
  13. "वेल", "कंडीशन", "कलर", "जनरेशन", "Original_cell", और "Culture_time" नाम के छह कॉलम जोड़ें। ये चर प्रयोगात्मक रूप से परिभाषित किए गए हैं और प्रत्येक पंक्ति से अनुमान लगाया जाता है:
    export_A10 CD34 + PBS_CV_Peak 1.csv.1 = A10 (अच्छा), CD34+ (Original_cell), PBS (स्थिति), CV (रंग), Peak_1 (पीढ़ी).
  14. गेटिंग के लिए थ्रेशोल्ड मूल्यों की पहचान करने के लिए थोक कुओं को निर्यात करें: ब्याज की क्षतिपूर्ति आबादी (जैसे, सीडी 34 + सीडी 38-) को .csv फ़ाइलों के रूप में निर्यात करें, विकल्पों "स्केल मानों" और "क्षतिपूर्ति पैरामीटर" पर टिक करें। इन फ़ाइलों को "निर्यात की गई फ़ाइलें" नामक फ़ोल्डर में निर्यात करें.
  15. CD38 के लिए सीमा ढूँढने के लिए, इस पैरामीटर के लिए सबसे बड़ा संख्यात्मक मान पहचानें. इसके विपरीत, CD34 के लिए सीमा खोजने के लिए, इस पैरामीटर के लिए सबसे छोटे संख्यात्मक मान की पहचान करें। ब्याज के सभी मापदंडों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएं।
    नोट: प्रोटोकॉल में प्रस्तुत विश्लेषण के लिए, मार्कर CD45RA का उपयोग CD34+ CD38- गेट में LMPP और CD34+ CD38+ गेट में CMP/GMP दोनों की पहचान करने के लिए किया जाता है। इसका मतलब है कि इस मार्कर के लिए दो अलग-अलग थ्रेशोल्ड मान निकाले जाने की आवश्यकता है।
  16. "gating_matrix" नामक Excel फ़ाइल में थ्रेशोल्ड मानों की प्रतिलिपि बनाएँ और चिपकाएँ. यह फ़ाइल तालिका 4 के अनुसार व्यवस्थित है, और कई स्वतंत्र प्रयोगों के विश्लेषण की अनुमति देती है। इस योजना के साथ प्रत्येक कॉलम को बिल्कुल नाम देना बहुत महत्वपूर्ण है: XXYYMMDD_xxh, जहां XX ऑपरेटर के दो आद्याक्षरों के लिए खड़ा है, YY वर्ष के लिए अंतिम दो संख्याएं, महीने के लिए MM, दिन के लिए DD, और विश्लेषण समय बिंदु के लिए xx।

तालिका 4: सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले, सेल भाग्य असाइनमेंट के लिए मैट्रिक्स को गेट करना। CD45h HPC उपसमुच्चय गेटिंग के लिए CD45RA की तीव्रता को संदर्भित करता है, जबकि CD45l CD34+CD38- उपसमुच्चय के लिए CD45RA की तीव्रता को संदर्भित करता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

7. सांख्यिकीय विश्लेषण

नोट: उत्पन्न डेटा के सांख्यिकीय परीक्षण में एक कस्टम-निर्मित विश्लेषण पाइपलाइन शामिल है, जिसे प्रोग्रामिंग भाषा पायथन (पूरक फ़ाइल 2, पूरक फ़ाइल 3, और पूरक फ़ाइल 4) का उपयोग करके कोडित किया गया है। स्क्रिप्ट को तीन ब्लॉकों में व्यवस्थित किया जाता है: पहला स्प्रेडशीट को संसाधित करने के लिए, दूसरा ब्लॉक डेटा विज़ुअलाइज़ेशन के लिए हीटमैप उत्पन्न करने के लिए, और अंतिम ब्लॉक भेदभाव और विभाजन गुणों का विश्लेषण और परीक्षण करने के लिए कई हिस्टोग्राम उत्पन्न करने के लिए।

  1. ब्लॉक "0_process_data" (पूरक फ़ाइल 2) से शुरू करते हुए, सुनिश्चित करें कि gating_matrix और डेटा स्प्रेडशीट पथ स्क्रिप्ट में सही ढंग से परिभाषित हैं।
  2. प्रत्येक सेल को प्रासंगिक सेल भाग्य असाइन करने के लिए "cell_cols" शब्दकोश को परिभाषित करें। विशिष्ट मामले में, भाग्य एचएससी, एमपीपी, एलएमपीपी, सामान्य माइलॉयड पूर्वज (सीएमपी), ग्रैनुलो-मोनोसाइटिक पूर्वज (जीएमपी), मेगाकैरियोसाइटिक-एरिथ्रोइड पूर्वज (एमईपी), और सीडी 34-हैं।
  3. थोक कुओं (चरण 6.16) से परिभाषित थ्रेशोल्ड मानों का उपयोग करते हुए, "cell_class_exp_time" फ़ंक्शन को परिभाषित करें। चरण 6.12 में प्रत्येक कॉलम को परिभाषित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले समान नाम का उपयोग करके, इन थ्रेसहोल्ड को सही ढंग से परिभाषित करने के लिए, कॉलम नामकरण में सुसंगत होना आवश्यक है।
  4. सेल फेनोटाइप्स को फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के दौरान पता लगाए गए थ्रेसहोल्ड के आधार पर "अगर-और" बयानों की एक श्रृंखला का उपयोग करके स्क्रिप्ट में परिभाषित किया गया है।
    नोट: अन्य मार्कर संयोजनों को समायोजित करने के लिए इन कथनों को संशोधित करके विभिन्न फेनोटाइप प्रदर्शित किए जा सकते हैं।
  5. फ़ंक्शन "cond_rule" (जैसे, विभिन्न प्रयोगात्मक उपचार) का उपयोग करके प्रयोगात्मक विशिष्ट स्थितियों को निर्दिष्ट करें। प्रदान किए गए डेटासेट के लिए, शर्तों को "जीटी" और "डिफ" नाम दिया गया है। कोशिकाओं को कल्चर करने के लिए उपयोग किए जाने वाले दो अलग-अलग सेल कल्चर मीडिया का वर्णन करें। इस जानकारी का उपयोग हीटमैप को प्लॉट करने के लिए ब्लॉक "1_dot_plot" (पूरक फ़ाइल 3) द्वारा किया जाएगा।
  6. ब्लॉक "2_bar_plot" (पूरक फ़ाइल 4) में, शब्दकोश "class_dct" को परिभाषित करें, जिसमें रुचि के असतत सेल भाग्य शामिल हैं। प्रदान किए गए डेटासेट के लिए, रुचि के सेल भाग्य "cell_cols" शब्दकोश के लिए समान हैं।
  7. "कॉन्ड्स" (शर्तें), "or_cells" (मूल सेल), "sym_labs" (समरूपता लेबल), और "समय" (प्रयोगात्मक समय बिंदु) को परिभाषित करें। ये प्लॉटिंग के लिए आवश्यक फिल्टर को दोहरा रहे हैं। "कॉन्ड्स" "cond_rule" में परिभाषित शर्तों को फिर से लेते हैं, "or_cells" एचएससी और एमपीपी हैं, और "sym_labs" विभाजन के प्रकार का वर्णन करते हैं।
  8. ब्लॉक "2_bar_plot" में, उन कोशिकाओं को प्लॉट करना संभव है जो डिवीजन 6 तक बढ़ गए हैं।
    नोट: प्रदान किए गए डेटासेट में केवल डिवीजन 4 तक के कक्ष शामिल हैं, इसलिए एक त्रुटि संदेश पॉप अप होता है, लेकिन यह स्क्रिप्ट को काम करने से नहीं रोकता है।
  9. स्क्रिप्ट द्वारा उत्पन्न आंकड़े पीडीएफ फाइलों के रूप में "आंकड़े" नामक फ़ोल्डर में पुनर्प्राप्त किए जा सकते हैं। "टेस्ट" नामक फाइलें संबंधित हिस्टोग्राम के लिए किए गए विभिन्न सांख्यिकीय परीक्षणों का प्रतिनिधित्व करती हैं।

Representative Results

FACS सॉर्टिंग
इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत सॉर्टिंग गेटिंग रणनीतियाँ व्यापक रूप से स्वीकृत रणनीतियों 12,30,31 पर आधारित हैं। चित्रा 1 में प्रस्तुत गेटिंग रणनीति के लिए, शुरुआती सामग्री कॉर्ड रक्त पूर्वजों को पहले सीडी 34 + चुंबकीय संवर्धन के माध्यम से शुद्ध किया गया था, जो वंश सकारात्मक कोशिकाओं के नगण्य प्रतिशत की व्याख्या करता है। निम्नलिखित विश्लेषण के दौरान चोटियों के रिज़ॉल्यूशन में सुधार करने और सही सेल आबादी (चित्रा 1 डी) को गेट करने के लिए, चार इंट्रासेल्युलर डाई संयोजनों (जैसे, आंकड़े में सीटीवी) के लिए तंग गेट का उपयोग करना आवश्यक है। आंकड़े में प्रदर्शित मामले में, द्वार सबसे बड़ी और बेहतर परिभाषित आबादी के लिए चयन करते हैं। प्रत्येक कोशिका विभाजन डाई संयोजन के लिए कई, करीबी आबादी की उपस्थिति, हमारे अनुभव में, जैविक मतभेदों का प्रतिनिधि नहीं है। इसके बजाय, यह ए) एक गैर-इष्टतम धुंधला प्रक्रिया का संकेत दे सकता है, या बी) कोशिकाओं के शुरुआती पूल में एक बड़ी विषमता (विशेष रूप से आकार में)। गर्भनाल रक्त या अन्य जटिल जैविक स्रोतों (जैसे, अस्थि मज्जा एस्पाइरेट्स, परिधीय रक्त) से शुरू होने पर यह अप्रत्याशित नहीं है। यदि गेट को कसकर परिभाषित नहीं किया गया है, तो विभिन्न डाई संयोजनों के प्रगतिशील कमजोर पड़ने से बाद की चोटियों का विलय हो सकता है, विशेष रूप से सीवी और वीसी (चित्रा 2 डी) स्थितियों के लिए। एक उप-मानक सिंचाई का एक और नकारात्मक परिणाम सेल कल्चर के बाद विभिन्न चोटियों को कुशलतापूर्वक अलग करने में असमर्थता है, क्योंकि एक विषम शुरुआती आबादी उथली चोटियों को जन्म दे सकती है।

Figure 1
चित्रा 1: सेल सॉर्टिंग के लिए गेटिंग रणनीति। (ए) एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए, मलबे और दूषित कोशिकाओं को बाहर करने के लिए। (बी) एफएससी-ए बनाम एफएससी-एच, डबल्स और सेल क्लंप को बाहर करने के लिए। (सी) लिन बनाम एफएससी-एच, उन कोशिकाओं को बाहर करने के लिए जो लिन + हैं। (डी) सीटीवी बनाम सीएफएसई, डाई संयोजन सीएफ, सीवी, वीसी और वीआई के साथ दाग वाली कोशिकाओं की पहचान करने के लिए। एक सजातीय आबादी को शामिल करने के लिए गेट पर्याप्त सख्त होने चाहिए। (ई) सीडी 34 बनाम सीडी 38, मल्टीपोटेंट कम्पार्टमेंट सीडी 34 + सीडी 38 - से प्रतिबंधित पूर्वजों सीडी 34 + सीडी 38 + (जिसे एचपीसी भी कहा जाता है) को अलग करने के लिए। (च) CD45RA बनाम CD90, CD34+CD38- जनसंख्या से, HSC (CD90+CD45RA-), LMPP (CD90midCD45RA+) और अधिक प्रतिबद्ध MPP (CD90-CD45RA-) में समृद्ध सबसे अपरिपक्व पूर्वजों के बीच अलग करने के लिए। (जी) इंडेक्स क्रमबद्ध घटनाएं, जो उनके सेल डाई संयोजन धुंधला होने और (एच) सतह मार्कर सीडी 90 और सीडी 45 आरए की अभिव्यक्ति के लिए यहां दर्शाई गई हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सेल कल्चर के बाद फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण।
चित्रा 2 में डेटा मानव कॉर्ड रक्त एचएससी का प्रतिनिधि है, जिसे 72 घंटे के लिए संस्कृति में रखा गया है, कई साइटोकिन्स की उपस्थिति में मायलोइड पूर्वजों और अग्रदूतों की एक श्रृंखला का समर्थन करने में सक्षम है। पैनल 2 ए से 2 डी प्रत्येक व्यक्तिगत कोशिकाओं की रिश्तेदारी स्थापित करने के लिए आवश्यक गेटिंग का प्रतिनिधित्व करते हैं, जबकि पैनल 2 ई से 2 जी सेलुलर फेनोटाइपिंग की अनुमति देते हैं। आंकड़े में एमईपी की कम उपस्थिति शायद इस प्रतिनिधि प्रयोग (चित्रा 2 एफ) के लिए उपयोग की जाने वाली संस्कृति स्थितियों का परिणाम है। विभिन्न साइटोकिन्स और संस्कृति स्थितियों का उपयोग करने से प्रत्येक उप-समूह के सापेक्ष प्रतिशत में बदलाव होता है, इसी तरह प्रयोग के लिए विभिन्न शुरुआती कोशिकाओं का चयन करना।

Figure 2
चित्रा 2: फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए गेटिंग रणनीति। (ए) एफएससी-ए बनाम एसएससी-ए, मलबे और दूषित कोशिकाओं को बाहर करने के लिए। (बी) एफएससी-ए बनाम एफएससी-एच, डबल्स और सेल क्लंप को बाहर करने के लिए। (सी) सीटीवी बनाम सीएफएसई, गेट लेबल किसी भी ऑटो-फ्लोरोसेंट घटना को बाहर करने की अनुमति देता है जो डेटा रिज़ॉल्यूशन को प्रभावित कर सकता है। (डी) सीटीवी बनाम सीएफएसई। कोशिका विभाजन डाई कमजोर पड़ने के आधार पर चार आबादी को सख्ती से गेट करना बेहद महत्वपूर्ण है। (ई) सीडी 34 बनाम सीडी 38, प्रतिबद्ध अग्रदूतों (सीडी 34-), प्रतिबंधित पूर्वजों (एचपीसी) (सीडी 34 + सीडी 38 +), और अपरिपक्व पूर्वजों (सीडी 34 + सीडी 38-) के बीच अंतर करने के लिए। (एफ) सीडी 45 आरए बनाम सीडी 123, तीन प्रकार के प्रतिबंधित पूर्वजों को अलग करने के लिए: सीएमपी (सीडी 123 + सीडी 45 आरए -), एमईपी (सीडी 123-सीडी 45 आरए -), और जीएमपी (सीडी 123 + सीडी 45 आरए +)। (छ) CD34+CD38-से CD45RA बनाम CD90, HSC, LMPPs और MPPs की पहचान करने के लिए. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

चरम परिभाषा और असाइनमेंट चरण (चित्रा 3 और चित्रा 4) प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण पहलू हैं और सख्त गेट की परिभाषा की आवश्यकता है। चरम परिभाषा (चित्रा 3) के लिए, एक विश्वसनीय पहचान के लिए कम से कम 1,000 घटनाएं आवश्यक हैं। इस अर्थ में, "थोक" कुओं के लिए सेल सॉर्टिंग चरण के दौरान अधिक कोशिकाओं को अलग करना फायदेमंद हो सकता है। चित्र 4 एकल कुओं के चार उदाहरणों का वर्णन करता है जिसमें कई परिवार होते हैं। यह आंकड़ा चित्रा 2 डी और चित्रा 3 गेटिंग के महत्व को स्पष्ट करता है, विशेष रूप से प्रत्येक परिवार और प्रत्येक चोटी की पहचान के लिए। चित्रा 4 ए एक सीधा उदाहरण दिखाता है, क्योंकि गेट सीएफ में सभी कोशिकाएं एक दूसरे के बहुत करीब हैं और आसानी से एक ही चोटी को सौंपी जा सकती हैं। चित्रा 4 सी दो अच्छी तरह से अलग चोटियों पर एकस्वर रूप से वितरित एक परिवार का एक और उदाहरण दिखाता है, क्योंकि यह चित्रा 4 डी के हिस्टोग्राम में स्पष्ट रूप से प्रदर्शित होता है। चित्रा 4 ई, जी बड़ी संख्या में घटनाओं के आधार पर सख्त गेटिंग के महत्व को प्रकट करता है; वे दोनों कुछ घटनाओं को प्रदर्शित करते हैं जो करीब हैं, लेकिन डाई संयोजन द्वार के बाहर। उन घटनाओं को विशेष रूप से एकल-वेल विश्लेषण के आधार पर वीआई और सीएफ गेट्स में गलत तरीके से शामिल किया जा सकता है। अंत में, चित्रा 4 एफ, एच कई चोटियों पर फैले परिवारों के दो अलग-अलग उदाहरण प्रदर्शित करता है, जिसमें दो समान तीव्रता वाली चोटियों (चित्रा 4 एफ) का एक उदाहरण और दो असमान तीव्रता वाली चोटियों (चित्रा 4 एच) के साथ एक उदाहरण है।

Figure 3
चित्रा 3: प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए पीक परिभाषा। (ए-डी) चोटियों को कम से कम 500 घटनाओं को दर्ज करते हुए परिभाषित किया जाना चाहिए, ताकि प्रत्येक व्यक्तिगत शिखर के लिए एक अच्छा प्रतिनिधित्व सुनिश्चित किया जा सके। (ए) सीएफएसई-ए तीव्रता के लिए हिस्टोग्राम। कई चोटियों की पहचान की जा सकती है, जिनमें से प्रत्येक विभाजित कोशिकाओं की एक अलग आबादी के अनुरूप है। (बी, सी) व्युत्पन्न पैरामीटर की तीव्रता के लिए हिस्टोग्राम, क्रमशः सीएफएसई-सीटीवी मिश्रण, सीवी (बी) और वीसी (सी) का प्रतिनिधित्व करता है। (डी) सीटीवी-ए तीव्रता के लिए हिस्टोग्राम। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: पीक असाइनमेंट । (ए, बी) सीएफ गेट में इस कुएं के लिए केवल एक चोटी का पता लगाया जा सकता है। (C, D) VI गेट में इस कुएं में लगभग समान तीव्रता की दो चोटियों का पता लगाया जा सकता है। चोटियाँ अच्छी तरह से हल हो गई हैं। (E, F) VI गेट में इस कुएं में तुलनीय तीव्रता की दो चोटियों का पता लगाया जा सकता है। थोक कुओं का उपयोग करके निर्धारित रणनीति के आधार पर केवल गेट में घटनाओं पर विचार किया गया है। (G-H) गेट सीएफ में इस कुएं में असमान तीव्रता की दो चोटियों का पता लगाया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

डेटा प्रतिनिधित्व और सांख्यिकीय परीक्षण
चित्रा 5 दो अलग-अलग प्रयोगों के विभिन्न प्रकार के डेटा प्रतिनिधित्व को दर्शाता है, दोनों सेल संस्कृति के 72 घंटे के बाद किए गए हैं। एचएससी और एमपीपी को दो अलग-अलग सेल कल्चर मीडिया में सुसंस्कृत किया गया है, जो कोशिका विभाजन और भेदभाव गुणों को बदलने के लिए माना जाता है। इन मीडिया को "डिफ" (भेदभाव) 32 और "जीटी" 33 नाम दिया गया है; पहला माइलॉयड और एरिथ्रोइड भेदभाव को बढ़ावा देता है, क्योंकि इसमें एरिथ्रोपोइटिन (ईपीओ) और ग्रैनुलो-मोनोसाइटिक कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) शामिल हैं, जबकि दूसरे को जीन थेरेपी नैदानिक परीक्षणों के संदर्भ में विकसित किया गया है, जिसका लक्ष्य एचएसपीसी के उच्च प्रतिशत को बनाए रखना और बढ़ाना है। कोशिका भाग्य और विभाजन दोनों में। इस हीटमैप में, प्रत्येक पंक्ति एक व्यक्तिगत परिवार का प्रतिनिधित्व करती है, प्रत्येक वर्ग एक व्यक्तिगत सेल है, और कॉलम उन सभी कोशिकाओं को समूहीकृत कर रहे हैं जो एक ही पीढ़ी में हैं (उदाहरण के लिए, पीढ़ी 2 में कोशिकाएं कम से कम दो बार विभाजित हैं)। अत्यधिक सजातीय परिवारों को अलग करना संभव है, जो एक एकल सेल प्रकार से बना है और समान संख्या में विभाजन (जैसे, परिवार # 63), और विषम परिवारों को प्रदर्शित करता है, जिसमें दो पीढ़ियों (जैसे, परिवार # 84) में तीन सेल प्रकार शामिल हैं। चूंकि इस विश्लेषण के लिए सेलुलर रिकवरी दर लगभग 70% है, पूर्ण परिवार, जिन्हें संभवतः अलग-अलग पीढ़ियों में उनकी सभी कोशिकाओं को पुनर्प्राप्त करके परिभाषित किया जाता है (उदाहरण के लिए, पीढ़ी 1 में एक कोशिका का परिवार और पीढ़ी 2 में दो कोशिकाएं), शायद ही कभी देखी जाती हैं ( चित्रा 5 ए में उनके आईडी नंबर के बगल में एक हैशटैग प्रदर्शित करना)। अपूर्ण पहचान के लिए कई स्पष्टीकरण हैं, जो तकनीकी (धुंधला मुद्दा, प्रोटोकॉल के कारण कोशिका हानि) या जैविक (कोशिका मृत्यु और / या एपोप्टोसिस) हो सकते हैं। तकनीकी सीमाओं को व्यक्तिगत नमूने से जुड़े मृत मात्रा को कम करने के लिए डिज़ाइन किए गए विश्लेषक का उपयोग करके और वॉल्यूम पाइपिंग को कम करने के लिए सेल कल्चर प्लेट में सीधे सेल स्टेनिंग करके दूर किया जा सकता है। इसके विपरीत, कोशिका मृत्यु की मात्रा निर्धारित करने के लिए ऑर्थोगोनल तरीके (जैसे, लाइव-सेल इमेजिंग प्रयोगों के माध्यम से) तकनीकी और जैविक कारकों को अलग करने में मदद कर सकते हैं जिसके परिणामस्वरूप अपूर्ण पहचान होती है।

चित्रा 5 बीमैं दिखाता हूं कि सेल प्रकार संरचना पर संस्कृति की स्थिति के प्रभाव की कल्पना कैसे करें, जैसे कि किसी ने थोक परख का प्रदर्शन किया हो। यहां, डिफ स्थिति बड़ी संख्या में भाग्य को बढ़ावा देती है, और सीडी 34+ कोशिकाओं का एक उच्च प्रतिशत (सीडी 34-को छोड़कर सभी सेल प्रकारों के रूप में परिभाषित)। आत्मविश्वास अंतराल की गणना स्क्रिप्ट में मूल बूटस्ट्रैप के माध्यम से की जाती है, जिसमें 250,000 बूटस्ट्रैप डेटासेट34 होते हैं। यह ध्यान देने योग्य है कि चित्रा 5 में अन्य सभी हिस्टोग्राम उसी तरह से गणना किए गए आत्मविश्वास अंतराल प्रदर्शित करते हैं। तालिका 5 प्रत्येक पीढ़ी में परिवारों की संख्या और कोशिकाओं की संख्या के बारे में सभी जानकारी को पुन: प्रस्तुत करती है।

चित्रा 5 बीii ग्राफिक रूप से स्क्रिप्ट "2_bar_plot" में किए गए सांख्यिकीय परीक्षण के आउटपुट का प्रतिनिधित्व करता है। सांख्यिकीय ढांचे का औपचारिकविवरण उपलब्ध है। संक्षेप में, यह ढांचा सांख्यिकीय परिकल्पना परीक्षण को सक्षम बनाता है, जबकि यह मानते हुए कि एक ही परिवार की कोशिकाएं निर्भर हैं (एक धारणा जो स्वयं परीक्षण योग्य है), शास्त्रीय आंकड़ों के विपरीत जिन्हें सभी देखी गई कोशिकाओं के बीच स्वतंत्रता की आवश्यकता होगी। आंकड़े में प्रस्तुत विशिष्ट मामले में, सांख्यिकीय परीक्षण इस परिकल्पना को चुनौती देता है कि एमपीपी के सेल भाग्य विकल्प, संस्कृति में मौजूद विभिन्न सेल प्रकारों की आवृत्तियों के रूप में मापा जाता है, उपयोग की जाने वाली सेल संस्कृति स्थितियों से स्वतंत्र हैं। सबसे पहले, जी-टेस्ट सांख्यिकी का उपयोग विभिन्न सेल मीडिया से सेल प्रकार आवृत्तियों के बीच विसंगति का मूल्यांकन करने के लिए किया जाता है ( उदाहरण के लिए बीआई में, इस आंकड़े को लाल पट्टी के साथ दर्शाया गया है)। फिर, डेटा का एक यादृच्छिककरण क्रमपरिवर्तन के माध्यम से किया जाता है, दो सेल संस्कृति स्थितियों के बीच कोशिकाओं के पूरे परिवारों की अदला-बदली की जाती है। यह परिवार से संबंधित कोशिकाओं के बीच निर्भरता को संरक्षित करना है, जबकि प्रत्येक सेट में परिवारों की संख्या को मूल डेटा के अनुरूप रखना है। जी-टेस्ट सांख्यिकी की गणना यादृच्छिक डेटा सेट से की जाती है। 5Bii में दर्शाए गए नीले मान 250,000 क्रमपरिवर्तन के लिए जी-परीक्षण आंकड़े हैं। अंत में, पी मान की गणना यह आकलन करने के लिए की जाती है कि मूल डेटासेट किस हद तक परम्यूट लोगों के वितरण से विचलित होता है। उदाहरण में, मूल आंकड़ा काफी हद तक वितरण से विचलित होता है, जिसके परिणामस्वरूप एक छोटा पी मान होता है और इस प्रकार इस परिकल्पना को खारिज कर दिया जाता है कि एमपीपी का सेल भाग्य संस्कृति स्थितियों से स्वतंत्र है।

चित्रा 5 सी प्रति अधिकतम पीढ़ी में सेल परिवारों के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है, यह पता लगाने के लिए कि विभिन्न स्थितियां प्रति सेल परिवार कोशिका विभाजन को कैसे बदलती हैं। इस डेटा प्लॉट से पता चलता है कि 72 घंटे में, डिफ स्थिति में संवर्धित कोशिकाएं जीटी स्थिति में कोशिकाओं की तुलना में बड़ी संख्या में विभाजन पूरा करती हैं। प्रतिनिधित्व प्रत्येक परिवार में अधिकतम पीढ़ियों की संख्या है, इसलिए एक परिवार जो पीढ़ी 1 और 2 में कोशिकाओं को प्रदर्शित करता है, उसे पीढ़ी 2 माना जाता है। चित्रा 5 बी के लिए उपयोग किए जाने वाले एक ही सांख्यिकीय ढांचे का उपयोग सेलुलर विभाजन और संस्कृति की स्थिति के बीच स्वतंत्रता का सांख्यिकीय परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है।

चित्रा 5 डी विभिन्न पूर्वज प्रकारों (एचएससी या एमपीपी) के लिए पहले डिवीजन की समरूपता / विषमता के प्रकार की पड़ताल करता है। पीढ़ी 1 में पूर्ण कोशिका परिवारों के लिए- एकमात्र पीढ़ी जहां दो बेटी कोशिकाओं को बहन कोशिकाओं के रूप में निश्चित रूप से स्थापित करना संभव है- चार अलग-अलग प्रकार की समरूपता / विषमता को परिभाषित किया जा सकता है: लेबल "सिम अनडिफ" उन परिवारों का वर्णन करता है जहां दोनों बेटियां मूल कोशिका के फेनोटाइप को बनाए रखती हैं। "सिम डिफ" का मतलब है कि दोनों बेटियों का एक ही फेनोटाइप है, और यह मूल की कोशिका से अलग है। "असिम अनडिफ" का अर्थ है कि एक बेटी केवल मूल कोशिका के फेनोटाइप को बरकरार रखती है। अंत में, "असिम डिफ" उन परिवारों का वर्णन करता है जहां दोनों बेटियों के अलग-अलग फेनोटाइप हैं, और उनमें से कोई भी मूल की कोशिका के समान नहीं है। इन सममित /असममित भाग्य का आकलन करने में सांख्यिकीय शक्ति प्राप्त करने के लिए, प्रारंभिक समय बिंदुओं पर मल्टीजेन विश्लेषण करना वांछनीय है, ताकि अधिक परिवारों का निरीक्षण किया जा सके जिनकी संतान पीढ़ी 1 में पाई जाती है।

अंत में, चित्रा 5 ई डिवीजनों की संख्या के कार्य के रूप में सेल प्रकारों के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करता है, ताकि डिवीजनों में भेदभाव पैटर्न प्रगति के बारे में अंतर्दृष्टि प्राप्त की जा सके। उदाहरण के लिए, आंकड़े में प्रदर्शित डेटा से पता चलता है कि कोशिकाएं सीडी 34- अवस्था में प्रगति करती हैं, केवल तीन विभाजनों के बाद इस वर्ग में 50% से अधिक पता लगाई गई कोशिकाएं होती हैं। इसके अलावा, यह अनुमान लगाना संभव है कि एमपीपी स्व-नवीकरण विभाजन का पक्ष नहीं लेते हैं, क्योंकि कोशिकाओं का एक छोटा प्रतिशत मूल फेनोटाइप को बनाए रखता है। इनमें से कुछ निष्कर्षों को पिछले आंकड़ों में प्रस्तुत सांख्यिकीय ढांचे का उपयोग करके परीक्षण किया जा सकता है।

Figure 5
चित्र 5: कॉर्ड ब्लड एचएसपीसी का उपयोग करके एक 72 घंटे के प्रयोग के लिए डेटा प्रतिनिधित्व का उदाहरण। (ए) चयनित डेटासेट के लिए हीटमैप (एचएससी, "डिफ" माध्यम में, संस्कृति के 72 घंटे के बाद)। प्लॉट सभी व्यक्तिगत कोशिकाओं (वर्गों) को उनकी रिश्तेदारी (पंक्तियों), प्रदर्शन किए गए विभाजनों की संख्या (कॉलम, पीढ़ी कहा जाता है), और फेनोटाइप (रंग) के अनुसार दर्शाते हैं। (Bi) हिस्टोग्राम एचएससी और एमपीपी की कोशिका संतानों के सेल प्रकारों के अनुपात की तुलना करता है, स्थिति जीटी और स्थिति डिफ के बीच (बीआई) ग्राफ "डिफ" और "जीटी" साइटोकिन कॉकटेल के बीच तुलना करते हुए, एमपीपी के लिए "2_bar_plot" स्क्रिप्ट में किए गए सांख्यिकीय परीक्षणों का प्रतिनिधित्व करता है। प्रयोगात्मक मान लाल रंग में प्रदर्शित होता है, और नीले रंग में 250,000 क्रमपरिवर्तन के माध्यम से उत्पन्न मान। जी-परीक्षण का पी मान परीक्षण के लिए उपयोग किए जाने वाले परिवारों की संख्या के साथ शीर्ष दाएं कोने में इंगित किया गया है। (ग) हिस्टोग्राम प्रत्येक पीढ़ी (रंग कोडित) में परिवारों (कुल 314 परिवारों) के प्रतिशत की तुलना करता है, एचएससी और एमपीपी के लिए प्रति संस्कृति स्थिति। आत्मविश्वास अंतराल की गणना 250,000 बूटस्ट्रैप डेटासेट के साथ की जाती है। (डी) हिस्टोग्राम पीढ़ी 1 में दो कोशिकाओं वाले परिवारों के लिए बेटी कोशिकाओं के भाग्य के बीच समरूपता /विषमता के प्रकार का प्रतिनिधित्व करता है: सिम अनडिफ (दोनों बेटियां मूल कोशिका के फेनोटाइप को बनाए रखती हैं), सिम डिफ (दोनों बेटियों में समान फेनोटाइप है, और यह मूल की कोशिका से अलग है), असिम अनडिफ (केवल एक बेटी मूल कोशिका के फेनोटाइप को बरकरार रखती है), और असिम डिफ (दोनों बेटियों के अलग-अलग फेनोटाइप हैं और उनमें से कोई भी मूल की कोशिका से मिलता-जुलता नहीं है)। (ई) "डिफ" कॉकटेल के साथ संवर्धित एमपीपी के लिए प्रति पीढ़ी वर्गीकृत सेल प्रकारों के योगदान का हिस्टोग्राम; एन = 204 कोशिकाएं और 97 परिवार। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 5: प्रत्येक प्रयोगात्मक स्थिति (उत्पत्ति की कोशिका और कोशिका संस्कृति माध्यम) के अनुसार विश्लेषण किए गए परिवारों और कोशिकाओं की संख्या का विवरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 2: कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

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Discussion

मल्टीजेन परख एक उच्च-थ्रूपुट, प्रदर्शन करने में आसान और सस्ती परख है, जो लिम्फोसाइट 23,24,35 और मुराइन हेमटोपोइएटिक कोशिकाओं 26,27 का अध्ययन करने में सहायक रही है। यहां, हम दृष्टिकोण का एक नया विकास प्रस्तुत करते हैं जो अल्पकालिक संस्कृति (चित्रा 6) का उपयोग करके एकल-कोशिका स्तर पर मानव एचएसपीसी प्रतिबद्धता के शुरुआती चरण को समझने की अनुमति देता है। एकल-सेल एक्स विवो कल्चर सिस्टम का उपयोग आमतौर पर परिपक्व कोशिकाओं में एचएसपीसी के दीर्घकालिक भाग्य का आकलन करने के लिए किया जाता है, लेकिन कुछभाग्य दूसरों की तुलना में पहले होते हैं, संभावित रूप से कम भाग्य की ओर विश्लेषण को पूर्वाग्रहित करते हैं। इसके अलावा, ये संस्कृति प्रणालियां आमतौर पर भाग्य प्रतिबद्धता के दौरान विभाजन के बारे में जानकारी से चूक जाती हैं। पहले प्रतिबद्धता के कदम संस्कृति की शुरुआत में ही होते हैं, कभी-कभी विभाजन26,37 के बिना, प्रारंभिक भाग्य प्रतिबद्धता का अध्ययन करने के लिए अल्पकालिक संस्कृति और ट्रैकिंग डिवीजन आवश्यक हो जाता है। भाग्य, विभाजन और रिश्तेदारी का एक साथ पालन करके, यह परख मानव एचएसपीसी में पहले विभाजन और भाग्य निर्णय की भूमिका को समझने की अनुमति देती है। परख का उपयोग करके, यह अनुमान लगाना संभव है कि प्रतिबद्धता प्रक्रिया कितने विभाजनों के बाद होती है, उन शुरुआती पूर्वजों के लिए आत्म-नवीकरण और भेदभाव के बीच संतुलन, और उन गुणों को पीढ़ियों में कैसे विरासत में मिला है। हमारे ज्ञान के लिए, यह एकमात्र परख है जो एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन पर मानव एचएसपीसी के लिए इस प्रकार के माप की अनुमति देता है। इसके अलावा, सेल डिवीजन रंगों के विभिन्न संयोजनों का उपयोग करके, हमने विश्लेषण के थ्रूपुट में वृद्धि की, जिससे यह परख बड़े डेटासेट को जल्दी से उत्पन्न करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण बन गया। डाई संयोजन एक ही कुएं में कई परिवारों का पालन करने की अनुमति देते हैं, जिससे अल्पकालिक संस्कृति में विश्लेषण के लिए उपलब्ध कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती है। संयोजनों की संख्या को संभावित रूप से अन्य रंगों (जैसे, पीली डाई) को जोड़ने या सीएफएसई और सीटीवी के अनुपात को संशोधित करने के माध्यम से और भी बढ़ाया जा सकता है। हालांकि, यह विश्लेषण किए जा सकने वाले अन्य मापदंडों की संख्या को कम करता है।

Figure 6
चित्रा 6: प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

विश्लेषण को सफलतापूर्वक करने के लिए, कुओं की बड़ी संख्या और विश्लेषण करने के लिए कोशिकाओं की कम संख्या के कारण, प्लेट रीडर से लैस विश्लेषक पर फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण चलाना आवश्यक है। बेंच एनालाइज़र की नई पीढ़ी विशेष रूप से इस परख के लिए अनुकूलित है, क्योंकि उनमें से अधिकांश में सेल हानि के प्रतिशत को कम करने के लिए एक छोटी मृत मात्रा है। यह बदले में प्रत्येक कुएं की संपूर्णता को पुनर्प्राप्त करने में उच्च दक्षता की गारंटी देता है, जिससे 70% रेंज26 में अनुमानित दक्षता का संकेत मिलता है। फ्लो साइटोमेट्री अधिग्रहण के दौरान सेल हानि का अनुमान लगाना प्रत्येक व्यक्तिगत परिवार के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, कोई कोशिका मृत्यु नहीं मानते हुए और डिवीजनों की संख्या की गणना करते हुए, प्रत्येक परिवार में कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाना संभव है। फिर भी, कुछ पुष्टित्मक प्रयोगों को चलाना वांछनीय है, विशेष रूप से परीक्षण की गई संस्कृति स्थितियों में कोशिका मृत्यु के अनुमान में और कोशिकाओं की परिभाषित संख्या का उपयोग करके प्रयोगात्मक रूप से वसूली दर को मापना।

इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों में से एक पीक असाइनमेंट है। जैसा कि पहले ही उल्लेख किया गया है, एक अच्छी गुणवत्ता वाला पीक वितरण सेल सॉर्टिंग में बहुत संकीर्ण चोटियों के अलगाव से दृढ़ता से निर्भर है। फिर भी, वितरण के आधार पर विशिष्ट रूप से डिवीजनों की सही संख्या असाइन करना अभी भी मुश्किल है। चूंकि सेल सॉर्टिंग और फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण दो अलग-अलग मशीनों पर किया जाता है, इसलिए प्रत्येक सिग्नल की तीव्रता की सीधे तुलना करना संभव नहीं है, इसलिए यह जानना मुश्किल हो सकता है कि हिस्टोग्राम के दाहिने छोर पर देखा गया पहला शिखर पीक 0 या पीक 1 है या नहीं। इस संबंध में, कुछ समाधान संभव हैं; एक तरीका इन कोशिकाओं (जैसे, लाइव-सेल इमेजिंग) द्वारा किए गए विभाजनों की संख्या को सटीक रूप से मापने के लिए एक ऑर्थोगोनल प्रयोग करना है। एक और संभावना प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण चलाने से पहले, उल्टे ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोप के तहत कुएं में कोशिकाओं की संख्या की गणना करना है। यह विभाजन ों की औसत संख्या का अनुमान लगाएगा (यह मानते हुए कि कोई कोशिका मृत्यु नहीं है)। अंत में, चरम असाइनमेंट के लिए एक पोस्ट-हॉक समाधान "असंभव परिवारों" की असामान्य संख्या का पता लगाना है; ये परिवार प्रति पीढ़ी कोशिकाओं की संभावित संख्या से अधिक से बने होते हैं (उदाहरण के लिए, पीढ़ी 2 में पांच कोशिकाएं, या पीढ़ी 1 में दो कोशिकाएं और पीढ़ी 2 में एक कोशिका)। असंभव परिवारों को बाहर करने की संभावना को सांख्यिकीय विश्लेषण चरण में कोडित किया गया है, और असंभव परिवार को ध्वजांकित किया गया है। यदि इन त्रुटियों की घटना बहुत अधिक है, तो यह मानना उचित है कि शिखर असाइनमेंट को संशोधित करने की आवश्यकता है।

इस प्रोटोकॉल में, हमने परख के लिए डेटा प्रतिनिधित्व और विश्लेषण के कुछ उदाहरण शामिल किए, क्योंकि यह बड़े डेटासेट38 की पीढ़ी और व्याख्या में एक आवश्यक कदम बन गया है। पहला उदाहरण हीटमैप है जो प्रति परिवार आयोजित सभी विश्लेषण कोशिकाओं की समग्रता को दर्शाता है। यह डेटा के सामान्य गुणों और संभावित निष्कर्षों का पता लगाने के लिए एक कुशल उपकरण है: क्या परिवार कई सेल प्रकारों से बने होते हैं या क्या वे संरचना में सजातीय होते हैं? क्या परिवार कई पीढ़ियों में फैले हुए हैं, या वे ज्यादातर एक ही संख्या में विभाजित हैं? इस खोजपूर्ण विश्लेषण को तब अधिक विशिष्ट भूखंडों और सांख्यिकीय परीक्षण के साथ पूरक करने की आवश्यकता है। इसका उपयोग मात्रात्मक रूप से सममित और असममित भाग्य प्रतिबद्धता, विभाजन के बिना भेदभाव, आत्म-नवीकरण और भेदभाव के बीच संतुलन और किसी दिए गए प्रतिबद्धता भाग्य के लिए विभाजन की संख्या का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। प्रयोगात्मक योजना के दौरान, पूछे गए प्रश्न के प्रकार के अनुसार सेल संस्कृति की लंबाई निर्धारित करना मौलिक है; उदाहरण के लिए, पहले दो प्रश्नों (सममित / असममित संतुलन और विभाजन के बिना भेदभाव) के लिए, बहुत छोटे संस्कृतियों के चरणों की योजना बनाने से बड़ी संख्या में परिवारों के अलगाव की अनुमति मिलती है जिन्होंने सभी26 में केवल एक या कोई विभाजन नहीं किया है। इसके विपरीत, लंबे प्रयोग एक विशिष्ट सेल प्रतिबद्धता के लिए आवश्यक डिवीजनों की संख्या की खोज की अनुमति देते हैं, क्योंकि वे भेदभाव के विभिन्न चरणों में परिवारों का नमूना लेते हैं। फिर भी, यह विधि दीर्घकालिक संस्कृतियों (2-3 सप्ताह) के लिए डिज़ाइन नहीं की गई है, क्योंकि सेल डाई कमजोर पड़ने से सात या आठ डिवीजनों से अधिक को सटीक रूप से ट्रैककरने में सक्षम नहीं है। नतीजतन, यह उपकरण ज्यादातर हेमटोपोइएटिक पूर्वजों की प्रारंभिक प्रतिबद्धता का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित है, और इन कोशिकाओं के दीर्घकालिक भेदभाव गुणों पर मजबूत निष्कर्ष निकालने के लिए डिज़ाइन नहीं किया गया है।

सांख्यिकीय ढांचा विशेष रूप से इस प्रकार के डेटा के विश्लेषण के लिए विकसित किया गया था और क्रमपरिवर्तन26 की अवधारणा पर आधारित था। सेल प्रकार के वितरण और किए गए विभाजनों की संख्या पर पारिवारिक निर्भरता के अवलोकन के कारण यह आवश्यक था। दूसरे शब्दों में, कोशिकाएं जो एक ही परिवार का हिस्सा हैं, वे समान फेनोटाइप प्रदर्शित करने और समान संख्या में विभाजित करने की अधिक संभावना रखते हैं। जबकि एक गहन विश्लेषण इस काम के दायरे से परे है, विभिन्न स्थितियों का आकलन करते समय सांख्यिकीय परीक्षणों का प्रदान किया गया सेट पर्याप्त होना चाहिए।

अंत में, यह प्रोटोकॉल हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं की सेलुलर गतिशीलता का आकलन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण का गठन करता है, एक तेजी से और सस्ती तरीके से। समय बिंदु, संस्कृति की स्थिति और विश्लेषण किए गए एचएसपीसी के प्रकार के बारे में इसकी लचीलापन और बहुमुखी प्रतिभा के कारण, यह विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों का परीक्षण करने की अनुमति देता है। फ्लो साइटोमेट्री-आधारित परख के रूप में, इसे अधिकांश प्रयोगशालाओं में लागू किया जा सकता है, और इसे व्यापक पूर्व ज्ञान की आवश्यकता नहीं होती है, जिससे यह स्क्रीनिंग और पायलट प्रयोगों के लिए एक अच्छा उम्मीदवार बन जाता है।

Disclosures

लेखक ों ने इस काम के लिए प्रासंगिक हितों का कोई टकराव घोषित नहीं किया है। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और व्याख्या, या प्रकाशन के लिए काम जमा करने के निर्णय में फंड की कोई भूमिका नहीं थी।

Acknowledgments

हम फ्लो साइटोमेट्री प्रयोगों को स्थापित करने में उनकी मदद के लिए इंस्टीट्यूट क्यूरी फ्लो फैसिलिटी के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं। हम कई चर्चाओं के दौरान टीम पेरी के अन्य सदस्यों के योगदान को भी स्वीकार करना चाहते हैं। फिल हॉजकिन (वाल्टर एंड एलिजा हॉल इंस्टीट्यूट ऑफ मेडिकल रिसर्च) को लिम्फोसाइटों पर सेल डिवीजन रंगों के मल्टीप्लेक्सिंग के अपने प्रोटोकॉल को साझा करने के लिए धन्यवाद देते हैं। हम इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए आवश्यक जैविक संसाधन प्रदान करने के लिए सेंट लुइस अस्पताल कॉर्ड ब्लड बायोबैंक को धन्यवाद देते हैं। अध्ययन को सीएनआरएस और बेटनकोर्ट-शुलर फाउंडेशन (एलपी को) से एटीआईपी-एवेनिर अनुदान, लैबेक्स सेलटिसफाइबायो (एएनआर-10-एलबीएक्स-0038) (एलपी और एडी को), इडेक्स पेरिस-साइंस-लेट्रेस प्रोग्राम (एएनआर -10-आईडीईएक्स-0001-02 पीएसएल) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। साथ ही यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम ईआरसी एसटीजी 758170-माइक्रोबार (एलपी के लिए), एडी के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) से वित्त पोषण को फोंडेशन डी फ्रांस से फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL polypropylene microcentrifuge tubes vWR 87003-294
15-mL polypropylene tubes vWR 734-0451
50-mL polypropylene tubes vWR 734-0448
96-well U-bottom culture plate  Falcon 353077
Anti-human Lin APC Thermo Fisher 22-7776-72 Dilution 1/40
ARIA III BD Can be replaced with any FACS sorter able to sort individual cells in 96-wells plate
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) Life Technologies C34570
Cell Trace Violet (CTV)  Life Technologies C34571
Compensation beads  BD 552843
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) Life Technologies 11320033
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Thermo Scientific J62948-36 Prepare a solution 0.5 M, in sterilised water
FC block Fc1.3216 BD 564220 Dilution 1/50
Fetal Bovine Serum (FBS) Dutscher S1900-500C Batch S00CH
FlowJo v10.8.1 BD
Mouse anti-human CD10 PerCP-5.5, clone HI10a Biolegend 312216 Dilution 1/20
Mouse anti-human CD123 BUV395, clone 7G3 BD 564195 Dilution 1/15
Mouse anti-human CD34 APC-Cy7, clone 581 Biolegend 343513 Dilution 1/40
Mouse anti-human CD38 BV650, clone HB7 Biolegend 356620 Dilution 1/40
Mouse anti-human CD45RA AF700, clone HI100 BD 560673 Dilution 1/20
Mouse anti-human CD45RA PE-Cy7, clone HI100 BD 560675 Dilution 1/20
Mouse anti-human CD90 PE, clone 5E10 Biolegend 328110 Dilution 1/20
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1X Life Technologies 10010001
Python
R
Sterile 12x75 mm conical polypropylene tubes Falcon
ZE5  Biorad Can be replaced with any flow cytometry analyzer equipped with a plate reader
Laboratory prepared
Cell culture media Depends from the specific experiment. Prepare fresh daily and store at +4 °C until use
DMEM + 10% FBS Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 50 mL of FBS to 450 mL DMEM
PBS 1X + EDTA 0.1% Can be stored in sterile conditions, at room temperature, up to 1 year. To prepare 500 mL, add 3.42 mL of EDTA 0.5 M to 500 mL PBS 1X
Staining buffer Can be stored in sterile conditions, at +4 °C up to 1 year. To prepare 500 mL, add 2 mL of EDTA 0.5 M and 1 mL FBS to 500 mL PBS 1X

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References

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हेमटोपोइएटिक स्टेम और पूर्वज कोशिकाओं के लिए फ्लो साइटोमेट्री <em>के माध्यम से</em> रिश्तेदारी, विभाजन संख्या और फेनोटाइप का एक साथ मूल्यांकन
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Donada, A., Tak, T., Prevedello, G., Milo, I., Duffy, K. R., Perié, L. Simultaneous Assessment of Kinship, Division Number, and Phenotype via Flow Cytometry for Hematopoietic Stem and Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (193), e64918, doi:10.3791/64918 (2023).

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