Summary
Här beskriver vi metoderna för att inducera allergisk kontaktdermatit i musöron med 1-fluor-2,4-dinitrobensen (DNFB) och hur man utvärderar svårighetsgraden av allergisk kontaktdermatit.
Abstract
Huden är människokroppens första försvarslinje och ett av de mest utsatta organen för miljökemikalier. Allergisk kontaktdermatit (ACD) är en vanlig hudsjukdom som manifesterar sig som lokala utslag, rodnad och hudskador. Förekomsten och utvecklingen av ACD påverkas av både genetiska och miljömässiga faktorer. Även om många forskare har konstruerat en serie modeller av ACD de senaste åren, är de experimentella protokollen för dessa modeller alla olika, vilket gör det svårt för läsarna att fastställa dem väl. Därför är en stabil och effektiv djurmodell av stor betydelse för att vidare studera patogenesen av atopisk dermatit. I denna studie beskriver vi en modelleringsmetod med 1-fluor-2,4-dinitrobensen (DNFB) för att inducera ACD-liknande symtom i öronen hos möss och beskriver flera metoder för att bedöma svårighetsgraden av dermatit under modellering. Detta experimentella protokoll har framgångsrikt tillämpats i vissa experiment och har en viss marknadsföringsroll inom ACD-forskning.
Introduction
Allergisk kontaktdermatit (ACD) är en vanlig hudsjukdom som kännetecknas av eksemliknande symtom på kontaktstället, ödem och erytem i måttliga fall och papler, erosion, utsöndring eller till och med massiva ärr i svåra fall1. Det påverkar upp till 20% av befolkningen och kan påverka människor i alla åldrar2. ACD förekommer ofta hos individer som har utsatts för allergener upprepade gånger och kan orsakas av individens immunsvar mot ett eller flera allergener i sitt hem eller på arbetsplatsen3. Typ IV fördröjd överkänslighet anses vara den huvudsakliga typen av immunsvar i ACD4. I områden av huden som upprepade gånger har utsatts för allergener ackumuleras cirkulerande minnes-T-celler i stort antal och inducerar immun- och inflammatoriska svar 3,5,6. Syftet med detta arbete är att föreslå en tillförlitlig laboratorieteknik för vidare undersökning av immunologiska och inflammatoriska reaktioner vid utveckling av ACD.
Uppkomsten av ACD beror vanligtvis på kontaktöverkänslighet orsakad av upprepad exponering för kemikalier. Många forskare har utvecklat olika ACD-djurmodeller i husmöss 7,8, marsvin 9,10 och andra djur under de senaste decennierna för att simulera sjukdomsuppkomsten. De flesta av de experimentella metoderna består av två steg: buksensibilisering (induktion) och ger stimuli på ryggen eller öronloben (stimulering). Vanliga kemiska ämnen innefattar huvudsakligen 1-fluor-2,4-dinitrobensen (DNFB)/1-klor-2,4-dinitrobensen (DNCB)8,9,11, oxazolon 12, urushiol 13, etc. Bland dem är DNFB och DNCB de mest använda, först rapporterade i oktober 195810. Nickelsensibiliseringsmodell14 och fotoallergisk kontaktdermatit modell15 används också ofta.
Vi presenterar en experimentell metod för att bygga ACD-modellen. Denna metod sammanfattas och optimeras på grundval av tidigare studier och vid jämförelse med flera experiment. Jämfört med andra ACD-modeller har denna modell vissa fördelar, såsom små individuella skillnader, korta experimentperioder, en liten mängd kemisk stimulering etc. Dessutom är denna studie tillämplig på möss, som inte bara är ekonomiska utan också har fler alternativ för genknockout eller transgen mössberedning16. Vi beskriver också de olika metoder som används för att övervaka ACD-framsteg i experimentet, såsom att mäta örontjocklek, använda Evans blått färgämne för att mäta inflammatorisk utsöndring etc. Denna modell kan inte bara analysera musöron, blod, mjälte och andra prover med laboratoriemedel för att utforska patogenesen av ACD, men är också tillämplig för preklinisk utvärdering av nya terapeutiska metoder, vilket har en viss marknadsföringsbetydelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
All vård och behandling av mössen var i enlighet med de riktlinjer som fastställts av Institutional Animal Care and Use Committee vid Yangzhou University och godkändes av Institutional Animal Care and Use Committee under projektlicensen SYXK(SU)2022-0044. BALB / c manliga och kvinnliga möss i åldern 6-8 veckor användes i denna studie. Varje grupp bestod av sex möss (se Materialförteckning). Burarna placerades i en temperaturkontrollerad kammare (22 ± 2 °C, 12 h ljus/mörk cykel) med fri tillgång till mat och vatten. Ett experimentellt flödesdiagram visas i figur 1.
1. Beredning av djur
- Starta modelleringen efter 1 veckas acklimatisering till miljön.
- Använd en ultraviolett lampa och 75% alkoholdesinfektionsmedel för att rengöra och desinficera miljön och bänkskivorna innan du manipulerar mössen.
OBS: För att undvika påverkan av yttre faktorer kan märkning av mössen för identifiering inte utföras på musörat; Färgning på baksidan eller på svansen kan användas som ett alternativ. - Använd en liten bomullspinne för att applicera tvålvatten på mössens buk (ca 1-2 cm2 i storlek). Raka området i riktning mot hårväxt med ett blad eller rakapparat (se Materialförteckning) i början av modelleringen (dag 0; Figur 2A).
OBS: Användningen av ett rakt rakblad för hårborttagning kräver en skicklig operatör. Om det inte utförs korrekt kan det orsaka hudirritation. Överväg att använda hårborttagningskräm, klippare eller en rakhyvel för hårborttagning. - Väg musen och jämför viktförändringarna mellan varje grupp.
2. Stimulering av buksensibilisering
- Se till att alla mindre skador på bukhuden som orsakas av rakning återhämtar sig fullständigt. Applicera buksensibilisering 2 dagar efter rakning (dag 2).
- Bered 0,5 % DNFB-lösningen: späd DNFB med en aceton-olivoljeblandning i förhållandet 4:1 (t.ex. 400 μL aceton blandat med 100 μL olivolja, se Materialförteckning). Använd en pipettpistol för att blåsa och blanda 20 gånger för att blanda DNFB-lösningen noggrant. Före varje administrering av DNFB-lösning till musen, blåsa och blanda den tre till fem gånger.
OBS: Förbered lösningen före användning och linda den i aluminiumfolie för att skydda den från direkt solljus. - Applicera 25 μL av 0,5% DNFB-lösningen på huden på det rakade området på musens buk med en pipettor (figur 2B).
- Dribbla DNFB-lösningen över mitten av bukrakningsområdet och sprid lätt med pipettorspetsens släta sida för att jämnt sprida den.
- Vid 30 s efter DNFB-stimulering, placera mössen i tomma burar utan sängkläder för att förhindra att de gnuggar av DNFB-lösningen. När DNFB-lösningen är helt torr (ca 2 min), sätt tillbaka mössen i sin ursprungliga bur.
- Använd handskar vid hantering av DNFB-lösningen eftersom den är starkt irriterande för människans hud.
3. Stimulering av öronsensibilisering
- Förbered en 0,2% DNFB-lösning enligt ovan, fordonslösningen (en 4: 1-blandning av aceton och olivolja) och rent vatten.
- Orientera muskroppen och gör öronens yttre kant nedåt under hela operationen för att förhindra att lösningen kommer in i hörselgången under DNFB-stimulering.
- På dag 4, 6, 8 och 10, använd en pipettor för att applicera 20 μL av 0,2% DNFB-lösningen eller vehikellösningen långsamt och jämnt på den inre ytan av mössens vänstra auriklar. För att undvika att DNFB-lösningen kommer in i hörselgången, använd den släta sidan av pipettorspetsen för att försiktigt fördela DNFB-lösningen under administrering. Lämna höger öron obehandlade (figur 2C).
- Vänta tills DNFB-lösningen är torr och placera mössen tillbaka i buren (ca 30 s).
- Använd handskar vid hantering av DNFB-lösningen.
4. Inspelning av musvikt och ACD-symtom
- Väg musen varje dag, börja på dag 1 och jämför med motsvarande vikt på dag 0; utvärdera effekten av ACD på mössens kroppsvikt som viktförändring (g) ± medelmedelfel (SEM).
- Ta högupplösta bilder av musöronen för att registrera ACD kliniska symtom varannan dag, från och med dag 1.
5. Mätning av örontjockleken
- Mät örontjockleken varannan dag, från och med dag 1. Mät och registrera båda öronen i detalj.
- Använd vernier-bromsok (se materialtabell) för att mäta aurikeltjockleken vid samma tidpunkt varje dag för exakta resultat (figur 3A). Stoppa vernier-bromsoken från att fortsätta inåtspänning när det finns en liten blockering för att förhindra vävnadsskador på musörat. Håll positionen fast och registrera data.
- Samla tjockleken från tre olika platser på varje öron (figur 3B). Registrera medelvärdet av de tre data som ett giltigt värde. Utvärdera öronsvullnaden i mikrometer (μm) ± standardfel för medelvärdet (SEM).
6. Utvärdering av graden av inflammatorisk svullnad
- Förbered 0,5% Evans blått färgämne (se materialförteckning): späd Evans blått färgämne med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på dag 11. Använd en labbrock och handskar hela tiden, eftersom Evans blå färgämne är något giftigt för människor.
- Immobilisera mössen med en fixator: öppna locket på fixatorn (se materialförteckning), håll mussvansen, gör musens huvud mot fixatorn och få musen att instinktivt klättra in i fixatorn. Täck locket, få mussvansen att komma ut ur hålet på locket och justera fixatorns längd för att exponera hela mussvansen.
- Torka av svansen upprepade gånger med en alkoholbomullstuss eller blötlägg den i varmt vatten i 30 sekunder och kläm försiktigt svansroten för att fylla och expandera venerna på båda sidor. Utför injektionen under bestrålning av en kall ljuskälla.
- Injicera långsamt Evans blå färglösning i mussvansvenen med en 1 mm insulinnål. Vänta i 15 minuter och ta sedan bilder av musöronen.
OBS: Sätt musen på bordet och håll den försiktigt för att exponera öronområdet för bildförvärv. Kort efter injektion med Evans blå färglösning och observera motsvarande indikationer, använd cervikal dislokation för att avliva musen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under upprepad DNFB-stimulering uppvisade musöronen i DNFB-gruppen tydliga kliniska symtom jämförbara med ACD, med känsliga områden som visar de typiska symtomen på rodnad, torrhet och till och med erosion och utsöndring. Öronadministrering av rent vatten (kontrollgrupp) eller lösningsmedelskontroll (vehikelgrupp) gav dock inte liknande symtom (figur 4).
Under tiden, i DNFB-gruppen, jämfört med det obehandlade högra örat, ökade tjockleken på vänster öra signifikant efter DNFB-stimulering (figur 5A), medan det inte fanns någon signifikant skillnad i kontroll- och vehikelgrupperna (figur 5B). De vänstra öronen hos DNFB-gruppmössen blev uppenbarligen mörkblå efter injektionen av Evans blått färgämne på den 11: e modelleringsdagen, vilket var visuellt annorlunda än höger öra. Vänster och höger öron hos möss i kontroll- och vehikelgrupperna hade dock ungefär samma färg (figur 5C).
Vidare analyserades kroppsviktsförändringar hos möss. Musens viktökning bromsades något av DNFB eller enkel vehikelstimulering (figur 6A), men resulterade inte i signifikant viktminskning (figur 6B). Samtidigt isolerades mjälten omedelbart efter att mössen offrades. Mjältindexet beräknades enligt musvikt och mjältvikt; Beräkningsformeln var som följer:
Mjältindex = mjältens vikt (g) / kroppsvikt (g) x 100
Resultatet visar att upprepad DNFB-stimulering i musörat resulterade i mjältförstoring (Figur 6C) och en ökning av mjältindex (Figur 6D), medan mjältindex hos möss i vehikelgruppen inte förändrades signifikant. Det visades att under stimulering av DNFB var immunsvarsfunktionen hos möss i DNFB-gruppen hyperaktiv.
Figur 1: Schematiskt diagram över ACD-formningstidsaxeln. Pilarna anger vad som gjordes vid motsvarande tidpunkt. De relaterade operationerna inkluderar rakning, sensibilisering, aurikelmätning, vägning, fotografering och Evans blå färgapplikation. Förkortningar: DNFB = 1-fluor-2,4-dinitrobensen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Driftsmetod för ACD-modelletablering . (A) Manipulering av bukrakning. (B) Manipulation av buksensibiliserande stimulering. (C) Manipulation av öronsensibiliserande stimulering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Utvärderingsmetod för öronsvullnad . (A) Manipulering av örontjockleksmätningar hos möss. b) Platserna för mätning av örontjocklek hos möss. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Representativ bild av effekten av DNFB-administrering på mössens öron över tid . (A) Kontrollgrupp. b) Fordonsgrupp. (C) DNFB-gruppen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Effekt av DNFB-administrering på öronsvullnad hos möss . (A) Skillnad i örontjocklek mellan vänster och höger öron hos möss under modellering. (B) Jämförelse av vänster och höger öra tjocklek hos möss i varje grupp i slutet av modelleringen. (C) Effekt av DNFB-administrering på öronvaskulär permeabilitet hos möss. (n = 6. ***p < 0,001, jämförelse mellan höger och vänster öron; N.S. = Ingen signifikant). Alla data uttrycktes som medelvärdet ± SEM. Olika behandlingsanalyser mellan grupper analyserades med hjälp av en oparad students t-test eller envägsanalys av varians med Dunnetts test. p-värden mindre än 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Effekter av DNFB-administrering på kroppsvikt och mjältindex hos möss. (A) Förändringar i kroppsvikt hos möss i varje grupp under modellering. (B) Jämförelse av förändringar i kroppsvikt hos möss i varje grupp på dag 11. (C) Jämförelse av mjältens storlek i varje grupp av möss. d) Jämförelse av mjältindex mellan grupper av möss. (n = 6. *p < 0,05, jämfört med kontrollgruppen; N.S. = Ingen signifikant). Alla data uttrycktes som medelvärdet ± SEM. Olika behandlingsanalyser mellan grupper analyserades med hjälp av en oparad students t-test eller envägsanalys av varians med Dunnetts test. p-värden mindre än 0,05 ansågs vara statistiskt signifikanta. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här för att inducera ACD-liknande symtom i öronen på möss kan användas för att studera patofysiologin för ACD och som ett screeningverktyg för utveckling av nya läkemedel.
Det finns två viktiga steg för att upprätta en ACD-modell: initial sensibilisering och efterföljande stimulering. Magen är vanligtvis platsen för initial sensibilisering, men det efterföljande stimuleringsstället valdes något annorlunda. Tidigare studier har visat att de flesta forskare väljer att använda kemiska sensibilisatorer som DNFB / DNCB eller oxazolon för att etablera ACD-modeller på rygg eller nacke hos möss, och det är oundvikligt att använda blad eller trimmare för att depilera modelleringsområdet för möss17,18,19. Detta steg kan dock enkelt förstöra hudbarriären och påverka de efterföljande experimenten. Dessutom är det droppande läkemedlet svårt att jämnt fördela och absorberas lätt av det närliggande håret på grund av det stora området på nacken och påverkan av det omgivande håret.
I detta experimentella protokoll fann vi att utförandet av manipulationen för efterföljande stimulering i den inre ytan av musauriklar gjorde det möjligt för oss att lindra några av ovanstående problem, vilket hjälpte till att etablera en stabil och mycket reproducerbar ACD-modell. I enlighet med våra upprepade experiment20 optimerade och justerade vi också intervallet för sensibiliserande stimulans och experimentperioden. I enlighet med den givna experimentella metoden kan en mycket uppenbar modelleringseffekt erhållas den 10: e dagen. Dessutom, eftersom modelleringsområdet ligger på den relativt oberoende inre sidan av öronen, på vilken yttre faktorer har mindre störningar, är det mindre skillnad i svårighetsgraden av ACD hos möss i samma experimentgrupp i detta experiment.
Detta experimentella protokoll har också vissa brister. Först bör applicering av kemiska sensibilisatorer på örat utföras med försiktighet för att undvika att kemikalier kommer in i hörselgången och skadar mössen. För det andra används ACD-modeller ofta som ett medel för att studera kronisk klåda hos möss. I ACD-modellen som etablerades på mössens nacke kunde skraporna hos möss observeras intuitivt, och svårighetsgraden av klåda hos möss kunde mätas med detta. Även om skrapbeteende också observerades hos möss under vårt experiment, hade mössen också spontana öronrengöringsvanor, vilket gjorde det svårt att skilja från patologiskt repbeteende. Detta begränsade användningen av denna modell för att observera ACD-inducerat repbeteende. Huruvida protokollet är tillämpligt på denna typ av studie är föremål för ytterligare experimentell verifiering.
För att spåra det patologiska förloppet av ACD användes en mängd olika övervakningsmetoder, såsom kliniska öronsymtom, örontjockleksmätning och reflektion av vaskulär permeabilitet. Dessa patologiska indikatorer är mer synliga i örat än i nacke och rygg. När du mäter en mus örontjocklek uppstår mätfel på grund av musens kämpande beteende och örats ojämna tjocklek. För att minska mätfel bör mätningar utföras på tre olika ställen på varje öra. Genom att injicera Evans färgämne för att utvärdera den vaskulära permeabiliteten hos det modellerade området kan svårighetsgraden av dermatit ses, men detta kräver också en hög framgångsgrad för svansveninjektion. Om ytterligare jämförande analys krävs kan absorbansen hos supernatanten i musörvävnadshomogenat bestämmas.
Det är också värt att nämna att i vår tidigare forskning20 var öronvävnadsstrukturen välorganiserad och mindre påverkad av andra oordnade vävnadsstrukturer (t.ex. hårsäckar) än i nacke och rygg hudvävnad, vilket ledde till att välja detta område för forskning.
Sammanfattningsvis är modellen av ACD som beskrivs i detta dokument en stabil och effektiv modelleringsmetod och är värd att främja i efterföljande studier av allergisk kontaktdermatit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar inga intressekonflikter i detta arbete.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (NSFC) till N.-N. Y. (81904212); Jiangsu projekt för vetenskap och teknik inom traditionell kinesisk medicin (YB201995); och det särskilda finansieringsprojektet för postdoktorala forskare i Kina (2020T130562).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB) | Merck | 200-734-3 | 1-Fluoro-2,4-dinitrobenzene, ≥99% |
| Acetone | Sinopharm Chemical Reagent Co. LTD | 10000418 | ≥99.5% |
| Aluminum foil | Cleanwrap | CF-2 | |
| Evans blue dye | Solarbio | 314-13-6 | Dye content approx. 80% |
| Mouse fixator | ZHUYANBANG | GEGD-SM1830 | |
| Olive oil | Solarbio | 8001-25-0 | 500 ml |
| Pipet tip | Biofount | FT-200 | 10 - 200 μl |
| Pipettor | Eppendorf AG | 3123000250 | 20 - 200 μl |
| Razor blade | Shanghai Gillette Co. LTD | 74-S | |
| Vernier calipers | Delixi Electric | DECHOTVCS1200 |
References
- Neale, H., Garza-Mayers, A. C., Tam, I., Yu, J. Pediatric allergic contact dermatitis. Part I: Clinical features and common contact allergens in children. Journal of the American Academy of Dermatology. 84 (2), 235-244 (2021).
- Koppes, S. A., et al. Current knowledge on biomarkers for contact sensitization and allergic contact dermatitis. Contact Dermatitis. 77 (1), 1-16 (2017).
- Martin, S. F., et al. Mechanisms of chemical-induced innate immunity in allergic contact dermatitis. Allergy. 66 (9), 1152-1163 (2011).
- Kimber, I., Basketter, D. A., Gerberick, G. F., Dearman, R. J.
- Vocanson, M., Hennino, A., Rozieres, A., Poyet, G., Nicolas, J. F. Effector and regulatory mechanisms in allergic contact dermatitis. Allergy. 64 (12), 1699-1714 (2009).
- Gamradt, P., et al. Inhibitory checkpoint receptors control CD8+ resident memory T cells to prevent skin allergy. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 143 (6), 2147.e9-2157.e9 (2019).
- Fraginals, R., Blasi, N. A., Lepoittevin, J. P., Benezra, C. A successful murine model for contact sensitization to a sesquiterpene-alpha-methylene-gamma-butyrolactone: sensitization to alantolactone in four strains of mice. The Journal of Investigative Dermatology. 97 (3), 473-477 (1991).
- Knop, J., Riechmann, R., Neumann, C., Macher, E. Modulation of suppressor mechanisms in allergic contact dermatitis: 5. Evidence that inhibition of suppressor T lymphocytes by Corynebacterium parvum is mediated by interferon. The Journal of Investigative Dermatology. 79 (6), 385-388 (1982).
- Polak, L., Scheper, R. J. Antigen-specific T-cell lines in DNCB-contact sensitivity in guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 80 (5), 398-402 (1983).
- Witten, V. H., March, C. H. Studies of the mechanism of allergic eczematous contact dermatitis. II. Use of C14 labelled 2:4-dinitrochlorobenzene in guinea pigs. The Journal of Investigative Dermatology. 31 (2), 97-102 (1958).
- Knop, J., Riechmann, R., Macher, E. Modulation of suppressor mechanism in allergic contact dermatitis. IV. Selective inhibition of suppressor T-lymphocytes by serum obtained from Corynebacterium parvum treated mice. The Journal of Investigative Dermatology. 77 (6), 469-473 (1981).
- Rubic-Schneider, T., et al. GPR91 deficiency exacerbates allergic contact dermatitis while reducing arthritic disease in mice. Allergy. 72 (3), 444-452 (2017).
- Stampf, J. L., Benezra, C., Byers, V., Castagnoli Jr, N. Induction of tolerance to poison ivy urushiol in the guinea pig by epicutaneous application of the structural analog 5-methyl-3-n-pentadecylcatechol. The Journal of Investigative Dermatology. 86 (5), 535-538 (1986).
- Dhingra, N., et al. Molecular profiling of contact dermatitis skin identifies allergen-dependent differences in immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 134 (2), 362-372 (2014).
- Maguire Jr, H. C., Kaidbey, K. Experimental photoallergic contact dermatitis: a mouse model. The Journal of Investigative Dermatology. 79 (3), 147-152 (1982).
- Qiu, Z., et al. A dysregulated sebum-microbial metabolite-IL-33 axis initiates skin inflammation in atopic dermatitis. The Journal of Experimental Medicine. 219 (10), e2021397 (2022).
- Kim, H., et al. Anti-inflammatory activities of Dictamnus dasycarpus Turcz., root bark on allergic contact dermatitis induced by dinitrofluorobenzene in mice. Journal of Ethnopharmacology. 149 (2), 471-477 (2013).
- Zhou, P., et al. Effect of 6'-acetylpaeoniflorin on dinitrochlorobenzene-induced allergic contact dermatitis in BALB/c mice. Immunologic Research. 64 (4), 857-868 (2016).
- Donglang, G., et al. Comparative study on different skin pruritus mouse models. Frontiers in Medicine. 8, 630237 (2021).
- Yang, N., Shao, H., Deng, J., Liu, Y. Network pharmacology-based analysis to explore the therapeutic mechanism of Cortex Dictamni on atopic dermatitis. Journal of Ethnopharmacology. 304, 116023 (2023).
