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Immunology and Infection

Viabilitätstest von Trichoderma stromaticum-Konidien in mononuklear gewonnenen Makrophagen des menschlichen peripheren Blutes

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65231
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 1
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova
* These authors contributed equally

Summary

Die Technik der Phagozytose von Pilzkonidien durch Makrophagen wird häufig für Studien verwendet, die die Modulation der Immunantwort gegen Pilze untersuchen. Der Zweck dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Bewertung der Phagozytose- und Clearance-Fähigkeiten von mononuklearen Makrophagen aus humanem peripherem Blut vorzustellen, die mit Trichoderma stromaticum conidia stimuliert wurden.

Abstract

Makrophagen stellen eine entscheidende Verteidigungslinie dar und sind dafür verantwortlich, das Wachstum und die Besiedlung von Krankheitserregern in verschiedenen Geweben zu verhindern. Die konidiale Phagozytose ist ein Schlüsselprozess, der die Untersuchung der zytoplasmatischen und molekularen Ereignisse ermöglicht, die an Makrophagen-Pathogen-Interaktionen beteiligt sind, sowie die Bestimmung des Todeszeitpunkts von internalisierten Konidien. Die Technik der Phagozytose von Pilzkonidien durch Makrophagen wird häufig für Studien verwendet, die die Modulation der Immunantwort gegen Pilze untersuchen. Die Evasion der Phagozytose und die Flucht der Phagosomen sind Mechanismen der Pilzvirulenz. Hier berichten wir über die Methoden, die für die Analyse der Phagozytose, der Clearance und der Lebensfähigkeit von T. stromaticum conidia verwendet werden können, einem Pilz, der als biologisches Schädlingsbekämpfungs- und Biodüngemittel verwendet wird und in der Lage ist, menschliche Infektionen zu induzieren. Das Protokoll besteht aus 1) Trichoderma-Kultur, 2) Waschen zur Gewinnung von Konidien, 3) der Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) unter Verwendung der Polysaccharose-Lösungsmethode und der Differenzierung der PBMCs in Makrophagen, 4) einer In-vitro-Phagozytose-Methode unter Verwendung runder Glasdeckgläser und Färbung und 5) einem Clearance-Assay zur Beurteilung der Lebensfähigkeit der Konidien nach Konidienphagozytose. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Techniken verwendet werden können, um die Effizienz der Pilzbeseitigung von Makrophagen zu messen.

Introduction

Die Gattung Trichoderma (Ordnung: Hypocreales, Familie: Hypocreaceae) besteht aus ubiquitären, saprophytischen Pilzen, die Parasiten anderer Pilzarten sind und in der Lage sind, eine Reihe kommerziell nützlicher Enzyme zu produzieren1. Diese Pilzarten werden für die Herstellung von heterologen Proteinen2, die Herstellung von Zellulose3, Ethanol, Bier, Wein und Papier4, in der Textilindustrie5, der Lebensmittelindustrie6 und in der Landwirtschaft als biologische Schädlingsbekämpfungsmittel 7,8 verwendet. Neben dem industriellen Interesse an diesen Pilzarten hat die steigende Zahl von Infektionen beim Menschen einigen Trichoderma-Arten den Status opportunistischer Krankheitserreger verliehen9.

Trichoderma spp. wächst schnell in der Kultur, mit anfänglich weißen und watteartigen Kolonien, die sich grünlich-gelb bis dunkelgrün verfärben10. Sie sind an ein breites Spektrum von pH- und Temperaturbedingungen angepasst, und die opportunistischen Arten sind in der Lage, bei physiologischem pH-Wert und Temperaturen zu überleben und so verschiedene menschliche Gewebe zu besiedeln 11,12,13. Wichtig ist, dass der Anstieg der Infektionsrate von Trichoderma spp. mit Virulenzfaktoren in Verbindung gebracht werden kann, und diese sind nicht gut untersucht. Darüber hinaus sind Studien, die sich auf das Verständnis der Immunantwort gegen opportunistische Trichoderma-Arten konzentrieren, noch selten.

Während einer Infektion stellen Makrophagen zusammen mit Neutrophilen die Verteidigungslinie dar, die für die Phagozytose verantwortlich ist, und verhindern so das Wachstum und die Besiedlung von Krankheitserregern in verschiedenen Geweben. Mit Hilfe von Mustererkennungsrezeptoren, wie z. B. Toll-like-Rezeptoren und C-Typ-Lektinrezeptoren, phagozytieren Makrophagen Pilze und verarbeiten sie zu Phagolysosomen, wodurch ein Atemausbruch, die Freisetzung entzündungsfördernder Zytokine und die Zerstörung der phagozytozytierten Mikroorganismen gefördert werden14. Der Mechanismus der Phagozytose kann jedoch durch verschiedene mikrobielle Strategien, wie z. B. die Größe und Form der Pilzzellen, beeinflusst und umgangen werden. das Vorhandensein von Kapseln, die die Phagozytose behindern; Verringerung der Anzahl der Phagozytose-induzierenden Rezeptoren; der Umbau der Struktur der Aktinfasern im Zytoplasma; Behinderung der Bildung von Pseudopodien; und Phagosom oder Phagolysosom entweichen nach dem Phagozytoseprozess14.

Viele Krankheitserreger, darunter Cryptococcus neoformans, nutzen Makrophagen als Nische, um im Wirt zu überleben, sich zu verbreiten und Infektionen zu induzieren15. Der Phagozytose- und Clearance-Assay wird verwendet, um die Immunantwort gegen Krankheitserreger zu bewerten und die mikrobiellen Strategien zu identifizieren, die eingesetzt werden, um das angeborene Immunsystem zu umgehen 15,16,17. Diese Art von Technik kann auch verwendet werden, um die differentielle Kinetik von Phagozytose, verzögerter Phagosomenversauerung und oxidativem Ausbruch zu untersuchen, die zu einer reduzierten Pilzabtötung führen18.

Verschiedene Methoden können verwendet werden, um die Phagozytose, das Überleben der Pilze und die Umgehung des Phagosomenreifungsprozesses zu bewerten. Dazu gehören die Fluoreszenzmikroskopie, mit der die Phagozytose, die zelluläre Lage und die während der Phagozytose produzierten Moleküle beobachtetwerden 19; Durchflusszytometrie, die quantitative Daten zur Phagozytose liefert und zur Bewertung der verschiedenen am Prozess beteiligten Marker verwendet wird20,21; intravitale Mikroskopie, die zur Beurteilung des mikrobiellen Einfangs und der Phagosomenreifung verwendet wird22; Antikörper-vermittelte Phagozytose, die verwendet wird, um die Spezifität des Phagozytoseprozesses für einen Krankheitserreger zu beurteilen23; und andere 24,25,26,27.

Das hier vorgestellte Protokoll verwendet eine gängige, kostengünstige und direkte Methode, bei der ein optisches Mikroskop und ein Plattenwachstumsassay verwendet werden, um die Phagozytose und Abtötung von Pilzkonidien zu beurteilen. Dieses Protokoll bietet den Lesern Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die Durchführung des Phagozytose- und Clearance-Assays mit mononuklearen Makrophagen aus menschlichem peripherem Blut, die T. stromaticum ausgesetzt sind. PBMCs wurden verwendet, weil Trichoderma-Konidien als biologischer Schädlingsbekämpfungsmittel gegen Phytopathogene und als Biodünger für Pflanzenkulturen weltweit eingesetzt werden und mehrere Infektionen beim Menschen verursacht haben, die als Trichodermose bezeichnet werden. Darüber hinaus gibt es bisher nur zwei Arbeiten, die sich mit der Interaktion zwischen Trichoderma conidia und dem menschlichen Immunsystem befassen, in denen wir Neutrophile28 und Autophagie in Makrophagen29 untersucht haben. Dieser Artikel zeigt zunächst, wie die Phagozytose der Konidien von T. stromaticum durch PBMC-abgeleitete Makrophagen untersucht werden kann, und dann, wie die Lebensfähigkeit der verschlungenen Konidien mit einfachen mikroskopiebasierten Techniken beurteilt werden kann. Dieses Protokoll kann Untersuchungen zur Makrophagen-assoziierten Immunantwort oder zu Mechanismen im Zusammenhang mit der Modulation des Immunsystems weiter erleichtern.

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Protocol

Ethische Überlegungen und menschliche Subjekte
Alle in dieser Studie beschriebenen Experimente mit Menschen wurden gemäß der Deklaration von Helsinki und den brasilianischen Bundesgesetzen durchgeführt und von der Ethikkommission der Staatlichen Universität Santa Cruz genehmigt (Projektkennung: 550.382/ 2014).

Menschliches peripheres Blut wurde von gesunden Freiwilligen aus der Stadt Ilhéus, Bahia, Brasilien, entnommen, die keinen beruflichen Aktivitäten ausgesetzt waren, die mit dem untersuchten Pilz in Verbindung standen. Personen mit berichteten gesundheitlichen Problemen oder der Einnahme von Medikamenten wurden ausgeschlossen. Alle Probanden erklärten sich freiwillig zur Teilnahme bereit und unterschrieben eine Einverständniserklärung, bevor sie in diese Studie aufgenommen wurden.

1. Herstellung der Reagenzien und Lösungen

HINWEIS: Bereiten Sie die folgenden Reagenzien und Lösungen vor, bevor Sie fortfahren. In der Materialtabelle (TOM) finden Sie Informationen zum Reagenz und zum Materiallieferanten.

  1. Bereiten Sie 1x (PBS) eine ausgewogene sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung zu.
    HINWEIS: In diesem Protokoll wurde kein endotoxinfreies PBS verwendet.
  2. Bereiten Sie Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA)-Medium vor und gießen Sie 20 ml in jede Petrischale für die T. stromaticum-Kultur . Bereiten Sie sechs Platten mit PDA für jeden Spender vor und verwenden Sie eine Platte für jede Erkrankung: 3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 120 h. Verwenden Sie außerdem drei Platten für jede Kontrolle: drei für die Trichoderma-Kontrolle und drei für die R10-Medium-Kontrolle. Verwenden Sie Petrischalen von 60 mm x 15 mm oder 100 mm x 15 mm für eine optimale Konidienerholung.
  3. 100% Glycerin sterilisieren.
  4. Bereiten Sie ein R10-Medium für die Zellkultur vor: RPMI-Medium, ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Antibiotikum (Penicillin/Streptomycin).
  5. Sterilisieren Sie destilliertes Wasser für die Zelllyse.
  6. Bereiten Sie Wasser mit einem pH-Wert von 7,0 für den Färbeprozess vor.
    HINWEIS: Falls erforderlich, stellen Sie den pH-Wert mit einem pH-Messgerät und Lösungen von 0,1 M/L NaOH und 0,1 M/L HCl ein.
  7. Rundes Deckglas (13 mm) und Pinzette sterilisieren.

2. Kultur und Verarbeitung von Trichoderma stromaticum

  1. Herstellung eines Mutterstocks (M1) von T. stromaticum:
    ANMERKUNG: Ein Muttertier (M1) ist erforderlich, um sicherzustellen, dass alle Versuche aus der Kultur derselben frischen Generation (F1) durchgeführt werden.
    1. Züchten Sie ein T. stromaticum-Inokulum in Petrischalen mit PDA bei 28 °C im Dunkeln für 7-10 Tage, bis die Konidien beobachtet werden und die Kultur grün wird.
    2. Waschen Sie die Kultur von T. stromaticum. Geben Sie 3-5 ml PBS mit einer Pipette auf die Kulturoberfläche. Sammeln Sie das PBS von der Platte und geben Sie es erneut über die Kultur, um die Konidien mit der Pipette allmählich zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang so oft wie nötig, bis die Aufhängung dunkelgrün wird.
      HINWEIS: Alternativ wird ein sanftes Waschen der Kultur durch Zugabe von 3-5 ml PBS auf die Platte und anschließende Durchführung einer kreisenden Bewegung empfohlen, bis die Suspension grün wird, um die Konidien zurückzugewinnen. Durch wiederholtes Pipettieren können mehr Konidien gesammelt werden.
    3. Die gewonnene Suspension von der Platte wird mit einer Pipette in ein steriles 15-ml-Röhrchen überführt. Wiederholen Sie die Schritte 2.1.2-2.1.3 so oft wie nötig, um mehr Konidien zu erhalten.
    4. Die Suspension wird bei 1.160 x g für 5 min bei 12 °C zentrifugiert und das Pellet in 5 ml PBS resuspendiert. Wiederholen Sie diesen Schritt (2.1.4) dreimal, um eine hyphenfreie Aufhängung zu erhalten.
      HINWEIS: Um das Pellet richtig zu resuspendieren, wird nach der Zentrifugation ein kurzes Vortexen empfohlen.
    5. Resuspendieren Sie das fertige Pellet in 2-3 ml PBS und zählen Sie die Konidien in einer Neubauer-Kammer mit einer Verdünnung von 1:100 oder 1:1.000.
      HINWEIS: Unter optimalen Bedingungen kann eine Endkonzentration von 2 x 108 Konidien/ml aus der Kultur gewonnen werden. Die Beurteilung der Lebensfähigkeit der Konidien mit der Trypanblau-Ausschlussmethode ist optional.
    6. Aliquotieren Sie die Suspension in sterile 1,5-ml-Röhrchen, indem Sie 0,5 ml der Konidiensuspension (aus Schritt 2.1.5) in jedes Röhrchen geben. Fügen Sie dann 0,5 ml steriles 100%iges Glycerin hinzu, um M1-Vorräte zu erhalten. Kurz vortexen, die Röhrchen identifizieren und bei −20 °C oder −80 °C lagern.
  2. Kultivierung von T. stromaticum und Gewinnung von Konidien für das Experiment
    1. Platte 10 μl der M1-Suspension (hergestellt in Schritt 2.1) in PDA bei 28 °C im Dunkeln für 7-10 Tage, bis die Konidien beobachtet werden und die Kultur grün wird, um die frische F1-Generation zu erhalten.
      HINWEIS: Um eine frische T. stromaticum-Kultur für das Experiment zu gewährleisten, ist die für das Pilzwachstum und die für die Makrophagendifferenzierung erforderliche Zeit zu bewerten.
    2. Sammeln Sie die Konidien und wiederholen Sie die Schritte 2.1.2-2.1.4.
    3. Resuspendieren Sie das endgültige Pellet in 2-3 ml PBS. Beurteilen Sie die Lebensfähigkeit der Konidien mit der Trypanblau-Ausschlussmethode oder zählen Sie die Konidien wie in Schritt 2.1.5 beschrieben.

3. Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMC)

ANMERKUNG: Die PBMCs werden nach der Dichtebarrierenmethode unter Verwendung einer Polysaccharoselösung mit einer Dichte von 1,077 g/ml30 erhalten.

  1. Aliquotieren Sie 15 ml der Polysaccharoselösung in ein 50-ml-Röhrchen für jede Spenderprobe, die entnommen wird.
  2. Entnehmen Sie 20 ml Blut von jedem Spender mit drei bis vier EDTA-Röhrchen. Rekrutieren Sie mindestens vier Spender pro Experiment. Das Blut der Spender darf nicht gepoolt werden. Verwenden Sie stattdessen jede Probe separat als biologisches Replikat. Für jeden Spender wird das Blut in ein 50-ml-Röhrchen überführt und PBS hinzugefügt, um ein Endvolumen von 35 ml zu erhalten.
  3. Die Blutspritze (Schritt 3.2) wird langsam entlang der Wand des Röhrchens mit der Polysaccharoselösung (Schritt 3.1) übertragen, um eine zweiphasige Suspension zu bilden.
    HINWEIS: Um zu verhindern, dass sich das Blut mit der Polysaccharoselösung vermischt, fügen Sie das Blut langsam hinzu. Es wird empfohlen, mindestens 7 ml Blut von jedem Spender für die PBMC-Isolierung zu verwenden.
  4. Das Röhrchen mit der biphasischen Suspension wird sofort bei 1.600 x g für 30 min bei 24 °C zentrifugiert. Programmieren Sie die Zentrifugation der PBMCs: Verwenden Sie die Beschleunigung 1 und die Verzögerung 0, um ein abruptes Stoppen der Zentrifugation zu vermeiden.
  5. Beobachten Sie die Bildung eines weißen Rings, der die PBMCs nach der Zentrifugation enthält. Die roten Blutkörperchen und Granulozyten befinden sich in der unteren Schicht, die nächste Schicht enthält die Polysaccharoselösung und die PBMCs befinden sich im weißen Ring zwischen der Polysaccharoselösung und dem Plasma (obere Schicht). Sammeln Sie den weißen Ring, indem Sie vorsichtig mit einer Pipette oder einer sterilen Pasteur-Pipette absaugen, um keine roten Blutkörperchen, Plasma oder Polysaccharoselösung auffangen, und in ein 15-ml-Röhrchen überführen.
  6. Geben Sie PBS in das 15-ml-Röhrchen, das die PBMCs enthält, um ein Endvolumen von 10 ml zu erhalten. Die Suspension wird homogenisiert und das Röhrchen bei 1.600 x g für 30 Minuten bei 24 °C zentrifugiert.
  7. Die Zellen werden dreimal bei 1.600 x g für 5 Minuten bei 24 °C mit 10 ml PBS gewaschen. Anschließend wird das endgültige Pellet in 2 ml R10-Medium resuspendiert.
  8. Beurteilen Sie die Zellviabilität mit der Trypanblau-Ausschlussmethode und zählen Sie die Zellen in einer Neubauer-Kammer.

4. Phagozytose-Kinetik

HINWEIS: Die mononukleär abgeleiteten Makrophagen des menschlichen peripheren Blutes werden mit T. stromaticum conidia bei einer Infektionsmultiplizität (MOI) von 1:10 oder nur R10-Medium als Kontrolle behandelt. Die Multiplizität der Infektion (MOI) stellt das Verhältnis der zu den Infektionszielen hinzugefügten Infektionserreger dar und wird als absolute Zahlen dargestellt: MOI = Erreger:Ziele31. Hier verwenden wir 1 T. stromaticum conidia (Wirkstoff) für 10 Makrophagen (Targets). Anschließend werden die Zellen bei 37 °C und 5 % CO2 für verschiedene Zeiträume (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 120 h) inkubiert. Als nächstes wird ein rundes Deckglas aus Glas verwendet, um die adhärenten Makrophagen, die am Phagozytoseprozess beteiligt sind, unter dem Mikroskop sichtbar zu machen. Es wird eine experimentelle Abbildung zur Verfügung gestellt (Abbildung 1).

HINWEIS: Es wird empfohlen, 24-Well-Platten zu verwenden.

  1. Behandlung von humanen Makrophagen mit T. stromaticum-Konidien
    1. Geben Sie ein steriles rundes Deckglas (13 mm) mit einer sterilen Pinzette in jede Vertiefung.
    2. Passen Sie das Volumen der in den Schritten 3.7-3.8 erhaltenen Zellsuspension auf die Platte 8 x 105 Zellen pro Vertiefung auf ein Endvolumen von 1 ml mit R10-Medium an. Verwenden Sie ein inverses Mikroskop, um die Zellmorphologie zu beurteilen.
      HINWEIS: Die Zellen müssen im Medium suspendiert sein und eine abgerundete Morphologie aufweisen.
    3. Die Zellen werden bei 37 °C unter einer 5%igenCO2-Atmosphäre für 7 Tage inkubiert und das Medium alle 2 Tage durch frisches R10-Medium ersetzt, um die Monozyten in Makrophagen zu differenzieren32. Beobachten Sie die Zellmorphologie mit einem inversen Mikroskop. Die Makrophagen weisen eine spindelförmige Morphologie mit abgeflachten und ausgedehnten Formen auf; Ein erhöhtes zytoplasmatisches Verhältnis und das Vorhandensein von Pseudopodien können ebenfalls beobachtet werden. Suchen Sie nach anhaftenden mononuklearen Makrophagen.
      HINWEIS: Ein sehr kleiner Anteil undifferenzierter Monozyten kann im Medium suspendiert bleiben.
    4. Entfernen Sie das Medium jeder Vertiefung mit einer Pipette und waschen Sie die Zellen mit 1 ml PBS, um Ablagerungen und nicht anhaftende Zellen zu entfernen.
    5. Die in Schritt 2.2 hergestellte Suspension wird verwendet, um eine neue Suspension von T. stromaticum conidia in einer Endkonzentration von 8 x 104 Konidien/ml in R10-Medium herzustellen.
    6. Man fügt 1 ml der in Schritt 4.1.5 hergestellten Konidiensuspension in jede Behandlungsvertiefung (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 120 h) hinzu, um ein Trägheitsmoment von 1:10 zu erhalten. Zu den Kontrollen nur 1 ml R10-Medium in die Vertiefung geben.
    7. Die Makrophagen werden 3 h lang mit T. stromaticum conidia bei 37 °C unter einer 5%igen CO2 -Atmosphäre getestet. Entfernen Sie nach 3 Stunden das Medium und waschen Sie die Zellen, um die nicht phagozytierten Konidien zu entfernen.
    8. Geben Sie 1 ml R10-Medium in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für verschiedene Zeiten (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h und 120 h) bei 37 °C unter einer 5%igen CO2 -Atmosphäre.
  2. Färbung und Analyse
    1. Nach Abschluss der entsprechenden Inkubation (Schritt 4.1.8) wird das Medium aus jeder Vertiefung entnommen und 1 ml PBS in diese Vertiefung gegeben.
    2. Entfernen Sie die runden Glasdeckgläser mit einer sterilen Pinzette und einer Nadel zum Färben mit einem Färbeset aus den Vertiefungen.
      HINWEIS: Alternativ kann die Färbung auch mit der Mai-Grünwald-Giemsa-Färbung33 erfolgen.
    3. Geben Sie zu jedem der runden Deckgläser Fleckenfixateur (5 s), Farbstoff 1 (5 s), Farbstoff 2 (2 s) und gepuffertes Wasser pH 7,0 (5 s), die Bestandteile des Färbekits. Warten Sie, bis sie trocken sind, und fixieren Sie die Deckgläser mit einem Passiermittel auf einem Objektträger.
    4. Quantifizieren Sie das Ergebnis: Zählen Sie insgesamt 100 Makrophagen (Mø) für jede Zeitbedingung. Zählen Sie mit einem Lichtmikroskop die Anzahl der Makrophagen mit phagozytierten Konidien mit einem 100-fachen Objektiv und Immersionsöl (Gleichung [1]).
      Equation 1 (1)
    5. Ermitteln Sie die Anzahl der phagozytierten Konidien pro Makrophage: Korrelieren Sie die in 100 Makrophagen vorhandenen Konidien dividiert durch die Anzahl der Makrophagen mit mindestens einem phagozytierten Konidium (Gleichung [2])34.
      Equation 2 (2)
      HINWEIS: Um die Konidien auszuwerten und zu zählen, kann die ImageJ-Software verwendet werden35.
    6. Fotografieren Sie die Phagozytose von jeder Probe und jeder Zeitbedingung mit 40x- und 100x-Objektiven, um die Ergebnisse zu präsentieren.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des Phagozytose- und Konidialviabilitätstests unter Verwendung von mononuklearen Makrophagen aus humanem peripherem Blut. (1-10) Phagozytose-Assay: Das T. stromaticum muss in PDA gezüchtet werden, und die Konidien werden durch Waschen der Platte mit PBS gewonnen. Die PBMCs sollten mit der Dichtebarrieremethode unter Verwendung des beschriebenen Protokolls isoliert, in 24-Well-Platten mit sterilen Rundglas-Deckgläsern für 7 Tage zur Differenzierung in Makrophagen kultiviert und dann mit einem MOI von 1:10 mit unterschiedlichen Zeitintervallen behandelt werden. Die runden Deckgläser aus Glas werden entfernt und mit dem Färbekit gefärbt und die Ergebnisse lichtmikroskopisch analysiert. (1-8,11-13) Conidia Viability Assay: Nach der Isolierung werden die PBMCs in 24-Well-Platten ohne runde Deckgläser für 7 Tage zur Differenzierung in Makrophagen kultiviert und dann mit einem MOI von 1:10 für verschiedene Zeitintervalle behandelt. Die Zellen müssen durch Inkubation mit destilliertem Wasser lysiert werden; Die Suspension wird dann zentrifugiert, und dann wird das resuspendierte Pellet in PDA plattiert, um die Wachstumskinetik von Trichoderma zu analysieren. Diese Abbildung wurde anhand einer Bilddatenbank erstellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

5. Conidialer Viabilitätstest nach Phagozytose

HINWEIS: Es wird eine experimentelle Entwurfsabbildung bereitgestellt (Abbildung 1).

HINWEIS: Verwenden Sie 24-Well-Platten.

  1. Fordern Sie die vom Menschen stammenden Makrophagen mit T. stromaticum conidia heraus.
    1. Wiederholen Sie die Schritte 4.1.2-4.1.8, um die Monozyten zu differenzieren, und behandeln Sie die Makrophagen mit T. stromaticum conidia.
      HINWEIS: Verwenden Sie keine runden Deckgläser aus Glas in den Vertiefungen. Verwenden Sie die gleichen Zeitintervalle, die für die Bestimmung der Phagozytosekinetik verwendet werden, damit die Phagozytose mit der konidialen Lebensfähigkeit korreliert werden kann.
    2. Den Einfluss des R10-Mediums auf das Wachstum von T. stromaticum zu bewerten, indem Wells mit der in Schritt 4.1.5 hergestellten Suspension (R10-Medium + Konidien) als Kontrolle verwendet werden.
  2. Konidialer Viabilitätstest
    1. Entfernen Sie das Medium nach jeder Inkubationszeit (3 Stunden, 24 Stunden, 48 Stunden, 72 Stunden, 96 Stunden und 120 Stunden) und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS, um die Konidien zu entfernen, die nicht phagozytiert wurden.
      HINWEIS: Die Kontrolle, die R10-Medium + Konidien enthält, sollte nicht gewaschen werden.
    2. Geben Sie 0,5 ml steriles destilliertes Wasser in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C und 5 % CO2 für 30 Minuten. Nach dieser Zeit beobachten Sie die Zellmorphologie unter einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen lysiert wurden.
    3. Sammeln Sie die Suspension und füllen Sie sie in 1,5-ml-Röhrchen um. Zentrifugieren Sie die Suspension mit einer Minizentrifuge bei 6.000 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
    4. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig, resuspendieren Sie das Pellet in 10 μl sterilem destilliertem Wasser und inokulieren Sie 10 μl der Suspension bei 28 °C im Dunkeln in die PDA-haltige Platte.
    5. Bereiten Sie eine Positivkontrolle für das Wachstum von T. stromaticum vor: Verwenden Sie die Suspension von T. stromaticum conidia (Schritt 2.2), um eine neue Suspension mit einer Endkonzentration von 8 x 106 Konidien/ml herzustellen. Platte 10 μl dieser Suspension in PDA bei 28 °C im Dunkeln.
      HINWEIS: 10 μl dieser Suspension enthalten die gleiche Anzahl von Konidien (8 x 104), die zur Infektion der mononuklearen Makrophagen im Blut verwendet wurde. Der Unterschied zwischen dieser Positivkontrolle und der in Schritt 5.1.2 erwähnten besteht darin, dass die oben in Schritt 5.1.2 erwähnte Kontrolle verwendet wird, um den möglichen Einfluss des R10-Mediums auf das Trichoderma-Wachstum während der Zeit der Phagozytose zu bewerten. Diese Positivkontrolle in Schritt 5.2.5 unter Verwendung der in PBS gesammelten Suspension von T. stromaticum conidia stellt eine Kontrolle für das Trichoderma-Wachstum ohne den Einfluss von R10-Medium dar, um das natürliche Wachstum des Pilzes widerzuspiegeln. Mit dieser Kontrolle kann beurteilt werden, ob das R10-Medium das Trichoderma-Wachstum beeinflusst.
    6. Beobachten Sie jeden Tag die Wachstumskinetik von T. stromaticum in PDA und fotografieren Sie die Kultur.
    7. Analyse: Zur Bewertung der Ergebnisse können zwei Punkte herangezogen werden: 1) die Zeit (in Tagen), die die Kultur benötigt, um die gesamte Kulturplatte zu besetzen, und 2) die Zeit (in Tagen) bis zum Auftreten der charakteristischen grünen Pigmentierung der T. stromaticum conidia in Kultur.

6. Statistische Analyse

  1. Verwenden Sie einen Kruskal-Wallis-Test, um statistisch signifikante Unterschiede zwischen den 8 Gruppen/Behandlungen zu ermitteln. Betrachten Sie p < 0,05 als statistisch signifikant. Alle Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. In den Abbildungen gibt # die statistische Signifikanz bei p < 0,05 an.

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Representative Results

Die Technik der Phagozytose von Pilzkonidien durch Makrophagen wird häufig für Studien verwendet, die die Modulation der Immunantwort gegen Pilze untersuchen. Wir haben die Phagozytose von T. stromaticum conidia verwendet, um die Lebensfähigkeit der Konidien nach Phagozytose zu beurteilen, da die Evasion der Phagozytose und das Entweichen von Phagosomen Mechanismen der Pilzvirulenz sind. Forscher sollten diese Techniken als einen der ersten Assays durchführen, wenn sie eine Spezies von klinischem Interesse untersuchen.

Figure 2
Abbildung 2: Phagozytose von T. stromaticum conidia durch mononukleär abgeleitete Makrophagen aus dem peripheren Blut. Repräsentative Ergebnisse der Phagozytose-Kinetik (A) unter 40x und (B) 100x Objektiven, die PBMC-abgeleitete Makrophagen zeigen, die T. stromaticum conidia enthalten. (C) T. stromaticum-Konidien frei und an der äußeren Membran befestigt; (D) T. stromaticum conidia vollständig von Makrophagen internalisiert; (E) T. stromaticum conidia in einer oberen Ebene; (F) Multiple Phagozytose; und (G) Keimung der Konidien innerhalb (H) und außerhalb der Makrophagen. Pfeile: gelb, freie Konidien; weiß, Konidien, die an der äußeren Membran befestigt sind; schwarze, vollständig verinnerlichte Konidien; rote, konidienartige Keimung in den Makrophagen. Gestrichelte Pfeile: schwarz, multiple Phagozytose; rot, Konidien, die im R10-Medium außerhalb der Makrophagen keimen; weiß, Konidien in der oberen Ebene. Der Maßstabsbalken zeigt 20 μm an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2 zeigt die repräsentativen Ergebnisse der Phagozytose-Kinetik. Zu Beginn des Phagozytose-Prozesses können freie T. stromaticum-Konidien beobachtet werden, sowie Konidien, die an die äußere Membran von Makrophagen gebunden sind oder von ihnen vollständig internalisiert werden (Abbildung 2A-C). Mit zunehmender Phagozytosezeit können weniger Konidien frei oder an der äußeren Membran der Makrophagen befestigt beobachtet werden.

Bemerkenswert ist, dass in dieser Arbeit Konidien zu Beginn des Phagozytoseprozesses frei und an die äußere Membran gebunden waren (Abbildung 2C), vollständig von den Makrophagen internalisiert (Abbildung 2D), oder in einer höheren Ebene im Vergleich zu den Makrophagen (Abbildung 2E), aber nicht phagozytiert wurden, und mehr als ein Konidium konnte im selben Makrophagen gefunden werden (Abbildung 2F). Nach langer Zeit (96 h) konnten phagozytierte Konidien in den Makrophagen keimen (Abbildung 2G), und freie Konidien konnten im R10-Medium keimen, um bei 37 °C Hyphen zu bilden (Abbildung 2H).

Nach der Phagozytose konnte beobachtet werden, dass die Konidien von T. stromaticum auch nach 120 h Interaktion mit den humanen PBMC-abgeleiteten Makrophagen lebensfähig blieben. Die repräsentativen Ergebnisse zeigen die Kultur der geborgenen Konidien (Abbildung 3A) und stellen die Zeit (in Tagen) dar, die die Kultur benötigt, um die gesamte Kulturplatte zu besetzen (Abbildung 3B) und farbige grüne Konidien zu bilden (Abbildung 3C). Nur diskrete T. stromaticum-Konidien waren in der Lage, dem Phagosom zu entgehen und frei im Zytoplasma der mononukleären Makrophagen des menschlichen peripheren Blutes gefunden zu werden29. Die Fähigkeit von Trichoderma, die Produktion von reaktiven Sauerstoff- und Stickstoffspezies zu verringern, könnte auch zum Überleben von Konidien innerhalb des Phagosoms beitragen und die Lebensfähigkeit nach Phagozytose erklären 28,29,36. Bisher konnten wir zeigen, dass die phagozytosierten Konidien auch nach 120h noch lebensfähig sind und im PDA-Medium wachsen können. Es wurde auch berichtet, dass andere Mikroorganismen nach dem Verschlingen durch Makrophagen überleben, wie z. B. Aspergillus27,37 und Cryptococcus38.

Figure 3
Abbildung 3: Clearance-Fähigkeit von mononuklearen Makrophagen aus humanem peripherem Blut, die mit T. stromaticum conidia infiziert sind. Nach einer Herausforderung mit T. stromaticum-Konidien (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h oder 120 h) wurden die PBMC-abgeleiteten Makrophagen lysiert und die Suspension in PDA plattiert, um die Lebensfähigkeit der phagozytierten Konidien zu bewerten. (A) Repräsentative Ergebnisse des T . stromaticum-Wachstums nach Phagozytose durch PBMC-abgeleitete Makrophagen werden gezeigt. Überwachung (B) des T . stromaticum-Wachstums und (C) der Konidiation an verschiedenen Tagen für die Positivkontrolle mit T. stromaticum in PBS (siehe Schritt 5.2.5), die Kontrolle für das R10-Medium (siehe Schritt 5.1.2) und die von Makrophagen phagozytierten Konidien für verschiedene Zeiträume (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h, 120 h). Repräsentative Ergebnisse von vier gesunden Spendern. Mittelwert ± Standardabweichung (SD). Kruskal-Wallis-Test. Das Symbol # gibt die Signifikanz bei p < 0,05, n = 4 an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Discussion

Für verschiedene pilzliche Krankheitserreger, darunter Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans und andere, ist die Konidial- oder Hefephagozytose ein Schlüsselprozess, der die Untersuchung der zytoplasmatischen und molekularen Ereignisse in Makrophagen-Erreger-Interaktionen sowie die Bestimmung des Todeszeitpunkts der internalisierten Konidien ermöglicht 14,39,40. Die Phagozytose ist der Schlüsselprozess in der Trichoderma-Wirt-Interaktion. Die Gattung Trichoderma moduliert mehrere Phagozytose-Signalwege, darunter Dectin-1 und Dectin-2, Toll-like-Rezeptor 2 und Toll-like-Rezeptor 4, MHC und NF-κB 25,28,41,42,43. Trichoderma verursacht Trichodermose bei geschwächten und nicht immungeschwächten Personen9. Wichtig ist, dass mehrere Arten dieser Gattung in der Landwirtschaft verwendet werden und die potenzielle Quelle der Trichodermosis sind. Das Verständnis der Virulenzfaktoren von T. stromaticum und des Mechanismus der Immunantwort im menschlichen Körper gegen diese Pilze ist dringend erforderlich, da die Berufsrisiken durch die Trichoderma-Arten, einschließlich T. stromaticum, alarmierend ansteigen. Die hier vorgestellte Methode liefert Details für die Durchführung des Phagozytose- und Tötungsassays zur Untersuchung der Trichoderma-Makrophagen-Interaktion in humanen peripheren Blutmakrophagen; Diese Methode kann jedoch auch verwendet werden, um Makrophagen aus verschiedenen Geweben zu untersuchen, einschließlich alveolärer, peritonealer oder Abstammungsmakrophagen.

Der erste Schritt in diesem Protokoll beginnt mit einer Mutterstocksuspension (M1), um frische Kulturen des Pilzes zu erhalten. Trichoderma-Kulturen wachsen schnell, da sie in der Regel die gesamte Platte einnehmen und innerhalb von 5 Tagen grün gefärbte Konidien zeigen. Die Temperatur und das Licht sind entscheidende Faktoren für das Wachstum von Trichoderma , und Veränderungen dieser Faktoren können die Kinetik von Trichoderma beeinflussen und das Experimentbeeinträchtigen 44.

Nach dem Waschen der T. stromaticum-Kultur sollte ein Endvolumen zwischen 5-8 ml gewonnen werden. Die Farbintensität der Suspension ist proportional zur Konidienkonzentration. Die erhaltene Konidiensuspension kann für In-vitro- und In-vivo-Assays verwendet werden, wie z. B. zur Beurteilung der Phagozytose26, der extrazellulären Neutrophilen-Fallen28, der intranasalen Exposition36, 41, der intraperitonealen Exposition26, der intrakutanen Infektion45 und der intravenösen Infektion46. Frühere Forschungen mit menschlichen Makrophagen haben die durch Trichoderma29 induzierte Autophagie und die Fähigkeit der Gattung untersucht, die Bildung extrazellulärer Fallen in Neutrophilen28 zu hemmen, was ein Mechanismus ist, der zur Eliminierung von pilzlichen Krankheitserregern und anderen Mikroorganismen verwendet wird.

Es ist wichtig zu beachten, dass das Kulturmedium, das zur Aufrechterhaltung der Zellen verwendet wird, die konidiale Keimung beeinflussen kann (Abbildung 3G,H). Wenn die Keimung für ein bestimmtes Experiment nicht gewünscht ist, empfehlen wir, einen ersten Screening-Assay mit dem Zellkulturmedium durchzuführen, um die Wachstumskinetik von Trichoderma in diesem bestimmten Medium zu bestimmen. Dieser Assay sollte vor Beginn der In-vitro-Experimente mit der gewünschten Zelllinie durchgeführt werden, und das Experiment sollte nach 72 Stunden abgebrochen werden, wenn sich herausstellt, dass das Medium nicht kompatibel ist. Die Keimung von Trichoderma conidia (Abbildung 3G,H) kann ab 96h innerhalb und außerhalb der Makrophagen beobachtet werden.

Da Trichoderma-Arten Unterschiede in der Morphologie und der optimalen Temperatur und dem optimalen pH-Wert für ihr Wachstum aufweisen, sind die hier vorgestellten Ergebnisse möglicherweise nicht für alle Arten der Gattung reproduzierbar, und dieses Protokoll muss möglicherweise angepasst werden, wenn es mit anderen Arten durchgeführt wird. So keimen beispielsweise Trichoderma asperelloides conidia in Kultur schneller als T . stromaticum.

Bisherige dokumentierte Protokolle zur Bewertung der Phagozytose und der Abtötung des Erregers mittels Durchflusszytometrie und Fluoreszenzmikroskopie erfordern teure Reagenzien, liefern aber spezifische Informationen über den Phagozytoseprozess19. Das in diesem Artikel vorgestellte Protokoll erfordert nur ein optisches Mikroskop und ein Plattenwachstum, um die Phagozytose zu beurteilen, und liefert umfassende Bilder des Phagozytoseprozesses. Verschiedene Protokolle können verwendet werden, um differenzierte Makrophagen zu erhalten und die Makrophagenlyse zu induzieren. Diese Protokolle beinhalten die Verwendung unterschiedlicher Zeiten für die Makrophagendifferenzierung anstelle der hier verwendeten 7 Tage26 oder die Verwendung von 2,5% Desoxycholat47 zur Lyse der Makrophagen anstelle von destilliertem Wasser bei 37 °C und 5%CO2 für 30 min, wie hier in diesem Protokoll verwendet. Diese Methoden wurden effektiv für verschiedene Pilzarten wie A. fumigatus27, A. nidulans18 und Cryptococcus neoformans15 eingesetzt.

Einige Einschränkungen dieses Protokolls beziehen sich auf die Verwendung von PBS, das nicht endotoxinfrei ist, die Verwendung von runden Glasdeckgläsern und die Verwendung von menschlichem Blut. Wir empfehlen, das PBS (nicht endotoxinfrei) an Zellen zu testen, um sicherzustellen, dass es die Monozyten nicht aktivieren und das Experiment verzerren kann. Die Verwendung von runden Glasdeckgläsern ist sehr nützlich zum Färben und Zählen der Zellen, aber die Zellen verteilen sich möglicherweise nicht gleichmäßig unter dem Objektträger, da einige Zellen zum Rand der Platte wandern, und dieser Unterschied kann sich auf die geschätzte Gesamtzellzahl in den runden Glasdeckgläsern auswirken. Da wir in diesem Protokoll keine Immunfluoreszenz oder ähnliche Techniken verwenden, kann das Vorhandensein von nicht phagozytierten Konidien in einer oberen Ebene im Vergleich zu den Makrophagen zu einer Fehlinterpretation der Phagozytoseergebnisse führen. Da wir Blut von menschlichen Spendern verwenden, variiert die endgültige PBMC-Anzahl zwischen den Spendern, und eine niedrige Anzahl von Spenderzellen reicht möglicherweise nicht für alle Experimente aus.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Techniken verwendet werden können, um die Funktion von Makrophagen und die Pilzbeseitigung zu messen, insbesondere für filamentöse Pilze wie Trichoderma und andere Mikroben, wie Hefen und Bakterien. Darüber hinaus bietet dieses Protokoll zukünftige Richtungen für die Untersuchung der realen Variabilität in der Immunantwort gegen konidienbildende Pilze in menschlichen Populationen, die mit isogenen Tiermodellen oder Zelllinien nicht beobachtet werden kann.

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Disclosures

Alle Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte vorliegen.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von folgenden brasilianischen Finanzierungsinstitutionen unterstützt: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) mit Zuschüssen RED0011/2012 und RED008/2014. U.R.S., J.O.C. und M.E.S.M. erkennen das Stipendium der Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) bzw. der FAPESB an.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
15 mL centrifuge tubes Corning CLS431470 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile
24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate Kasvi K12-024 Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation;
Cell culture CO2 incubator Sanyo 303082 A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types.
Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL Capp 5101500 Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens
Circular coverslip 15 mm Olen K5-0015 Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm
Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets Esco Lifesciences group 2010274 Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface.
Dextrose Potato Agar medium Merck 145 Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi
EDTA vacuum blood collection tube FirstLab FL5-1109L EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology.
Entellan Merck 1.07961  Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy.
Fetal Bovine Serum Gibco A2720801 Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells.
Flaticon  database of images
Glycerol Merck 24900988 The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores
Histopaque-1077 polysucrose solution
Image J  Image analysis software
Microscopy slides Precision 7105 Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections
Mini centrifuge Prism C1801 The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time.
Neubauer chamber Kasvi K5-0011 The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles.
Panoptic fast  Laborclin 620529 Laborclin's  panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology
Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U LGC- Biotechnology  BR3011001 antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow.
Petri dish 90 x 15 mm Smooth Cralplast 18248 Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm.
Phosphate buffered saline (PBS) thermo fisher Scientific 10010001 PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells.
Pipette Pasteur 3 mL Sterile Accumax AP-3-B-S STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile
Refrigerated Centrifuge Thermo Scientific TS-HM16R The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g.
RPMI-1640 Medium Merck MFCD00217820 HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
The single channel micropipettes Eppendorf Z683809 Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids.
Tip for Micropipettor Corning 4894 Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable
Triocular inverted microscope LABOMED VU-7125500 It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems.

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References

  1. Samuels, G. J. Trichoderma: A review of biology and systematics of the genus. Mycological Research. 100 (8), 923-935 (1996).
  2. Nevalainen, H., Peterson, R. Chapter 7 - Heterologous expression of proteins in Trichoderma. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  3. Do Vale, L. H. F., Filho, E. X. F., Miller, R. N. G., Ricart, C. A. O., de Sousa, M. V. Chapter 16 - Cellulase systems in Trichoderma: An overview. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  4. Ferreira, N. L., Margeot, A., Blanquet, S., Berrin, J. G. Chapter 17 - Use of cellulases from Trichoderma reesei in the twenty-first century part I: Current industrial uses and future applications in the production of second ethanol generation. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  5. Puranen, T., Alapuranen, M., Vehmaanperä, J. Chapter 26 - Trichoderma enzymes for textile industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  6. Kunamneni, A., Plou, F. J., Alcalde, M., Ballesteros, A. Chapter 24 - Trichoderma enzymes for food industries. Biotechnology and Biology of Trichoderma. Gupta, V. K., Schmoll, M., Herrera-Estrella, A., Upadhyay, R. S., Druzhinina, I., Tuohy, M. G. , Oxford, UK. (2014).
  7. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Herrera-Estrella, A., Schmoll, M., Kenerley, C. M. Trichoderma research in the genome era. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 105-129 (2013).
  8. Mukherjee, M., et al. Trichoderma-plant-pathogen interactions: Advances in genetics of biological control. Indian Journal of Microbiology. 52 (4), 522-529 (2012).
  9. dos Santos, U. R., dos Santos, J. L. Trichoderma after crossing kingdoms: Infections in human populations. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part B. 26 (2), 97-126 (2023).
  10. Asis, A., et al. Identification patterns of Trichoderma strains using morphological characteristics, phylogenetic analyses and lignocellulolytic activities. Molecular Biology Reports. 48 (4), 3285-3301 (2021).
  11. Antal, Z., et al. Comparative study of potential virulence factors in human pathogenic and saprophytic Trichoderma longibrachiatum strains. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 52 (3-4), 341-350 (2005).
  12. Hatvani, L., Manczinger, L., Vágvölgyi, C., Kredics, L. Trichoderma as a human pathogen. Trichoderma: Biology and Applications. Mukherjee, P. K., Horwitz, B. A., Singh, U. S., Mukherjee, M., Schmoll, M. , Wallingford, UK. (2013).
  13. Kredics, L., et al. Clinical importance of the genus Trichoderma: A review. Acta Microbiologica et Immunologica Hungarica. 50 (2-3), 105-117 (2003).
  14. Erwig, L. P., Gow, N. A. R. Interactions of fungal pathogens with phagocytes. Nature Reviews Microbiology. 14 (3), 163-176 (2016).
  15. Nicola, A. M., Casadevall, A. In vitro measurement of phagocytosis and killing of Cryptococcus neoformans by macrophages. Methods in Molecular Biology. 844, 189-197 (2012).
  16. Medina, E., Goldmann, O. In vivo and ex vivo protocols for measuring the killing of extracellular pathogens by macrophages. Current Protocols in Immunology. , Chapter 14, Unit 14 1-17 (2011).
  17. Drevets, D. A., Canono, B. P., Campbell, P. A. Measurement of bacterial ingestion and killing by macrophages. Current Protocols in Immunology. 109, 1-17 (2015).
  18. Gresnigt, M. S., et al. Differential kinetics of Aspergillus nidulans and Aspergillus fumigatus phagocytosis. Journal of Innate Immunity. 10 (2), 145-160 (2018).
  19. Steinberg, B. E., Grinstein, S. Analysis of macrophage phagocytosis: Quantitative assays of phagosome formation and maturation using high-throughput fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 531, 45-56 (2009).
  20. Yan, Q., Ahn, S. H., Fowler, V. G. Macrophage phagocytosis assay of Staphylococcus aureus by flow cytometry. Bio-Protocol. 5 (4), 1406 (2015).
  21. Marr, K. A., Koudadoust, M., Black, M. Early events in macrophage killing of Aspergillus fumigatus conidia New flow cytometric viability assay. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 8 (6), 1240-1247 (2001).
  22. Surewaard, B. G. J., Kubes, P. Measurement of bacterial capture and phagosome maturation of Kupffer cells by intravital microscopy. Methods. 128, 12-19 (2017).
  23. Siggins, M. K., et al. Differential timing of antibody-mediated phagocytosis and cell-free killing of invasive African Salmonella allows immune evasion. European Journal of Immunology. 44 (4), 1093-1098 (2014).
  24. Cannon, G. J., Swanson, J. A. The macrophage capacity for phagocytosis. Journal of Cell Science. 101 (4), 907-913 (1992).
  25. Harvath, L., Terle, D. A. Assay for phagocytosis. Methods in Molecular Biology. 115, 281-290 (1999).
  26. dos Santos, A. G., et al. Trichoderma asperelloides spores downregulate dectin1/2 and TLR2 receptors of mice macrophages and decrease Candida parapsilosis phagocytosis independent of the M1/M2 polarization. Frontiers in Microbiology. 8, 1681 (2017).
  27. Souza, J. A. M., et al. Characterization of Aspergillus fumigatus extracellular vesicles and their effects on macrophages and neutrophils functions. Frontiers in Microbiology. 10, 2008 (2019).
  28. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Inhibition of extracellular traps by spores of Trichoderma stromaticum on neutrophils obtained from human peripheral blood. Molecular Immunology. 141, 43-52 (2022).
  29. Oliveira-Mendonça, L. S., et al. Trichoderma stromaticum spores induce autophagy and downregulate inflammatory mediators in human peripheral blood-derived macrophages. Current Research in Microbial Sciences. 3, 100145 (2022).
  30. Johnston, L., Harding, S. A., La Flamme, A. C. Comparing methods for ex vivo characterization of human monocyte phenotypes and in vitro responses. Immunobiology. 220 (12), 1305-1310 (2015).
  31. Abedon, S. T., Bartom, E. Multiplicity of infection. Brenner's Encyclopedia of Genetics. Second Edition. Maloy, S., Hughes, K. , Academic Press. Cambridge, MA. (2013).
  32. Rios, F. J., Touyz, R. M., Montezano, A. C. Isolation and differentiation of human macrophages. Methods in Molecular Biology. 1527, 311-320 (2017).
  33. Lombard, Y., Giaimis, J., Makaya-Kumba, M., Fonteneau, P., Poindron, P. A new method for studying the binding and ingestion of zymosan particles by macrophages. Journal of Immunological Methods. 174 (1-2), 155-165 (1994).
  34. Ghoneum, M., Gollapudi, S. Phagocytosis of Candida albicans by metastatic and non metastatic human breast cancer cell lines in vitro. Cancer Detection and Prevention. 28 (1), 17-26 (2004).
  35. Nunes, J. P. S., Dias, A. A. M. ImageJ macros for the user-friendly analysis of soft-agar and wound-healing assays. BioTechniques. 62 (4), 175-179 (2017).
  36. Alves-Filho, E. R., et al. The biocontrol fungus Trichoderma stromaticum downregulates respiratory burst and nitric oxide in phagocytes and IFN-gamma and IL-10. Journal of Toxicology and Environmental Health - Part A: Current Issues. 74 (14), 943-958 (2011).
  37. Slesiona, S., et al. Persistence versus escape: Aspergillus terreus and Aspergillus fumigatus employ different strategies during interactions with macrophages. PLoS One. 7 (2), 31223 (2012).
  38. Johnston, S. A., May, R. C. Cryptococcus interactions with macrophages: Evasion and manipulation of the phagosome by a fungal pathogen. Cellular Microbiology. 15 (3), 403-411 (2013).
  39. Alonso, M. F., et al. The nature of the fungal cargo induces significantly different temporal programmes of macrophage phagocytosis. The Cell Surface. 8, 100082 (2022).
  40. Brakhage, A. A., Bruns, S., Thywissen, A., Zipfel, P. F., Behnsen, J. Interaction of phagocytes with filamentous fungi. Current Opinion in Microbiology. 13 (4), 409-415 (2010).
  41. Dos Santos, U. R., et al. Exposition to biological control agent Trichoderma stromaticum increases the development of cancer in mice injected with murine melanoma. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 252 (2020).
  42. Wang, G., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii induces macrophage activation. Carbohydrate Polymers. 149, 112-120 (2016).
  43. Xu, Y., et al. Exopolysaccharide from Trichoderma pseudokoningii promotes maturation of murine dendritic cells. International Journal of Biological Macromolecules. 92, 1155-1161 (2016).
  44. Schmoll, M., Esquivel-Naranjo, E. U., Herrera-Estrella, A. Trichoderma in the light of day - Physiology and development. Fungal Genetics and Biology. 47 (11), 909-916 (2010).
  45. Zhang, G., Li, D. Trichoderma longibrachiatum-associated skin inflammation and atypical hyperplasia in mouse. Frontiers in Medicine. 9, 865722 (2022).
  46. Paredes, K., Capilla, J., Mayayo, E., Guarro, J. Virulence and experimental treatment of Trichoderma longibrachiatum, a fungus refractory to treatment. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (8), 5029-5032 (2016).
  47. Perkhofer, S., Speth, C., Dierich, M. P., Lass-Flörl, C. In vitro determination of phagocytosis and intracellular killing of Aspergillus species by mononuclear phagocytes. Mycopathologia. 163 (6), 303-307 (2007).

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Viability Assay Trichoderma stromaticum Konidien Mononukleäre Makrophagen aus dem menschlichen peripheren Blut Phagozytose Makrophagen-Pathogen-Interaktionen Immunantworten gegen Pilze Phagosomen-Flucht Pilzvirulenz Biokontrollmittel Biodüngermittel Humaninfektionen Trichodermakultur Waschkonidien Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) Makrophagendifferenzierung In-vitro-Phagozytose-Methode Clearance-Assay Pilz-Clearance-Effizienz
Viabilitätstest von <em>Trichoderma stromaticum-Konidien</em> in mononuklear gewonnenen Makrophagen des menschlichen peripheren Blutes
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