Summary
대식세포에 의한 진균 분생포자의 식세포작용과 관련된 기술은 진균에 대한 면역 반응의 조절을 평가하는 연구에 널리 사용됩니다. 본 논문의 목적은 Trichoderma stromaticum conidia로 자극된 인간 말초혈액 단핵 유래 대식세포의 식균작용 및 제거 능력을 평가하는 방법을 제시하는 것이다.
Abstract
대식세포는 중요한 방어선을 나타내며 다른 조직에서 병원체의 성장과 집락화를 방지하는 역할을 합니다. 분쇄자 식균작용은 대식세포-병원체 상호 작용과 관련된 세포질 및 분자 사건을 조사하고 내재화된 분생포자의 사망 시간을 결정할 수 있는 핵심 과정입니다. 대식세포에 의한 진균 분생포자의 식세포작용과 관련된 기술은 진균에 대한 면역 반응의 조절을 평가하는 연구에 널리 사용됩니다. 식세포작용(phagocytosis)의 회피와 식세포(phagosome)의 탈출은 곰팡이 독성의 기전입니다. 여기에서는 생물 방제 및 생물 비료로 사용되며 인간 감염을 유도할 수 있는 곰팡이인 T. stromaticum conidia의 식균작용, 제거 및 생존력 분석에 사용할 수 있는 방법을 보고합니다. 프로토콜은 1) Trichoderma 배양, 2) 분생포자를 얻기 위한 세척, 3) 다자당 용액법을 사용한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 분리 및 PBMC를 대식세포로 분화, 4) 둥근 유리 커버슬립 및 착색을 사용한 시험관 내 식세포작용 방법, 5) 분생포자 식균작용 후 분생포자 생존력을 평가하기 위한 클리어런스 분석으로 구성됩니다. 요약하면, 이러한 기술은 대식세포의 곰팡이 제거 효율을 측정하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
Trichoderma 속(목: Hypocreales, 과: Hypocreaceae)은 다른 곰팡이 종의 기생충인 유비쿼터스 부생균으로 구성되어 있으며 상업적으로 유용한 다양한 효소를 생산할 수 있습니다1. 이들 곰팡이 종은 이종 단백질2의생산, 셀룰로오스3, 에탄올, 맥주, 와인, 종이4의 생산, 섬유산업5, 식품산업6, 농업에서 생물학적 방제제7,8의 생산에 사용된다. 이러한 곰팡이 종에 대한 산업적 관심과 더불어, 인간의 감염 건수가 증가함에 따라 일부 Trichoderma 종은 기회주의적 병원체의 지위를 부여받았다9.
Trichoderma spp.는 배양에서 빠르게 성장하며, 처음에는 흰색과 솜털 같은 군체가 녹색을 띤 노란색에서 짙은 녹색으로 변한다10. 그들은 광범위한 pH 및 온도 조건에서 살도록 적응되어 있으며, 기회 주의적 종은 생리적 pH 및 온도에서 생존 할 수 있으므로 다른 인간 조직을 식민지화할 수 있습니다 11,12,13. 중요한 것은 Trichoderma spp.의 감염률 증가가 독성 요인과 관련이 있을 수 있지만 이러한 요인은 잘 연구되지 않았다는 것입니다. 또한 기회주의적 Trichoderma 종에 대한 면역 반응을 이해하는 데 초점을 맞춘 연구는 여전히 드뭅니다.
감염 중에 호중구와 함께 대식세포는 식세포작용을 담당하는 방어선을 나타내므로 다른 조직에서 병원체의 성장과 집락화를 방지합니다. 톨 유사 수용체(Toll-like receptor) 및 C형 렉틴 수용체(lectin receptor)와 같은 패턴 인식 수용체를 이용하여, 대식세포는 식세포당 균류를 식세포(phagolysosome)로 처리하여 호흡 파열, 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 방출 및 식세포화된 미생물의 파괴를 촉진한다14. 그러나 식세포작용의 메커니즘은 곰팡이 세포의 크기와 모양과 같은 다양한 미생물 전략에 의해 영향을 받고 회피될 수 있습니다. 식균작용을 방해하는 캡슐의 존재; 식세포작용 유도 수용체의 수를 감소시키는 단계; 세포질에서 액틴 섬유의 구조 리모델링; pseudopodia의 형성을 방해하는 것; 그리고 phagocytosis 과정 후에 phagosome 또는 phagolysosome이 탈출한다14.
크립토코커스 네오포만스(Cryptococcus neoformans)를 포함한 많은 병원체는 대식세포를 틈새시장으로 사용하여 숙주에서 생존하고, 전파하고, 감염을 유도한다15. 식균작용 및 제거 분석은 병원체에 대한 면역 반응을 평가하고 선천성 면역 체계를 회피하는 데 사용되는 미생물 전략을 식별하는 데 사용됩니다 15,16,17. 이러한 유형의 기술은 또한 식균 사멸을 감소시키는 식세포작용, 지연된 식세포 산성화 및 산화 폭발의 차등 역학을 조사하는 데 사용할 수 있습니다18.
식세포작용, 곰팡이 생존 및 식세포 성숙 과정의 회피를 평가하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있습니다. 여기에는 식세포작용(phagocytosis), 세포 위치 및 식세포작용(phagocytosis) 동안 생성된 분자를 관찰하는 데 사용되는 형광 현미경이 포함됩니다19; 식세포작용(phagocytosis)에 대한 정량적 데이터를 제공하고 공정에 관련된 상이한 마커를 평가하는데 사용되는 유세포 분석법(flow cytometry); 미생물 포획 및 식좀 성숙을 평가하는데 사용되는 생체 내 현미경검사법 22; 병원체에 대한 식세포작용 과정의 특이성을 평가하는데 사용되는 항체-매개 식세포작용(antibody-mediated phagocytosis)23; 및 기타 24,25,26,27.
여기에 제시된 프로토콜은 곰팡이 분생포자의 식세포작용 및 사멸을 평가하기 위해 광학 현미경과 플레이트 성장 분석을 사용하는 일반적이고 저렴하며 직접적인 방법을 사용합니다. 이 프로토콜은 T. stromaticum에 노출된 인간 말초 혈액 단핵 유래 대식세포를 사용하여 식균작용 및 제거 분석을 수행하기 위한 단계별 지침을 독자에게 제공합니다. PBMC는 Trichoderma conidia가 전 세계적으로 식물 병원균에 대한 생물 방제 및 식물 작물의 생물 비료로 적용되고 Trichodermosis라고 하는 여러 인간 감염을 일으켰기 때문에 사용되었습니다. 그 외에도 Trichoderma conidia와 인간 면역 체계 사이의 상호 작용에 초점을 맞춘 이전 연구는 대식세포29에서 호중구(neutrophils)28와 자가포식(autophagy)을 조사한 두 가지 이전 연구뿐이다. 이 논문은 먼저 PBMC 유래 대식세포에 의한 T. stromaticum의 분생포자의 식세포작용을 연구할 수 있는 방법을 보여준 다음 간단한 현미경 기반 기술을 사용하여 삼킨 분생포자의 생존력을 평가할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 대식세포 관련 면역 반응 또는 면역 체계 조절 관련 메커니즘에 대한 연구를 더욱 용이하게 할 수 있습니다.
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Protocol
윤리적 고려 사항 및 인간 주제
이 연구에서 기술된 인간을 대상으로 한 모든 실험은 헬싱키 선언 및 브라질 연방법에 따라 수행되었으며 산타크루즈 주립대학교 윤리위원회(프로젝트 식별 코드: 550.382/2014)의 승인을 받았습니다.
인간 말초 혈액은 연구된 곰팡이와 관련된 직업 활동에 노출되지 않은 브라질 바이아(Bahia)의 일레우스(Ilhéus) 시의 건강한 지원자로부터 수집되었습니다. 보고된 건강 상태가 있거나 약물을 사용하는 개인은 제외되었습니다. 모든 피험자는 이 연구에 포함되기 전에 자발적으로 참여에 동의하고 정보에 입각한 동의서에 서명했습니다.
1. 시약 및 용액의 준비
알림: 계속하기 전에 다음 시약과 용액을 준비하십시오. 시약 및 재료 공급업체 정보는 재료 표 (TOM)를 참조하십시오.
- 균형 잡힌 멸균 인산염 완충 식염수 1x(PBS)를 준비합니다.
참고: 이 프로토콜에서는 내독소가 없는 PBS가 사용되지 않았습니다. - 감자 포도당 한천(PDA) 배지를 준비하고 T. stromaticum 배양을 위해 각 페트리 접시에 20mL를 붓습니다. 각 기증자에 대해 PDA가 있는 6개의 플레이트를 준비하고 각 조건에 대해 하나의 플레이트를 사용합니다(3시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 120시간). 또한 각 대조군에 3개의 플레이트를 사용합니다: Trichoderma 대조군에 3개, R10 배지 대조군에 3개. 최적의 분생포자 회수를 위해 60mm x 15mm 또는 100mm x 15mm의 페트리 접시를 사용하십시오.
- 100% 글리세롤을 살균하십시오.
- 세포 배양을 위한 R10 배지 준비: 10% 소 태아 혈청 및 1% 항생제(페니실린/스트렙토마이신)가 보충된 RPMI 배지.
- 세포 용해를 위해 증류수를 멸균합니다.
- 착색 과정을 위해 pH 7.0의 물을 준비합니다.
참고: 필요한 경우 pH 측정기와 0.1M/L NaOH 및 0.1M/L HCl 용액을 사용하여 pH를 조정합니다. - 원형 유리 커버슬립(13mm)과 핀셋을 소독합니다.
2. Trichoderma stromaticum 배양 및 가공
- T. stromaticum의 모체 (M1)의 제조 :
참고: 모든 실험이 동일한 신선 세대(F1)의 배양에서 수행되도록 하려면 모체(M1)가 필요합니다.- 분생포자가 관찰되고 배양액이 녹색으로 변할 때까지 어두운 곳에서 28°C의 28°C에서 페트리 접시에 T. stromaticum 접종물을 7-10일 동안 성장시킵니다.
- T. stromaticum의 배양액을 씻으십시오. 피펫을 사용하여 배양 표면에 3-5mL의 PBS를 추가합니다. 플레이트에서 PBS를 수집하고 다시 배양 위에 분배하여 피펫을 사용하여 분생포자를 점차적으로 제거합니다. 서스펜션이 짙은 녹색으로 바뀔 때까지 필요한 만큼 이 과정을 반복합니다.
참고: 또는 플레이트에 3-5mL의 PBS를 첨가한 다음 현탁액이 녹색으로 변할 때까지 원을 그리며 움직여 분생포자를 회수하는 것이 좋습니다. 반복적인 피펫팅으로 더 많은 분생포자를 수집할 수 있습니다. - 회수된 현탁액을 플레이트에서 피펫을 사용하여 15mL 멸균 튜브로 옮깁니다. 2.1.2-2.1.3 단계를 필요한 만큼 반복하여 더 많은 분생포자를 얻습니다.
- 현탁액을 12°C에서 5분 동안 1,160 x g 으로 원심분리하고 펠릿을 5mL의 PBS에 재현탁시킵니다. 이 단계(2.1.4)를 세 번 반복하여 균사가 없는 현탁액을 얻습니다.
알림: 펠릿을 적절하게 재현탁하려면 원심분리 후 짧은 와류를 사용하는 것이 좋습니다. - 최종 펠릿을 2-3mL의 PBS에 재현탁시키고 1:100 또는 1:1,000의 희석을 사용하여 Neubauer 챔버에서 분생포자를 계산합니다.
참고: 최적의 조건에서 배양액에서 2 x 108 분생포자/mL의 최종 농도를 회수할 수 있습니다. 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 분생포자 생존 가능성을 평가하는 것은 선택 사항입니다. - 각 튜브에 0.5mL의 분생포자 현탁액(2.1.5단계에서)을 추가하여 현탁액을 1.5mL 멸균 튜브에 분취합니다. 그런 다음 0.5mL의 멸균 100% 글리세롤을 첨가하여 M1 스톡을 얻습니다. 간단히 와류를 확인하고 -20 °C 또는 -80 °C에서 보관하십시오.
- T. stromaticum의 배양 및 실험을 위한 분생포자 수득
- 플레이트 10 μL의 M1 현탁액(2.1 단계에서 제조)을 28°C의 어두운 곳에서 7-10일 동안 PDA에서 분생포자가 관찰되고 배양액이 녹색으로 변하여 신선한 F1 세대를 얻습니다.
참고: 실험을 위한 신선한 T. stromaticum 배양을 보장하려면 곰팡이 성장에 필요한 시간과 대식세포 분화에 필요한 시간을 평가하십시오. - 2.1.2-2.1.4 단계를 반복하여 분생포자를 수집합니다.
- 최종 펠릿을 PBS 2-3mL에 재현탁시킵니다. 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 분생포자 생존력을 평가하거나 2.1.5단계에서 언급한 대로 분생포자의 생존력을 계산합니다.
- 플레이트 10 μL의 M1 현탁액(2.1 단계에서 제조)을 28°C의 어두운 곳에서 7-10일 동안 PDA에서 분생포자가 관찰되고 배양액이 녹색으로 변하여 신선한 F1 세대를 얻습니다.
3. 말초혈액 단핵세포(PBMC) 분리
참고: PBMC는 밀도 1.077g/mL30의 폴리자당 용액을 사용하는 밀도 장벽 방법으로 얻습니다.
- 수집할 모든 기증자 샘플에 대해 15mL의 폴리자당 용액을 하나의 50mL 튜브에 분취합니다.
- 3-4개의 EDTA 튜브를 사용하여 각 기증자로부터 20mL의 혈액을 수집합니다. 실험당 최소 4명의 기증자를 모집합니다. 헌혈자의 혈액을 모으지 마십시오. 대신 각 샘플을 생물학적 복제물로 별도로 사용하십시오. 각 기증자에 대해 혈액을 하나의 50mL 튜브로 옮기고 PBS를 추가하여 최종 부피 35mL를 얻습니다.
- 혈액 현탁액(단계 3.2)을 폴리수크로스 용액(단계 3.1)이 들어 있는 튜브의 벽을 따라 천천히 옮겨 바이페이직 현탁액을 형성합니다.
알림: 혈액이 폴리자당 용액과 혼합되는 것을 방지하려면 혈액을 천천히 첨가하십시오. PBMC 분리를 위해 각 기증자로부터 최소 7mL의 혈액을 사용하는 것이 좋습니다. - 즉시 바이페이직 현탁액이 들어 있는 튜브를 1,600 x g 에서 24°C에서 30분 동안 원심분리합니다. PBMC의 원심분리 프로그래밍: 원심분리가 갑자기 중단되지 않도록 가속 1 및 감속 0을 사용합니다.
- 원심분리 후 PBMC를 포함하는 흰색 고리의 형성을 관찰합니다. 적혈구와 과립구는 하부에 있고, 다음 층에는 폴리자당 용액이 포함되어 있으며, PBMC는 폴리자당 용액과 혈장(상층) 사이의 흰색 고리에 있습니다. 적혈구, 혈장 또는 다당당 용액이 걸리지 않도록 피펫 또는 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 부드럽게 흡인하여 흰색 링을 수집하고 하나의 15mL 튜브로 옮깁니다.
- PBMC가 들어 있는 15mL 튜브에 PBS를 추가하여 최종 부피 10mL를 얻습니다. 현탁액을 균질화하고 24°C에서 30분 동안 1,600 x g 에서 튜브를 원심분리합니다.
- 10mL의 PBS를 사용하여 24°C에서 5분 동안 1,600 x g 에서 세포를 3회 세척합니다. 그런 다음 최종 펠릿을 2mL의 R10 배지에 재현탁시킵니다.
- 트리판 블루 배제 방법을 사용하여 세포 생존율을 평가하고 Neubauer 챔버에서 세포를 계수합니다.
4. 식세포작용 역학
참고: 인간 말초 혈액 단핵 유래 대식세포는 1:10의 다중 감염(MOI)에서 T. stromaticum conidia로 치료하거나 대조군으로 R10 배지만 처리합니다. 감염 다중성(MOI)은 감염 표적에 추가된 감염원의 비율을 나타내며 절대 숫자로 표시됩니다(MOI = agents:targets31). 여기서는 10개의 대식세포(표적)에 대해 1개의 T. stromaticum conidia(agent)를 사용합니다. 그런 다음 세포를 37°C 및 5%CO2 에서 서로 다른 기간(3시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 120시간) 동안 항온처리합니다. 다음으로, 원형 유리 커버슬립을 사용하여 현미경으로 식세포작용 과정에 관여하는 부착성 대식세포를 시각화합니다. 실험 설계 그림이 제공됩니다(그림 1).
알림: 24웰 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다.
- T. stromaticum conidia를 이용한 인간 유래 대식세포 치료
- 멸균 핀셋을 사용하여 멸균 원형 유리 커버슬립(13mm)을 각 웰에 추가합니다.
- 3.7-3.8단계에서 얻은 세포 현탁액의 부피를 웰당 8 x 105 세포를 R10 배지로 최종 부피 1mL로 도금합니다. 도립 현미경을 사용하여 세포 형태를 평가합니다.
알림: 세포는 배지에 매달려 있어야 하며 둥근 형태를 가져야 합니다. - 세포를 37°C에서 5%CO2 분위기 하에서 7일 동안 배양하고, 단핵구를 대식세포(32)로 분화시키기 위해 2일마다 배지를 신선한 R10 배지로 교체한다. 도립 현미경을 사용하여 세포 형태를 관찰합니다. 대식세포는 평평하고 확장된 모양을 가진 방추형 형태를 나타냅니다. 증가된 세포질 비율과 pseudopodia의 존재도 관찰될 수 있습니다. 부착성 단핵 유래 대식세포를 찾으십시오.
참고: 매우 적은 비율의 미분화 단핵구가 배지에 부유 상태로 남아 있을 수 있습니다. - 피펫을 사용하여 각 웰의 배지를 제거하고 PBS 1mL로 세포를 세척하여 파편과 비부착 세포를 제거합니다.
- 단계 2.2에서 준비한 현탁액을 사용하여 R10 배지에서 8 x 104 분생포자/mL의 최종 농도에서 T. stromaticum conidia의 새로운 현탁액을 제조합니다.
- 단계 4.1.5에서 제조한 분생포자 현탁액 1mL를 각 처리 웰(3h, 24h, 48h, 72h, 96h, 및 120h)에 첨가하여 1:10의 MOI를 얻었다. 대조군에 웰에 R10 배지 1mL만 추가합니다.
- 5% CO2 분위기 하에서 37°C에서 T. stromaticum conidia로 3시간 동안 대식세포에 도전합니다. 3시간 후 배지를 제거하고 세포를 세척하여 비식세포 분생포자를 제거합니다.
- 각 웰에 1mL의 R10 배지를 추가하고 5%CO2 분위기 하에서 37°C에서 서로 다른 시간(3시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 및 120시간) 동안 플레이트를 배양합니다.
- 착색 및 분석
- 해당 배양(단계 4.1.8)이 완료된 후 각 웰에서 배지를 제거하고 해당 웰에 PBS 1mL를 추가합니다.
- 멸균 핀셋과 염색 키트로 착색용 바늘을 사용하여 웰에서 둥근 유리 커버슬립을 제거합니다.
참고: 또는 May Grünwald-Giemsa 염색33을 사용하여 염색할 수 있습니다. - 각 원형 유리 커버슬립에 염색 키트의 구성 요소인 얼룩 고정기(5초), 염료 1(5초), 염료 2(2초) 및 완충수 pH 7.0(5초)을 추가합니다. 마를 때까지 기다렸다가 마운팅 에이전트를 사용하여 유리 슬라이드에 커버슬립을 고정합니다.
- 결과 정량화: 각 시간 조건에 대해 총 100개의 대식세포(Mø)를 계산합니다. 광학 현미경을 사용하여 100x 대물렌즈와 이멀젼 오일을 사용하여 식세포화된 분생포자가 있는 대식세포의 수를 계산합니다(방정식 [1]).
(1) - 대식세포당 식세포화된 분생포자의 수 구하기: 100개의 대식세포에 존재하는 분생포자를 대식세포의 수로 나눈 값을 적어도 하나의 식세포화된 분쇄포자(식세포화된 분생포자)와 상관시킵니다(방정식 [2])34.
(2)
알림: 분생포자를 평가하고 계산하기 위해 ImageJ 소프트웨어를 사용할 수 있습니다35. - 각 샘플의 식균작용과 40x 및 100x 대물렌즈를 사용한 시간 조건을 촬영하여 결과를 제시합니다.
(1)
(2)
그림 1: 인간 말초 혈액 단핵 유래 대식세포를 사용한 식균작용 및 분생포자 생존도 분석의 개략도. (1-10) 식세포작용 분석: T. stromaticum은 PDA에서 성장해야 하며 분생포자는 PBS로 플레이트를 세척하여 회수됩니다. PBMC는 설명된 프로토콜을 사용하여 밀도 장벽 방법으로 분리하고, 대식세포로 분화하기 위해 멸균 원형 유리 커버슬립이 있는 24웰 플레이트에서 7일 동안 배양한 다음 다른 시간 간격으로 1:10의 MOI로 처리해야 합니다. 원형 유리 커버슬립을 제거하고 염색 키트로 염색한 후 광학 현미경을 사용하여 결과를 분석합니다. (1-8,11-13) 분생포자 생존도 분석: 분리 후 PBMC를 원형 유리 커버슬립이 없는 24웰 플레이트에서 7일 동안 배양하여 대식세포로 분화한 다음 다른 시간 간격에 대해 1:10의 MOI로 처리합니다. 세포는 증류수로 배양하여 용해되어야 합니다. 그런 다음 현탁액을 원심 분리한 다음 재현탁 펠릿을 PDA에 도금하여 Trichoderma의 성장 역학을 분석합니다. 이 그림은 이미지 데이터베이스를 사용하여 설계되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
5. 식균작용 후 원추형 생존력 분석
참고: 실험 설계 그림이 제공됩니다(그림 1).
알림: 24웰 플레이트를 사용하십시오.
- T. stromaticum conidia로 인간 유래 대식세포에 도전하십시오.
- 4.1.2-4.1.8 단계를 반복하여 단핵구를 분화하고 대식세포를 T. stromaticum conidia로 처리합니다.
알림: 우물에 둥근 유리 커버슬립을 사용하지 마십시오. 식세포작용이 분생포 생존력과 상관될 수 있도록 식세포작용 역학 분석에 사용되는 것과 동일한 시간 간격을 사용합니다. - 4.1.5단계(R10 배지 + 분생포자)에서 준비한 현탁액이 있는 웰을 대조군으로 사용하여 R10 배지가 T. 스트로마티움 성장에 미치는 영향을 평가합니다.
- 4.1.2-4.1.8 단계를 반복하여 단핵구를 분화하고 대식세포를 T. stromaticum conidia로 처리합니다.
- Conidial 생존력 분석
- 각 배양 기간(3시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간) 후에 배지를 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척하여 식균되지 않은 분생포자를 제거합니다.
알림: R10 매체 + 분생포자가 포함된 대조군은 세척해서는 안 됩니다. - 각 웰에 0.5mL의 멸균 증류수를 추가하고 플레이트를 37°C 및 5%CO2 에서 30분 동안 배양합니다. 이 시간이 지나면 도립 현미경으로 세포 형태를 관찰하여 세포가 용해되었는지 확인합니다.
- 현탁액을 채취하여 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 실온에서 6,000 x g 의 미니 원심분리기를 사용하여 현탁액을 5분 동안 원심분리합니다.
- 상층액을 조심스럽게 폐기하고 펠릿을 10μL의 멸균 증류수에 재현탁시킨 다음 10μL의 현탁액을 어둠 속에서 28°C의 PDA 함유 플레이트에 접종합니다.
- T. stromaticum 성장에 대한 양성 대조군 준비: T. stromaticum conidia의 현탁액(2.2단계)을 사용하여 최종 농도가 8 x 106 conidia/mL인 새로운 현탁액을 준비합니다. 이 현탁액의 플레이트 10 μL는 어둠 속에서 28 ° C의 PDA에 있습니다.
참고: 이 현탁액의 10μL에는 혈액 단핵 유래 대식세포를 감염시키는 데 사용된 것과 동일한 수의 분생포자(8 x 104)가 포함됩니다. 이 양성 대조군과 5.1.2단계에서 언급한 대조군의 차이점은 5.1.2단계에서 위에서 언급한 대조군이 식세포작용 시간 동안 트리코더마 성장에 대한 R10 배지의 가능한 영향을 평가하는 데 사용된다는 것입니다. PBS에서 수집된 T. stromaticum conidia의 현탁액을 사용한 단계 5.2.5의 이 양성 대조군은 곰팡이가 자연적으로 성장하는 방식을 반영하기 위해 R10 배지의 영향 없이 Trichoderma 성장에 대한 대조군을 나타냅니다. 이 대조군을 사용하면 R10 배지가 Trichoderma 성장에 영향을 미치는지 평가할 수 있습니다. - 매일 PDA에서 T. stromaticum 의 성장 역학을 관찰하고 배양 사진을 찍습니다.
- 분석: 결과를 평가하기 위해 두 가지 포인트를 사용할 수 있습니다: 1) 배양물이 전체 배양판을 차지하는 데 필요한 시간(일)과 2) 배양에서 T. stromaticum conidia의 특징적인 녹색 색소 침착이 나타날 때까지의 시간(일).
- 각 배양 기간(3시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간) 후에 배지를 제거하고 PBS로 세포를 두 번 세척하여 식균되지 않은 분생포자를 제거합니다.
6. 통계 분석
- Kruskal-Wallis 검정을 사용하여 8개 그룹/처리 간의 통계적으로 유의한 차이를 확인할 수 있습니다. p < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다. 모든 데이터는 표준 편차(SD)± 평균으로 표시됩니다. 그림에서 #은 p < 0.05에서 통계적 유의성을 나타냅니다.
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Representative Results
대식세포에 의한 진균 분생포자의 식세포작용과 관련된 기술은 진균에 대한 면역 반응의 조절을 평가하는 연구에 널리 사용됩니다. 식세포작용(phagocytosis)의 회피와 식세포(phagosome)의 탈출이 진균 독성의 기전이기 때문에 식세포작용(phagocytosis) 후 분생포자의 생존력을 평가하기 위해 T. stromaticum conidia의 식세포작용(phagocytosis)을 사용했다. 연구자들은 임상적 관심 종을 조사할 때 첫 번째 분석 중 하나로 이러한 기술을 수행해야 합니다.
그림 2: 인간 말초 혈액 단핵 유래 대식세포에 의한 T. stromaticum conidia의 식세포작용. T. stromaticum conidia를 함유한 PBMC 유래 대식세포를 보여주는 40x 및 (B) 100x 대물렌즈에서 식세포작용 역학 (A)의 대표적인 결과. (C) T. stromaticum conidia는 자유롭고 외막에 부착되어 있습니다. (D) 대식세포에 의해 완전히 내재화된 T. stromaticum conidia; (E) 상부 평면의 T. stromaticum conidia; (F) 다발성 식균작용; 및 (G) 대식세포의 내부 및 외부의 분생포자 발아. 화살표: 노란색, 자유 분생포자; 외막에 부착 된 흰색, 분생포자; 검은색, 완전히 내면화된 분생포자; 대식세포 내부의 빨간색, 분생포자 발아. 점선 화살표: 검은색, 다발성 식균작용; 적색, 대식세포 외부의 R10 배지에서 발아하는 분생포자; 흰색, 상부 평면의 분생포자. 눈금 막대는 20μm를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2는 식세포작용 역학의 대표적인 결과를 보여줍니다. 식세포작용 과정 초기에는 유리 T. stromaticum conidia뿐만 아니라 대식세포의 외막에 부착되거나 완전히 내재화된 분생포자도 관찰할 수 있습니다(그림 2A-C). 더 적은 수의 분생포자가 자유롭게 관찰되거나 대식세포의 외막에 부착되어 식세포작용 시간이 증가할 수 있습니다.
특히, 이 연구에서 분생포자는 식세포작용 과정 초기에 자유롭게 외막에 부착되어 발견될 수 있었고(그림 2C), 대식세포에 의해 완전히 내재화되었거나(그림 2D), 대식세포에 비해 상면(그림 2E)에서 발견되었지만 식세포화되지 않았으며, 동일한 대식세포에서 하나 이상의 분생포자가 발견될 수 있었습니다(그림 2F). 오랜 시간(96시간) 후 식세포화된 분생포자는 대식세포 내부에서 발아할 수 있고(그림 2G), 유리 분생포자는 R10 배지에서 발아하여 37°C에서 균사를 형성할 수 있습니다(그림 2H).
식세포작용 후, T. stromaticum conidia가 인간 PBMC 유래 대식세포와 120시간 동안 상호작용한 후에도 생존 가능한 상태로 유지되는 것을 관찰할 수 있었습니다. 대표적인 결과는 회수된 분생포자의 배양을 보여주며(그림 3A), 배양액이 전체 배양판을 차지하고 (그림 3B) 착색된 녹색 분생포자(그림 3C)를 형성하는 데 필요한 시간(일)을 나타냅니다. 오직 이산적인 T. stromaticum conidia만이 식세포를 회피할 수 있었고 인간 말초 혈액 단핵 유래 대식세포의 세포질에서 자유롭게 발견될 수 있었다29. 활성 산소 및 질소 종의 생산을 감소시키는 Trichoderma의 능력은 또한 식세포 내부의 분생포자의 생존에 기여할 수 있으며 식균작용 후 생존력을 설명할 수 있습니다 28,29,36. 지금까지 우리는 식세포화된 분생포자가 생존 가능한 상태로 남아 있고 120시간 후에도 PDA 배지에서 성장할 수 있음을 보여주었습니다. 다른 미생물도 Aspergillus27,37 및 Cryptococcus38과 같은 대식세포에 의해 삼켜진 후에도 생존하는 것으로 보고되었습니다.
그림 3: T. stromaticum conidia에 감염된 인간 말초 혈액 단핵 유래 대식세포의 제거 능력. T. stromaticum conidia(3시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간 또는 120시간)로 챌린지한 후 PBMC 유래 대식세포를 용해시키고 현탁액을 PDA에 도배하여 식세포화된 분생포자의 생존력을 평가했습니다. (A) PBMC 유래 대식세포에 의한 식균작용 후 T. stromaticum 성장의 대표적인 결과를 나타낸다. PBS에서 T. stromaticum을 사용한 양성 대조군에 대해 (B) T. stromaticum 성장 및 (C) conidiation을 다른 날에 모니터링(5.2.5단계 참조), R10 배지에 대한 대조군(5.1.2단계 참조) 및 다른 기간(3시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 120시간) 동안 대식세포에 의해 분생포세포를 투여했습니다. 건강한 기증자 4명의 대표 결과. 평균 ± 표준 편차(SD). Kruskal-Wallis 검정. 기호 #은 p < 0.05, n = 4에서 유의성을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
아스페르길루스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 크립토코커스(Cryptococcus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans) 등을 포함한 여러 진균 병원체의 경우, 분추형 또는 효모 식균작용은 대식세포-병원체 상호작용에서 세포질 및 분자 사건을 조사하고 내재화된 분생포자의 사망 시간을 결정할 수 있는 핵심 과정입니다 14,39,40. 식세포작용(phagocytosis)은 Trichoderma-host 상호작용의 핵심 과정입니다. Trichoderma 속은 Dectin-1 및 Dectin-2, Toll-like receptor 2 및 Toll-like receptor 4, MHC 및 NF-κB 25,28,41,42,43을 포함한 여러 식균작용 경로를 조절합니다. Trichoderma는 면역력이 저하된 사람과 면역력이 저하되지 않은 사람에서 trichodermosis를 유발합니다9. 중요한 것은이 속의 여러 종이 농업에 사용되며 Trichodermosis의 잠재적 인 원인이라는 것입니다. T. stromaticum을 포함한 Trichoderma 종으로 인한 직업적 위험이 놀라울 정도로 증가하고 있기 때문에 T. stromaticum의 독성 인자와 이러한 곰팡이에 대한 인체의 면역 반응 메커니즘에 대한 이해가 시급합니다. 여기에 제시된 방법은 인간 말초 혈액 유래 대식세포에서 Trichoderma-macrophage 상호 작용을 연구하기 위한 식세포작용 및 사멸 분석을 수행하기 위한 세부 정보를 제공합니다. 그러나 이 방법은 폐포, 복막 또는 계통 대식세포를 포함한 다양한 조직의 대식세포를 연구하는 데에도 사용할 수 있습니다.
이 프로토콜의 첫 번째 단계는 곰팡이의 신선한 배양을 얻기 위해 모체(M1) 현탁액으로 시작됩니다. Trichoderma 배양균은 일반적으로 전체 플레이트를 차지하고 5일 이내에 녹색의 분생포자를 보이기 시작하기 때문에 빠르게 성장합니다. 온도와 빛은 Trichoderma 성장에 중요한 요소이며, 이러한 요인의 변화는 Trichoderma 의 동역학에 영향을 미치고 실험44를 손상시킬 수 있습니다.
T. 스트로마티움 배양액을 세척한 후 최종 부피를 5-8mL 사이로 회수해야 합니다. 현탁액의 색상 강도는 분생포자 농도에 비례합니다. 얻어진 분생포자 현탁액은 시험관 내 및 생체내 분석, 예컨대 식균작용(phagocytosis)26, 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps)28, 비강 내 노출(36,41), 복강 내 노출(intraperitoneal exposure)26, 피내 감염(intracutaneous infection)(45) 및 정맥 내 감염(inveous infection)46을 평가하기 위해 사용될 수 있다. 인간 대식세포로 수행된 이전 연구는 Trichoderma29에 의해 유도된 자가포식과 곰팡이 병원균 및 기타 미생물을 제거하는 데 사용되는 메커니즘인 호중구28에서 세포외 함정 형성을 억제하는 속의 능력을 평가했습니다.
세포를 유지하는 데 사용되는 배양 배지가 분생자 발아에 영향을 미칠 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다(그림 3G,H). 특정 실험에서 발아가 필요하지 않은 경우 세포 배양 배지로 초기 스크리닝 분석을 수행하여 특정 배지에서 Trichoderma의 성장 역학을 확립하는 것이 좋습니다. 이 분석은 원하는 세포 계통으로 시험관 내 실험을 시작하기 전에 수행해야 하며, 배지가 호환되지 않는 것으로 확인되면 72시간 후에 실험을 중지해야 합니다. Trichoderma conidia(그림 3G,H)의 발아는 대식세포 내부와 외부에서 96시간 동안 관찰할 수 있습니다.
Trichoderma 종은 형태와 성장을 위한 최적의 온도 및 pH에 차이가 있기 때문에 여기에 제시된 결과는 속의 모든 종에 대해 재현 가능하지 않을 수 있으며 이 프로토콜은 다른 종과 함께 수행할 때 적응이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, Trichoderma asperelloides conidia는 T. stromaticum보다 배양에서 더 빨리 발아합니다.
유세포 분석 및 형광 현미경을 사용하여 식세포작용 및 병원균 사멸을 평가하기 위한 이전에 문서화된 프로토콜은 고가의 시약을 필요로 하지만, 식세포작용 과정에 대한 특정 정보를 제공한다19. 이 기사에 제시된 프로토콜은 식균작용을 평가하기 위해 광학 현미경과 플레이트 성장만 필요하며 식세포작용 과정에 대한 포괄적인 이미지를 제공합니다. 차별화된 대식세포를 얻고 대식세포 용해를 유도하기 위해 다양한 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 이러한 프로토콜은 본 프로토콜에서 사용된 바와 같이, 37°C에서 증류수 대신 대식세포를 용해시키기 위해2.5 % 데옥시콜레이트(47)를 사용하거나(26) 대식세포 분화를 위해 상이한 시간을 사용하는 것(26) 또는 2.5% 데옥시콜레이트(47 )를 사용하여 37°C에서 증류수 및 5%CO2 를 30분 동안 용해하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 A. fumigatus27, A. nidulans18 및 Cryptococcus neoformans15와 같은 다양한 곰팡이 종에 효과적으로 사용되었습니다.
이 프로토콜의 일부 제한 사항은 내독소가 없는 PBS 사용, 원형 유리 커버슬립 사용 및 인간 혈액 사용과 관련이 있습니다. PBS(내독소가 없는 것이 아님)를 세포에서 테스트하여 단핵구를 활성화하고 실험을 편향시킬 수 없는지 확인하는 것이 좋습니다. 원형 유리 커버슬립을 사용하면 세포를 염색하고 계수하는 데 매우 유용하지만 일부 세포가 플레이트 웰의 가장자리로 이동하기 때문에 슬라이드 아래에서 세포가 고르게 퍼지지 않을 수 있으며 이러한 차이는 원형 유리 커버슬립의 예상 총 세포 수에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 면역형광 또는 이와 유사한 기술을 사용하지 않기 때문에 대식세포에 비해 상평면에 비식세포화된 분생포자(non-phagocytosed conidia)가 존재하면 식세포작용 결과를 잘못 해석할 수 있습니다. 인간 기증자의 혈액을 사용하기 때문에 최종 PBMC 수는 기증자마다 다르며 낮은 기증자 세포 수는 모든 실험에 충분하지 않을 수 있습니다.
요약하면, 이러한 기술은 특히 Trichoderma 와 같은 사상균 및 효모 및 박테리아와 같은 기타 미생물에 대해 대식세포의 기능과 곰팡이 제거율을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 이 프로토콜은 동종 동물 모델이나 세포주를 사용하여 관찰할 수 없는 인간 집단에서 분생포자 형성 곰팡이에 대한 면역 반응의 실제 변동성을 연구하기 위한 향후 방향을 제공합니다.
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Disclosures
모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 RED0011/2012 및 RED008/2014 보조금을 받은 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia(FAPESB)와 같은 브라질 금융 기관의 지원을 받았습니다. U.R.S., J.O.C. 및 M.E.S.M.은 각각 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior(CAPES) 및 FAPESB에서 수여하는 장학금을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | CLS431470 | 15 mL centrifuge tubes, polypropylene, conical bottom with lid, individually sterile |
| 24-Well Flat Bottom Cell Culture Plate | Kasvi | K12-024 | Made of polystyrene with alphanumeric identification; The Cell Culture Plate is DNase, RNase and pyrogen-free and free of cytotoxic substances; Sterilized by gamma radiation; |
| Cell culture CO2 incubator | Sanyo | 303082 | A CO2 incubator serves to create and control conditions similar to a human body, thus allowing the in vitro growth and proliferation of different cell types. |
| Centrifuge Microtube (eppendorf type) 1.5 mL | Capp | 5101500 | Made from polypropylene, with a cap attached to the tube for opening and closing with just one hand. It has a polished interior against protein adhesion and for sample visibility, being free of DNase, RNase and Pyrogens |
| Circular coverslip 15 mm | Olen | K5-0015 | Circular coverslips are used for microscopy techniques in cell culture. Made of super transparent translucent glass; with thickness of 0.13 mm |
| Class II Type B2 (Total Exhaust) Biosafety Cabinets | Esco Lifesciences group | 2010274 | Airstream Class II Type B2 Biosafety Cabinets (AB2) provide product, operator and environmental protection and are suitable for work with trace amounts of toxic chemicals and agents assigned to biological safety levels I, II or III. In a Class II Type B2 cabinet, all inflow and downflow air is exhausted after HEPA/ULPA filtration to the external environment without recirculation across the work surface. |
| Dextrose Potato Agar medium | Merck | 145 | Potato Dextrose Agar is used in the cultivation and enumeration of yeasts and fungi |
| EDTA vacuum blood collection tube | FirstLab | FL5-1109L | EDTA is the recommended anticoagulant for hematology routines as it is the best anticoagulant for preserving cell morphology. |
| Entellan | Merck | 1.07961 | Fixative agent; Entellan is a waterless mounting medium for permanent mounting for microscopy. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A2720801 | Fetal bovine serum (FBS) is a universal growth supplement of cell and tissue culture media. FBS is a natural cocktail of most of the factors required for cell attachment, growth, and proliferation, effective for most types of human and animal (including insect) cells. |
| Flaticon | database of images | ||
| Glycerol | Merck | 24900988 | The cryoprotectant agent glycerol is used for freezing cells and spores |
| Histopaque-1077 | polysucrose solution | ||
| Image J | Image analysis software | ||
| Microscopy slides | Precision | 7105 | Slide for Microscopy 26 x 76 mm Matte Lapped Thickness 1.0 to 1.2 mm. Made of special optical glass and packaged with silk paper divider with high quality transparency free of imperfections |
| Mini centrifuge | Prism | C1801 | The Prism Mini Centrifuge was designed to be extremely compact with an exceptionally small footprint. Includes 2 interchangeable quick-release rotors that spin up to 6000 rpm. An electronic brake provides quick deceleration and the self-opening lid allows easy access to the sample, reducing handling time. |
| Neubauer chamber | Kasvi | K5-0011 | The Neubauer Counting Chamber is used for counting cells or other suspended particles. |
| Panoptic fast | Laborclin | 620529 | Laborclin's panoptic fast c is a kit for quick staining in hematology |
| Penicillin/Streptomycin Solution - 10,000U | LGC- Biotechnology | BR3011001 | antibiotic is used in order to avoid possible contamination by manipulation external to the laminar flow. |
| Petri dish 90 x 15 mm Smooth | Cralplast | 18248 | Disposable Petri dish; Made of highly transparent polystyrene (PS); flat bottom; Smooth;Size: 90 x 15 mm. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | thermo fisher Scientific | 10010001 | PBS is a water-based saline solution with a simple formulation. It is isotonic and non-toxic to most cells. It includes sodium chloride and phosphate buffer and is formulated to prevent osmotic shock while maintaining the water balance of living cells. |
| Pipette Pasteur 3 mL Sterile | Accumax | AP-3-B-S | STERILE ACCUMAX PASTEUR 3 ML PIPETTE with 3 mL capacity, made of transparent low-density polyethylene (LDPE) and individually sterile |
| Refrigerated Centrifuge | Thermo Scientific | TS-HM16R | The Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R Refrigerated Centrifuge is a refrigerated centrifuge with the user-friendly control panel makes it easy to pre-set the speed, RCF value, running time, temperature, and running profile. The Megafuge 16R can reach maximum speeds of 15,200 RPM and maximum RCF of 25,830 x g. |
| RPMI-1640 Medium | Merck | MFCD00217820 | HEPES Modification, with L-glutamine and 25 mM HEPES, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture |
| The single channel micropipettes | Eppendorf | Z683809 | Single-channel micropipettes are used to accurately transfer and measure very small amounts of liquids. |
| Tip for Micropipettor | Corning | 4894 | Capacity of 10 µL and 1,000 µL Autoclavable |
| Triocular inverted microscope | LABOMED | VU-7125500 | It allows you to observe cells inside tubes and bottles, without having to open them, thus avoiding contamination problems. |
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