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Immunology and Infection

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65272
Automatic Translation
1, 1, 1, 3, 1, 1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg, 2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg, 3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

ERRATUM NOTICE

Summary

호중구 세포외 트랩(NET)은 다양한 질병과 관련이 있으며, 면역형광은 종종 시각화에 사용됩니다. 그러나 다양한 염색 프로토콜이 있으며 많은 경우 한 가지 유형의 조직만 검사합니다. 여기서는 생쥐 및 인체 조직에서 NET을 염색하는 데 일반적으로 적용 가능한 프로토콜을 설정합니다.

Abstract

호중구 세포외 트랩(NET)은 박테리아 감염이나 외상성 조직 손상에 대한 반응으로 호중구에 의해 방출되지만 자가면역 질환 및 멸균 염증에도 중요한 역할을 합니다. 그들은 이중 가닥 DNA 필라멘트, 히스톤 및 항균 단백질로 구성된 거미줄 모양의 구조입니다. 일단 방출되면 NET은 혈액과 조직에서 세포 외 병원체를 포획하여 죽일 수 있습니다. 또한 NET은 혈소판 부착 및 응고를 자극하여 항상성 조절에 참여합니다. 그러나 NET의 생산 조절 장애는 패혈증 또는 자가면역 질환을 포함한 다양한 질병과도 관련이 있어 치료 개입의 유망한 표적이 됩니다. 전자 현미경 외에도 면역 형광 이미징을 사용하여 NET을 시각화하는 것은 현재 조직에서 NET 상호 작용을 입증하는 유일한 알려진 방법 중 하나입니다. 따라서 NET을 시각화하기 위한 다양한 염색 방법이 활용되었습니다. 문헌에는 다양한 염색 프로토콜이 설명되어 있으며, 프로토콜 간에 높은 변동성을 보이는 네 가지 주요 구성 요소, 즉 (1) 사용된 항체 유형, (2) 자가형광 환원제의 사용, (3) 항원 회수 방법, (4) 투과성을 확인했습니다. 따라서 체외 면역형광 염색 프로토콜은 이 연구에서 다양한 종(마우스, 인간) 및 조직(피부, 장, 폐, 간, 심장, 척추 디스크)에 적용할 수 있도록 체계적으로 조정되고 개선되었습니다. 고정 및 파라핀 포매 후, 3μm 두께의 섹션을 슬라이드에 장착했습니다. 이 샘플은 수정된 염색 프로토콜에 따라 골수과산화효소(MPO), 시트룰린 히스톤 H3(H3cit) 및 호중구 엘라스타제(NE)에 대한 1차 항체로 염색되었습니다. 슬라이드를 2차 항체로 염색하고 광시야 형광 현미경을 사용하여 검사했습니다. 평가 시트에 따라 결과를 분석하고, 반정량적으로 차이를 기록했다.

여기에서는 다양한 조직에 적합한 최적화된 NET 염색 프로토콜을 제시합니다. H3cit 염색을 위해 새로운 1차 항체를 사용하고 자가형광 환원제로 비특이적 염색을 줄였습니다. 또한, NET 염색에는 일정한 고온과 신중한 시료 취급이 필요하다는 것을 입증했습니다.

Introduction

호중구 세포외 트랩(NETs)은 2004년 Brinkmann et al.에 의해 세포사멸 및 괴사와 다른 세포 사멸 경로로 처음 시각화되었습니다1. 이 경로에서 호중구는 탈응축된 염색질을 세포 외 공간으로 방출하여 이전에 과립이나 세포질에 저장되었던 항균 단백질로 덮인 큰 거미줄 모양의 구조를 형성합니다. 이러한 항균 단백질에는 호중구 엘라스타제(ne), 골수화효소(MPO) 및 시트룰린 히스톤 H3(H3cit)가 포함되며, 이는 NET의 간접 면역형광 검출에 일반적으로 사용됩니다2. 이 방법은 이러한 단백질의 정량적 존재를 식별할 뿐만 아니라; 실제로 NET과 유사한 구조를 구체적으로 감지할 수 있다는 장점이 있습니다. NET에서 언급된 단백질은 세포외 DNA와 함께 국소화되며, 이는 각 염색된 단백질과 세포외 DNA의 형광 신호의 중첩에 의해 검출될 수 있습니다. NET에서 세포외 DNA와 단백질의 공동 국소화로 인한 중첩 신호와 대조적으로, 온전한 호중구는 공동 국소화를 나타내지 않습니다. 여기서, NET 성분은 일반적으로 과립, 핵 및 세포질3에 별도로 저장된다.

첫 번째 발견 이후 NET은 수많은 질병, 특히 염증과 관련된 질병에서 중심적인 역할을 하는 것으로 나타났습니다. NET은 혈액과 조직에서 세포외 병원체를 포획하고 사멸시킴으로써 감염 중 항균 기능을 보여줍니다 4,5. 그러나 NET은 전신성 홍반성 루푸스, 류마티스 관절염 및 알레르기성 천식과 같은 자가면역 질환 및 과염증 반응과도 관련이 있습니다 6,7,8. NET은 죽상동맥경화증, 혈소판 부착에서 혈관 폐색과 염증을 촉진하며 전이성 암에 중요한 역할을 하는 것으로 추측된다 9,10,11. 그럼에도 불구하고, 그들은 전염증성 사이토카인 수치를 감소시킴으로써 항염증 특성을 가지고 있다고 생각된다12. NET은 광범위한 연구 분야에서 더 많은 관심을 받고 있지만, 강력한 NET 검출 방법은 향후 연구의 기본입니다.

면역형광 이미징을 사용하여 다양한 조직에서 NET을 시각화하는 것은 복잡하고 맞춤화가 필요하지만, 전자 현미경을 제외하고는 현재 NET과 세포 간의 상호 작용을 시각화하는 가장 유명한 방법 중 하나이며 주로 포르말린 고정 파라핀 포매 조직(FFPE)에 사용됩니다13,14. 그러나 여러 실험실에서 자체 맞춤형 프로토콜을 사용하기 때문에 NET 이미징을 비교하는 것은 어렵습니다. 이러한 프로토콜은 항체, 항원 회수 또는 투과화 방법의 사용이 다르며 종종 특정 유형의 조직에 최적화되어 있습니다 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.

Brinkmann et al.이 FFPE 조직에서 NET의 면역형광 시각화를 사용한 최초의 방법론적 연구를 발표한 후, 우리는 더 다양한 조직과 종에 대해 이 프로토콜을 최적화하기를 원했습니다15. 또한 광범위하게 적용 가능한 면역형광 프로토콜을 확립하기 위해 FFPE 조직에서 면역형광 방법을 사용하여 NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25를 검출하는 연구에서 다양한 수정된 프로토콜을 테스트했습니다. 26,27. 또한, 보다 특이적인 세포외 염색을 위해 새로운 H3cit 항체를 시도했다28. 우리는 현재의 염색 프로토콜을 다양한 종과 조직에 체계적으로 적용함으로써 체외 이미징을 개선하여 호중구와 NET 간의 상호 작용을 국소 및 전신적으로 더 잘 표현할 수 있다는 가설을 세웠습니다.

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Protocol

이 연구에는 독일 함부르크의 Behörde für Justiz und Verbraucherschutz에 있는 함부르크 주 동물 연구국(Hamburg State Administration for Animal Research, Behörde für Justiz und Verbraucherschutz)에서 승인한 실험에서 파생된 마우스 조직이 포함되었습니다(73/17, 100/17, 94/16, 109/2018, 63/16). 사용된 조직은 패혈증 모델의 쥐 폐와 결장과 화상을 입은 피부였습니다. 우리는 8주 된 수컷과 암컷 쥐를 사용했습니다. 과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 유럽 지침 2010/63/EU는 모든 실험에 대해 준수되었습니다. 익명화된 인간 샘플에는 신생아 장염, 화상을 입은 피부, 담도 폐쇄증, 척추 디스크염 및 심근의 조직이 포함되었습니다. 함부르크 의학 연구 윤리 위원회(Medical Research Ethics Committee of Hamburg)에 따르면, 샘플은 정보에 입각한 동의가 필요하지 않았지만, 연구는 위원회의 승인을 받았다(WF-026/21).

1. 샘플 고정

  1. Abu Abed 및 Brinkmann에서 파생된 다음 프로토콜을 샘플 고정, 탈수, 파라핀 임베딩, 절편화 및 장착에 사용합니다 3,15.
    1. 4mL의 트리스 완충 식염수(pH 800(TBS))에 파라포름알데히드(PFA) 40g을 용해시켜 7.4% 포름알데히드 용액을 준비합니다.
    2. PFA가 용해될 때까지 흄 후드 아래에서 60°C의 혼합물을 저어줍니다. 용액을 실온(RT)으로 가져오고 TBS로 부피를 1,000mL로 조정합니다.
    3. pH를 7.4로 조정합니다. 4 °C에서 2-3 주 동안 또는 -20 °C에서 최대 1 년 동안 보관하십시오.
  2. 샘플 고정을 위해 TBS 완충액에 새 조직을 넣고 20mm x 30mm x 3mm보다 작은 조각으로 절개합니다. 조직 절편을 4% 파라포름알데히드 용액에 12-24시간 동안 담그십시오.
    참고: 원래 프로토콜은 2% PFA 용액과 8-20시간의 고정 시간을 사용했습니다. 이 방법을 사용하면 일부 조직 절편이 20시간 후에 완전히 고정되지 않아 PFA 농도가 4% PFA로 증가했습니다.
  3. 샘플을 라벨이 부착된 조직 처리 카세트로 옮깁니다. 라벨링에는 내용제성 마커 또는 연필을 사용하십시오.
  4. 샘플 탈수를 시작한 다음 카세트를 70% 에탄올에 1시간 동안 담그십시오. 그런 다음 80% 에탄올, 90% 에탄올, 96% 에탄올, 100% 에탄올에 두 번 담그고 각 단계는 1시간 동안 지속됩니다.
  5. 100% 크실렌(디메틸벤젠)에 두 번 담근 다음 60°C 파라핀에 매번 1시간 동안 두 번 담그십시오.
  6. 장착용 임베딩 몰드를 사용하고 몰드를 제거하기 전에 파라핀이 응고되도록 하십시오.
  7. 마이크로톰을 사용하여 3μm 두께의 조직 절편을 절단합니다.
  8. 핀셋을 사용하여 절단된 부분을 37°C 수조에 놓고 표면에 띄워 조직 절단을 늘립니다.
  9. 단면을 접착 유리 슬라이드(재료 표)에 놓고 40°C 가열 챔버에서 밤새 건조시킵니다.

2. 시료 재수화

  1. 탈파라핀화를 위해 슬라이드를 슬라이드 랙에 쌓고 크실렌 교체 매체 리모넨(재료 표)에 각각 5분 동안 두 번 담그고 1:1 리모넨/에탄올 혼합물에 5분 동안 한 번 담그십시오.
    주의 : 리모넨은 50 °C에서 가연성이며 알레르기 반응을 일으킬 수 있습니다. 보안경과 장갑을 착용한 흄 후드 아래에서 사용하십시오. 화기에 가까이 두지 마십시오.
  2. 슬라이드 랙을 100% 에탄올에 두 번, 96% 에탄올, 90% 에탄올, 80% 에탄올 및 70% 에탄올에 각각 5분 동안 담가 샘플을 내림차순 에탄올 시리즈로 재수화합니다.
  3. 슬라이드 랙을 탈이온수(DI 물)에 5분 동안 담가 남아 있는 에탄올을 제거합니다.

3. 자가형광 차단 및 항원 회수

  1. 데이터시트에 따라 pH 6 구연산염 표적 회수 용액(TRS)(재료 표)을 준비합니다. 이 TRS는 10배 농축됩니다. 따라서 DI 물로 1:10을 희석하십시오. 플라스틱 염색 용기를 96°C로 예열합니다.
    참고: TRS는 항원 에피토프를 노출시키기 위해 샘플 고정 중에 형성된 메틸렌 브리지를 파괴합니다. 이를 통해 1차 항체가 표적 항원과 결합할 수 있습니다. 농축 TRS를 2-8 °C에서 8 개월 동안 보관하십시오. 항상 신선한 TRS를 준비하십시오.
  2. 슬라이드 랙에서 슬라이드를 꺼내 젖은 챔버에 놓습니다. 각 샘플에 자가형광 환원제(Table of Materials)를 1-2방울 떨어뜨리는 피펫팅합니다. 5분 동안 배양합니다.
    NOTE: 자가형광 환원제는 내인성 형광단 및 고정제에 의해 발생하는 고유한 조직 자가형광을 차단합니다. 자가형광 환원제를 RT에서 최대 1년 동안 보관합니다.
    알림: 샘플이 마르거나 배양 시간을 초과하지 않도록 조직의 작은 부분으로만 작업하십시오.
  3. 슬라이드를 슬라이드 랙에 다시 쌓고 사용하지 않은 자가형광 환원 시약이 모두 씻겨 나갈 때까지 위아래로 움직여 60% 에탄올로 1분 동안 헹굽니다.
  4. 슬라이드 랙을 DI 물에 5분 동안 담그십시오.
  5. 항원 회수를 위해 슬라이드를 예열된 TRS가 있는 염색 용기에 옮깁니다. 수조에서 96°C에서 10분간 배양합니다.
    알림: TRS를 96°C로 예열하고 96°C에서 10분의 배양 시간이 보장되는 경우 96°C 수조를 전자레인지나 스팀 쿠커로 대체할 수 있습니다.
  6. 염색 용기를 꺼내 약 60-90분 동안 RT로 천천히 식힙니다.
    알림: 프로토콜은 여기에서 최대 4시간 동안 일시 중지할 수 있으며 슬라이드는 TRS에 남아 있습니다.
  7. TRS를 제거하되 슬라이드는 항아리에 보관하십시오. 0.05% 트윈(TBST, pH 7.4)이 포함된 트리스 완충 식염수로 각각 3분 동안 두 번 헹구어 남은 TRS 잔여물을 씻어냅니다.
  8. 투과를 위해 pH 7.4의 인산염 완충 식염수(PBS)에 0.2% 트리톤을 준비하고 염색 용기에 채워 10분 동안 샘플을 투과시킵니다.
    참고: 투과화는 고정된 샘플에서 세포 내 표적 단백질과 1차 항체의 결합을 향상시킵니다.
  9. 매번 TBST에서 3분 동안 슬라이드를 두 번 다시 헹굽니다.
  10. 습식 챔버를 준비하고 슬라이드를 놓습니다. 종이 티슈로 슬라이드의 과도한 물기를 닦아냅니다. 항체 용액이 흘러내리지 않도록 소수성 장벽 펜으로 모든 샘플에 동그라미를 칩니다.
    알림: 샘플을 건조시키지 마십시오. 작은 섹션으로 작업하는 것이 가장 좋습니다.

4. 비특이적 항체 결합 차단

  1. 당나귀 혈청(Table of Materials)과 함께 바로 사용할 수 있는 차단 용액을 모든 샘플에 한 방울 떨어뜨리고 피펫팅합니다. RT에서 30분 동안 배양합니다.
    참고: 이 차단 단계는 샘플의 비특이적 결합 부위에 대한 2차 항체의 결합을 최소화합니다. 이러한 비특이적 항원결정기를 차단하고 1차 항체를 투여한 후 2차 항체는 1차 항체에 결합하고 조직 표면과 상호작용하지 않습니다. 바로 사용할 수 있는 이 차단 시약은 2-8°C에서 6개월 동안 보관됩니다.
  2. 슬라이드의 가장자리를 단단한 표면에 두드려 슬라이드에서 과도한 차단 용액을 제거합니다. 헹구지 마십시오.

5. 1차 항체

  1. 항체 희석 완충액에 1차 항체를 희석합니다(재료 표). 모든 샘플에 약 100μL의 최종 용액을 사용합니다. NE 및 H3cit(R8) 항체 및 isocontrol의 경우 5μg/mL 농도로 희석합니다. MPO 및 해당 isocontrol의 경우 10μg/mL를 사용합니다. 모든 1차 항체에 대해 하나의 튜브를 준비하고 모든 isocontrol 항체에 대해 하나의 튜브를 준비합니다.
    알림: H3cit(R8)/MPO 또는 NE/MPO와 그 isocontrols는 NET 염색을 위해 결합할 수 있습니다. H3cit(R8)/MPO의 조합의 경우 H3cit(R8)의 경우 5μg/mL, MPO의 경우 10μg/mL의 최종 농도로 희석하여 샘플당 100μL의 최종 부피로 희석합니다. NE/MPO의 경우 NE의 경우 5μg/mL, MPO의 경우 10μg/mL의 최종 농도로 희석하여 샘플당 최종 부피 100μL로 희석합니다. isocontrol의 경우 각 해당 항체에 대해 동일한 농도를 사용합니다. 사용하는 각 항체에 대해 항상 새 피펫 팁을 사용하십시오. 1차 항체는 4°C에서 1-2주, -20°C 또는 -80°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.
  2. 하나의 슬라이드에 두 개의 샘플이 있는 경우 하나는 isocontrol 항체에 사용하고 다른 하나는 MPO/H3cit 또는 MPO/NE 항체 희석에 사용합니다. 모든 샘플에 약 100μL를 사용하고 항체 용액을 고르게 펴 바릅니다.
    알림: 샘플이 마르지 않도록 하십시오. isocontrol 항체와 1차 항체를 혼동하지 않도록 주의하십시오.
  3. 4 °C의 습식 챔버에서 하룻밤 동안 보관하십시오.
  4. 다음 날, 슬라이드에서 여분의 1차 항체 용액을 두드려 큐벳에 쌓습니다. TBST로 매번 5분 동안 3회 헹구어 남은 1차 항체 용액을 씻어냅니다.

6. 2차 항체

  1. 2차 항체 용액을 준비합니다. 두 가지 형광 2차 항체를 사용합니다: MPO용 donkey-anti-goat 및 H3cit 염색용 donkey-anti-rabbit. 항체 희석 완충액을 사용하여 각각을 7.5μg/mL의 농도로 희석합니다(재료 표).
    참고: 이중 염색의 경우, excitation 영역이 다르고 스펙트럼 중첩이 최소화된 두 개의 형광 항체를 사용하십시오. 두 2차 항체를 결합하고 샘플당 100μL의 최종 부피에 대해 각 항체에 대해 7.5μg/mL의 최종 농도로 희석합니다. 빛으로부터 항체를 보호하십시오. 2차 항체는 2-8°C에서 6-8주 또는 -80°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.
  2. 슬라이드를 습식 챔버에 보관하고 모든 샘플에 100μL의 2차 항체 용액을 추가합니다. 빛으로부터 보호하고 상온에서 30분 동안 배양하도록 합니다.
  3. 여분의 2차 항체 용액을 떼어내고 슬라이드 랙에 슬라이드를 쌓습니다. PBS로 채워진 염색 용기에 각각 5분 동안 3회 담가 남아 있는 결합되지 않은 항체를 씻어냅니다.
  4. DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindol) 용액(재료 표)을 준비하고 DI 물로 1μg/mL 농도로 희석합니다. 슬라이드 랙을 DAPI 용액이 있는 염색 용기에 담그고 어두운 곳에서 RT에서 5분 동안 배양합니다.
    참고: DAPI는 이중 가닥 DNA의 형광 염색제로 사용됩니다. 준비된 DAPI 솔루션은 여러 번 사용할 수 있습니다. 준비된 DAPI 솔루션을 RT에 저장합니다. DAPI 농축액은 -20°C에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.
  5. 슬라이드 랙을 PBS가 있는 염색 용기에 5분 동안 담가 과도한 DAPI 용액을 씻어냅니다.

7. 샘플 장착 및 보관, 현미경 분석

  1. 커버슬립과 장착 매체가 있는 샘플을 장착합니다(재료 표).
    알림: 소량의 장착 매체만 사용하고 여분의 매체는 젖은 티슈로 닦아내십시오. 장갑을 착용하고 커버슬립이나 슬라이드에서 실수로 매체를 닦아내지 마십시오. 기포가 생기지 않도록 하고 면봉을 사용하여 커버슬립을 부드럽게 눌러 슬라이드에서 기포를 제거합니다.
  2. 이미징의 경우 광시야 현미경 또는 컨포칼 현미경을 사용하십시오.
    참고: 먼저 isocontrol의 이미지를 찍습니다. 신호가 거의 감지되지 않을 때까지 형광 필터(DAPI용 청색 필터 제외)의 노출 시간을 낮춥니다. 그런 다음 이 설정을 사용하여 해당 샘플을 검사합니다. 형광 채널을 사용하여 모든 개별 샘플에서 형광 신호를 검출할 수 있는 영역을 찾습니다. 영역 이미지를 촬영한 후 프로그램은 모든 채널의 복합 이미지를 생성하고 서로 다른 형광 신호를 서로 다른 색상의 중첩으로 표시합니다. 그런 다음 ImageJ와 같은 이미징 소프트웨어를 사용하여 공동 위치 파악을 위해 이미지를 추가로 분석할 수 있습니다.
  3. 슬라이드를 4°C에서 최대 6개월 동안 보관하십시오.

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Representative Results

프로토콜 최적화를 시작하기 전에 PubMed에서 NET의 면역 염색을 위해 FFPE 조직을 사용한 연구를 검색하고 프로토콜을 비교하여 성공적인 염색을 위한 주요 단계를 식별했습니다. 가장 유망한 프로토콜 차이는 프로토콜 최적화를 위한 핵심 단계로 확인되었으며, 대부분 서로 일치하는 단계는 변경되지 않았습니다(표 1).

표 1: NET의 FFPE 면역염색을 위한 PubMed 연구. 이 표는 조사된 연구에서 면역염색 프로토콜의 변수를 보여줍니다. 사용된 프로토콜은 필수 단계로 나눈 다음 서로 비교했습니다. 그런 다음 가장 유망한 차이점이 있는 단계를 최적화를 위한 핵심 단계로 취하고 프로토콜에 맞게 조정했습니다. 1차 항체의 배양 시간(야간, 4°C)과 같이 대부분 서로 일치하는 단계는 변경되지 않았습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

연구 결과를 바탕으로 우리는 항원결정기를 표적으로 삼기 위해 선택된 항체가 첫 번째 중요한 단계라는 결론을 내렸습니다. 적어도 10개의 서로 다른 프로토콜이 triH3cit 항체를 사용했다( 표 1; 1차 항체 컬럼). 그럼에도 불구하고, Thålin et al.은 H3cit (R8) 클론이 비 시트룰린 히스톤에 대해 더 적은 오프 타겟 교차 반응을 나타내고 무시할 수있는 로트 간 변동성을 나타냈다는 것을 발견했습니다. 따라서, 우리는 triH3cit와 H3cit(R8) 염색 결과를 서로 비교하기로 결정했다28.

4건의 연구는 인간/생쥐 MPO 항체를 사용했다. 또한, 두 개의 다른 프로토콜은 마우스 조직에 MPO(2D4)를 적용하고 인체 조직에 MPO(2C7)를 적용했습니다( 표 1; 1차 항체 컬럼). 따라서 인체 조직에 대한 인간/마우스 MPO 항체와 MPO(2C7)를 별도로 비교하고 마우스 조직에 대한 인간/마우스 MPO 항체와 MPO(2D4)를 비교했습니다. NE는 최소 5개의 서로 다른 항체를 사용하여 검출되었지만, 제공된 이미지에서 3개만이 양호한 염색 결과를 보였습니다. 그러나 하나의 항체가 더 이상 시장에 나와 있지 않았기 때문에 인간 조직을 대상으로 한 일련의 테스트를 위해 토끼 숙주의 NE 항체와 쥐 숙주의 NE 항체를 비교했습니다. 생쥐 샘플의 경우, 이 연구가 시작될 때 토끼 숙주에서 자란 NE 항체에 대한 사용 가능하고 신뢰할 수 있는 대안이 없는 것 같았습니다. 하나의 NE와 두 개의 H3cit 항체는 동일한 토끼 숙주에서 파생되기 때문에 이 프로토콜로 이중 염색을 위해 결합할 수 없습니다. 2차 항체는 1차 항체의 일정한 영역에 특이적이며, 이는 1차 항체가 자란 숙주에 의해 결정됩니다. 동일한 숙주에서 유래한 두 개의 1차 항체를 사용하는 경우, 2차 항체는 두 개의 1차 항체에 결합할 수 있으며, 염색은 비특이적일 수 있습니다. 그러나 단일 염색보다 이중 염색이 선호되는데, 그 이유는 더 많은 NET 성분을 검출하고 공동 국소화할 수 있기 때문입니다. 따라서 염색 결과가 더 구체적입니다. 결과적으로, 우리는 보다 강력한 검출 프로토콜을 얻기 위해 H3cit 및 MPO에 대해 이중 염색을 수행했습니다.

사용된 항체의 유사성에도 불구하고, 항체에 대한 희석액은 거의 모든 프로토콜에서 다양했습니다. 예를 들어, triH3cit의 경우 농도 범위는 0.5μg/mL 내지 20μg/mL17,18이었습니다. 사용된 모든 항체에 대해 다양한 희석을 시도했고 문헌에 보고된 전체 범위에서 만족스러운 염색 결과를 얻었습니다.

또한, 1차 항체의 배양 시간(4°C에서 하룻밤)과 2차 항체의 사용 및 희석에서 많은 유사점을 찾을 수 있습니다( 표 1; Incubation primary antibody column)을 사용합니다. 따라서 테스트 시리즈에서 이러한 단계를 변경하지 않고 위에서 설명한 프로토콜에 따라 수행했습니다.

문헌에서 결정된 다음 중요한 단계는 항원 회수였습니다. 이 단계는, 포르말린 고정으로 인해, 항체에 대한 에피토프가 메틸렌 브리지를 통해 마스킹되기 때문에 필수적이며, 이는 적절한 완충액(29)에서 조직 절편을 가열함으로써 역전될 수 있다. pH 6에서의 구연산염 TRS 및 pH 9에서의 EDTA TRS 완충액은 문헌에서 동등하게 자주 사용되었으며 유사한 결과를 나타냈다( 표 1; TRS 버퍼 컬럼). 따라서 우리는 테스트 시리즈를 위해 pH 6 구연산염 TRS를 결정했습니다. 항원 회수를 위해 전자레인지(360W에서 처음 1분, 90W에서 9분)와 수조(60°C에서 90분, 96°C에서 10분)의 두 가지 가열 방법을 테스트했습니다.

문헌에서 약간의 변동성을 보여준 마지막 단계는 Triton X-100을 사용한 투과화였습니다. 이 단계는 세제 처리를 통해 세포막이 항체에 투과될 수 있고 세포 내 에피토프가30에 도달할 수 있기 때문에 최적화가 필요했습니다. 이전 프로토콜은 1%에서 0.1% 범위의 다양한 Triton X-100 농도를 사용했습니다( 표 1; 투과화 컬럼). 따라서 두 가지 Triton X-100 농도(0.2% 및 0.5%)와 Triton 투과성이 없는 한 계열을 시도했습니다.

이러한 주요 단계를 식별한 후 이를 수정하고 프로토콜을 최적화하려고 시도했습니다. 그런 다음 평가 시트에 따라 이미지를 검사하고 차이를 반정량적으로 기록하고 비교했습니다( 표 2 참조).

표 2: 프로토콜 단계 최적화를 위한 결과 표. 이 표는 적응된 단계(자가형광 환원제, 항원 회수 및 투과화)에 대한 결과를 보여줍니다. 이 테스트 시리즈를 시작하기 전에 최상의 항체 조합과 농도를 테스트했습니다. 슬라이드는 10개의 서로 다른 영역에서 평가된 다음 하나의 대표 영역은 부정적인 결과의 경우 (-)에서 긍정적인 NET 포함 결과의 경우 (++)까지 점수를 매겼습니다. 부분적으로 양성 결과에는 비호중구 세포의 더 높은 확산성 배경 염색이 포함되었습니다. 약어: n/u = 사용되지 않음; - = 음성 결과; +/-부분 양성 염색; + = 중간 정도의 특이적 염색; + = NET과 호중구의 좋은 염색. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

1차 항체
프로토콜을 적용하기 전에 최상의 항체 조합을 찾으려고 노력했습니다. 여기서, triH3cit는 H3cit (R8)보다 더 많은 세포 내 히스톤 염색을 보였다. NET을 검출하기 위해 프로토콜 최적화를 위해 H3cit(R8) 항체를 사용하기로 결정했습니다. 이 항체는 세포외 H3cit에만 결합하고 이 농도에서 세포내 H3cit의 염색을 나타내지 않았습니다(그림 1A,B 참조).

MPO 염색의 경우, 인간/마우스 MPO 항체를 인체 조직(그림 1C,D 참조)에 대한 MPO(2C7) 및 마우스 조직에 대한 MPO(2D4)(그림 1E,F 참조)와 비교했습니다. MPO(2D4) 및 MPO(2C7) 항체는 여러 조직 유형에 대해 일관된 염색을 달성할 수 없었지만 인간/마우스 MPO는 MPO에 대해 신뢰할 수 있고 우수한 염색을 제공했습니다. 따라서 염색 프로토콜로 인간/생쥐 MPO를 선택했습니다.

NE의 경우, 인간 조직에 대한 마우스 숙주의 NE 항체를 시험해 보았는데, 토끼 숙주의 NE 항체의 신뢰할 수 있는 염색에 비해 5개 샘플 중 1개에서만 NE 염색이 나타났습니다. 또한 토끼 숙주의 NE 항체는 인간 및 마우스 조직에 적용할 수 있습니다. (그림 1G,H 참조).

Figure 1
그림 1: 다른 조직에서의 1차 항체 비교. (A) H3cit(R8)(빨간색)로 염색된 인간 신생아 장염(NEC) 조직. 여기서는 세포외 신호만 검출할 수 있습니다. (B) triH3cit (R2,8,17) (빨간색)로 염색 된 동일한 조직. 이 항체는 시트룰린화 히스톤(노란색 화살표)의 강렬한 세포 내 염색으로 더 넓은 신호를 생성합니다. (씨,E) 인간 NEC 조직(C) 및 마우스 볼루스 조직(E)은 H3cit(R8)(빨간색) 및 마우스/인간 MPO(녹색)에 대해 양호한 염색을 제공합니다. H3cit, MPO 및 DAPI(파란색) 신호 공동 국소화는 NET 형성(흰색 화살표)을 나타냅니다. (D,F) 이에 비해, (D) 인간 NEC 조직에 대해 MPO(2C7)를 사용하고 마우스 볼루스 조직에 대해 (F)MPO(2D4)(녹색)를 사용하면 MPO 신호를 얻을 수 없습니다. (사) 토끼 숙주(자홍색)의 NE 항체에 대해 매우 강한 염색을 한 화상 인간 피부 샘플과 마우스 숙주의 NE 항체에 대한 (H) 음성 염색 결과. isotype 제어에 대해서는 보충 그림 isocontrol 1을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

탈파라핀화
여기서, 크실렌은 리모넨으로 대체되었는데, 이는 백그라운드에서 자가형광이 적고 크실렌에 비해 조직 샘플의 탈파라핀화가 더 양호한 것으로 나타났다(그림 2A,B 참조).

자가형광 환원제
Sudan Black을 기반으로 즉시 사용할 수 있는 자가형광 감소제는 2-20분 동안 적용할 수 있습니다. 여기서는 0분, 5분, 10분 동안 적용했습니다. 블로킹을 사용하지 않았을 때, 일부 마우스 샘플은 더 많은 비특이적 염색을 보였으며 부분적인 양성 염색에 도달할 수 있었습니다(그림 2C 참조). 5분의 차단 시간은 마우스의 폐 및 피부 조직에서 H3cit 및 MPO를 제외한 모든 조직 유형에서 양호한 결과를 보여주었습니다(표 2 참조). 일부 샘플에서 10분의 차단 시간이 지나면 염색의 밝기가 낮아지기 시작하므로 5분 시간 프레임이 자가형광 차단을 위한 최선의 선택입니다(그림 2D,E 참조).

Figure 2
그림 2: 탈파라핀화 방법 및 자가형광 환원제의 사용. (A) 인간 척추 디스크염 조직은 리모넨으로 탈파라핀화되고 H3cit(빨간색) 및 MPO(녹색)로 염색됩니다. 신호의 좌초 형성과 부분적인 공동 국소화는 NET의 존재를 나타냅니다(흰색 화살표). (비) 동일한 조직 샘플이 자일렌으로 탈파라핀화되어 유사한 염색 결과가 나왔으며, 이는 널리 사용되는 자일렌을 대체 배지로 대체할 수 있음을 나타냅니다. (씨-E) 자가형광 환원제에 대해 서로 다른 배양 시간을 사용할 때 다른 NE 염색 패턴(자홍색)을 나타내는 유도 패혈증 후의 마우스 폐 조직. 자가형광 환원제를 사용하지 않은 경우에도 이미지 C는 여전히 적혈구의 약간의 배경 염색을 보여줍니다(빨간색 화살표). 대조적으로, 이미지 D는 자가형광 환원제로 5분 배양 후 명확한 신호가 방출되는 것을 보여줍니다. 10분 후 이미지 E의 염색 품질이 저하되고 신호가 덜 밝아집니다. isotype 컨트롤에 대한 자세한 내용은 보충 그림 Isocontrol 2를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

항원 검색 방법
NE 염색을 위해 샘플을 pH 6 구연산염 완충액으로 전자레인지에서 10분 동안(360W에서 1분, 90W에서 9분), 96°C의 수조에서 10분, 60°C의 수조에서 90분 동안 가열했습니다. 여기서, 마이크로웨이브 및 수조의 더 높은 온도는 일관되게 중간 내지 양호한 항원 회수를 보여주었다( 도 3A 참조). 전자레인지와 96°C 수조 사이에는 유의한 차이가 발견되지 않았습니다( 표 2 참조). 더욱이, 60°C 수조에서는 부분적으로만 양성이거나 염색이 없는 것으로 나타났습니다( 그림 3B 참조). 인간 회장과 인간 심근만이 양호한 특이적 결과를 보였다. 60°C 수조로는 NE에 대한 적절한 염색을 달성할 수 없었기 때문에 H3cit 및 MPO에 대한 60°C 수조 테스트 시리즈는 폐기되었습니다.

MPO 및 H3cit를 사용한 이중 염색을 위해 샘플을 pH 6 구연산염 완충액으로 전자레인지에서 10분 동안(먼저 360W에서 1분, 90W에서 9분) 또는 96°C의 수조에서 10분 동안 가열했습니다. 여기서, 두 방법 모두 96°C 수조에 대해 약간 더 유리한 결과와 함께 양호한 특이적 결과를 보여주었습니다( 그림 3C 참조). 쥐의 폐와 피부 조직만이 중간 정도의 전체 순위를 달성할 수 있었다( 표 2 참조).

그러나 96°C에서 40분의 배양 시간을 초과하면 항체 염색이 덜 강렬해지는 반면, 실질적으로 더 많은 배경 염색이 관찰될 수 있습니다( 그림 3D 참조).

Figure 3
그림 3: 항원 회수 방법. (A) 열 회수를 위해 96°C에서 10분 배양 시간을 사용하여 NE(마젠타)로 염색된 마우스 volvulus 조직은 60°C 수조에서 90분 동안 샘플을 배양할 때 (B)보다 훨씬 더 강한 신호를 보여줍니다. (C) 또한, 96°C 항원 회수에서 10분 배양하면 결합된 NET 염색(흰색 화살표)과 함께 H3cit(빨간색) 및 MPO(녹색)에 대한 강력한 신호가 생성됩니다. 디: 그러나 샘플을 40분 이상 끓이면 덜 특이적인 세포외 H3cit 염색이 발생하고 MPO 염색이 발생하지 않습니다. isotype 컨트롤에 대해서는 보충 그림 Isocontrol 3을 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

투과화
Triton X-100을 사용하여 10분 동안 두 번의 희석액(0.2% 및 0.5%)으로 샘플을 투과시키고 이를 탈이온수에서 10분과 비교했습니다. 여기서, 트리톤 0.2%를 사용한 10분은 0.5% 트리톤 및 탈이온수 조건에 비해 차이가 작았음에도 불구하고 모든 조직 유형에서 양호한 결과를 얻었습니다( 표 2 참조).

보충 그림 Isocontrol 1: 그림 1의 Isotype 컨트롤. 모든 이미지는 양호한 DAPI(파란색) 염색을 보여주지만 형광 항체에 대한 신호는 없습니다. 이를 통해 그림 1의 1차 항체 결합이 표적 항원에 특이적이며 비특이적 결합 또는 단백질 상호 작용의 결과가 아님을 확인할 수 있습니다. (A) H3cit(R8)(빨간색)에 대한 isocontrol 항체로 염색된 인간 신생아 장염(NEC) 조직. (B) H3cit (R2,8,17)에 대한 isocontrol 항체로 염색 된 NEC 조직 (빨간색). (C) H3cit(R8)(빨간색) 및 마우스/인간 MPO(녹색)에 대한 isocontrol 항체로 염색된 NEC 조직(E) 및 마우스 볼루스 조직. (D) H3cit (R8) (빨간색) 및 MPO (2C7) (녹색)에 대한 isocontrol 항체로 염색 된 NEC 조직. (F) H3cit (R8) (빨간색) 및 MPO 2D4 (녹색)에 대한 isocontrol 항체로 염색 된 마우스 volvulus 조직. 지: 토끼 숙주(자홍색)의 NE 항체에 대한 isocontrol 항체로 염색된 화상을 입은 인간 피부 샘플. (H) 마우스 숙주(자홍색)의 NE 항체에 대한 isocontrol 항체로 염색된 동일한 조직. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 Isocontrol 2: 그림 2의 Isotype 컨트롤. 모든 이미지는 양호한 DAPI(파란색) 염색을 보여주지만 형광 항체에 대한 신호는 없습니다. 이를 통해 그림 2의 1차 항체의 특이적 결합을 확인할 수 있습니다. 이미지 C-E는 긴 노출 시간으로 인해 여전히 자홍색으로 약간의 배경 얼룩을 보여줍니다. 그러나 그림 2의 NE 신호는 배경 염색과 구별할 수 있습니다. (ᅡ) 인간 척추 디스크염 조직은 리모넨으로 탈파라핀화되고 H3cit(R8)(빨간색) 및 마우스/인간 MPO(녹색)에 대한 isocontrol 항체로 염색되었습니다. (비) 동일한 조직 샘플을 자일렌으로 탈파라핀화하고 H3cit(빨간색) 및 MPO(녹색)에 대한 isocontrol 항체로 염색했습니다. (씨) 자가형광 감소제를 사용하지 않고 NE(자홍색)용 isocontrol 항체로 염색한 마우스 폐 조직. (디) NE(마젠타)에 대한 isocontrol 항체로 염색한 동일한 조직과 자가형광 환원제로 5분 동안 배양합니다. (E) NE(마젠타)에 대한 isocontrol 항체로 염색하고 자가형광 환원제로 10분 동안 배양한 동일한 조직. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 Isocontrol 3: 그림 3의 Isotype 컨트롤. 모든 이미지는 양호한 DAPI(파란색) 염색을 보여주지만 형광 항체에 대한 특이적 신호는 없습니다. 이를 통해 그림 3의 1차 항체의 특이적 결합을 확인할 수 있습니다. (A) 열 회수를 위해 96°C에서 10분 배양 시간을 사용하여 NE(자홍색)용 isocontrol 항체로 염색된 마우스 volvulus 조직. (B) NE(마젠타)에 대한 isocontrol 항체로 염색하고 60°C 수조에서 90분 동안 열을 회수합니다. (C) H3cit(빨간색) 및 MPO(녹색)에 대한 isocontrol 항체로 염색되고 A에서와 동일한 열 회수 조건으로 염색된 동일한 조직. 녹색 점은 응집된 2차 항체의 염색 아티팩트를 나타냅니다. (D) H3cit(빨간색) 및 MPO(녹색)에 대한 isocontrol 항체로 염색하고 열 회수를 위해 96°C에서 40분 배양 시간을 사용하는 동일한 조직. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 Isocontrol 4: 그림 4의 Isotype 컨트롤. 다음 isocontrol은 모두 해당 "실패한" 실험과 동일한 슬라이드에서 가져온 것입니다. 실패한 시도는 의도적으로 이루어지지 않았으므로 일부 isocontrol은 사용할 수 있는 것으로 보이지만 샘플은 그렇지 않습니다. (A) H3cit(빨간색) 및 MPO(녹색)에 대한 isocontrol 항체로 염색된 NEC 조직. 이 샘플은 건조되지 않고 더 빠르게 처리되었습니다. 따라서 과도한 배경 얼룩이 보이지 않습니다. 녹색과 빨간색 구조는 2차 항체 응집체입니다. (비) NE(자홍색)에 대한 isocontrol 항체로 염색된 척추 디스크염 조직. 여기서는 탈파라핀화가 성공했기 때문에 파라핀 잔여물을 볼 수 없습니다. (씨) NEC 조직은 H3cit(빨간색) 및 MPO(녹색)에 대한 isocontrol 항체로 염색되었습니다. 부적절하게 보관된 동일한 2차 항체를 사용하더라도 이 isocontrol 이미지에 대해 염색이 예상되지 않습니다. 따라서 이 이미지는 해당 이미지의 특정 바인딩을 평가하는 데 사용할 수 없습니다. (디) H3cit(빨간색) 및 MPO(녹색)에 대한 isocontrol 항체로 염색된 화상을 입은 인간 피부. 여기에서 장착이 더 조심스럽게 이루어졌으며 기포를 통한 빛의 산란을 볼 수 없습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 연구에서 우리는 실제 염색 과정부터 시작하여 NET을 이미징하기 위한 기존 프로토콜을 더 많은 조직 유형에 적용하고 최적화하는 것을 목표로 했습니다. 이 방법의 첫 번째 중요한 단계는 가장 적합한 항체를 선택하는 것입니다. NE의 경우, 인간 조직에 대한 쥐 숙주의 NE 항체를 시험해 보았는데, 토끼 숙주의 NE에 비해 신뢰할 수 있는 염색이 없었습니다. 또한, Thålin et al.은 H3cit(R8)를 세포외 염색을 위한 보다 특이적인 항체로 제안했습니다. 이 항체를 널리 사용되는 triH3cit(R2, R8, R17)와 비교했습니다. 우리의 연구는 H3cit(R8) 항체가 사용된 농도에서 세포외 신호에 대해서만 염색되어 슬라이드에서 NET을 더 쉽게 인식할 수 있음을 보여주었습니다. 이 발견은 H3cit (R8) 클론이 비 시트룰린 히스톤에 대한 오프 타겟 교차 반응성이 감소된 양호한 NET 신호를 제공할 수 있다는 Thålin et al.의 주장을 뒷받침한다28. 또한 MPO 염색을 위해 인간 및 마우스 조직에 대한 MPO 항체를 비교했습니다. 그 결과 마우스/인간 MPO 항체가 더 신뢰할 수 있는 염색을 보였으며 인간과 마우스 샘플에 동시에 사용할 수 있어 실험실에서의 사용이 간소화되었습니다. 따라서 이 항체 조합인 H3cit(R8)와 마우스/인간 MPO를 향후 연구에 사용하고 프로토콜에 구현하는 것이 좋습니다.

그러나 이 항체 선택으로 여러 번 염색을 시도하는 데는 한계가 있습니다. 이 프로토콜은 다른 숙주의 1차 항체를 사용하도록 수정되었습니다. 그렇지 않으면 하나의 2차 항체가 두 개의 1차 항체에 결합할 수 있습니다. H3cit 항체는 NE 항체와 동일한 숙주에서 나오므로 NE와 H3cit를 함께 염색할 수 없습니다. 이 연구에서는 삼중 염색(NE, H3cit, MPO)이 수행되지 않았지만 이 프로토콜은 향후 삼중 염색 실험의 기초가 될 수 있습니다. 삼중 염색 또는 NE 및 H3cit 이중 염색을 위한 한 가지 가능한 옵션은 이러한 항체 중 하나를 다른 숙주의 신뢰할 수 있는 항체로 교환하는 것입니다. 이 경우, 가능한 조합 파트너는 Knackstedt et al.24에 의해 사용된 양의 NE 항체(Santa Cruz; sc-55549)일 수 있습니다. Duler et al.의 또 다른 옵션은 2021년에 발표되었는데, 여기서 그들은 연속적인 이중 염색 방법을 사용하고 토끼 숙주26에서 NE와 H3cit를 결합했습니다. 다중 염색 방법의 또 다른 유망한 응용 분야는 혈관 내 및 혈관 외 NET 형성을 구별하는 것입니다. NET 마커에 대한 삼중 염색 대신, 이중 NET 염색을 추가 혈관 염색과 결합할 수 있습니다. 또한 알츠하이머병과 같은 특정 질병의 병리 메커니즘에 대한 더 많은 지식을 얻기 위해 NET의 혈관 내 및 혈관 외 분포를 조사하는 연구가 증가하고 있습니다. Smyth et al.31 은 두 가지 가능한 현지화를 구별하기 위해 우리와 유사한 유망하고 심층적인 프로토콜을 설명했습니다. 연구진은 내피 세포를 표지하기 위해 비오틴화된 렉틴을 추가하여 기존 NET 염색 프로토콜을 수정하고 렉틴의 면역형광 염색을 위해 형광단 접합 스트렙타비딘을 사용했습니다. 동일한 이미지에서 렉틴과 NET 마커의 공동 국소화를 조사함으로써, 그들은 혈관 내 NET을 식별할 수 있었다31. 이러한 맥락에서 우리 프로토콜의 적용을 확대하기 위한 추가 연구가 필요합니다.

가장 적합한 항체 조합을 찾은 후 다음으로 중요한 단계는 자가형광 감소제를 도입하는 것입니다. 포름알데히드 고정제를 사용한 시료 고정과 같은 외인성 요인과 적혈구와 같은 내인성 요인은 높은 자가형광을 초래할 수 있으며, 이는 공동 국소화를 결정하기 어렵게 만든다32. 이 문제는 주로 청색(여기 영역: 430-480nm) 및 녹색 형광 스펙트럼(여기 영역: 500-550nm)에서 발생하며, 동일한 여기 영역을 가진 형광 항체를 사용할 경우 결정적이지 않은 염색 결과를 초래할 수 있다3. 문헌에 따르면 Sudan Black은 고유한 조직 자가형광을 감소시키는 효과적인 약제입니다33. Sudan Black을 사용하면 청색 또는 녹색 형광 채널을 사용하여 보다 선명한 염색 결과를 얻을 수 있습니다. 이 여기 영역은 네 번째 형광 염료를 사용할 때 청색 및 녹색 채널이 필요하기 때문에 향후 여러 염색 시도에 필요합니다. 우리의 연구에 따르면 최적의 배양 시간은 염색 공정에 사용되는 조직과 항체의 유형에 따라 다릅니다. 그럼에도 불구하고, 이 연구에서 5분 동안 자가형광 환원제를 투여하면 일반적으로 모든 조직 유형에서 좋은 결과를 얻을 수 있었고 샘플을 검은색으로 염색하여 슬라이드에서 더 쉽게 볼 수 있는 이점이 있었습니다. 이는 염색 과정에서, 특히 작은 샘플에서 조직의 일부가 누락되는 것을 방지했습니다.

이 프로토콜의 성공을 위한 또 다른 필수 요소는 항원 회수 단계를 위한 일정한 고온입니다. 우리의 연구에 따르면 15 개의 이전 연구 중 10 개는 항원 검색에 96 °C 이상의 온도를 사용했습니다 13,15,16,17,19,21,22,25,26,27. 이는 96°C 수조 또는 전자레인지에서 샘플을 배양한 결과 큰 차이 없이 좋은 결과를 얻었다는 결과와 일치했습니다. 그럼에도 불구하고 균일한 열 분포를 위해 수조를 사용하는 것이 좋습니다. 전자레인지를 사용할 때 완충액에서 염색 용기의 상단과 하단 사이의 온도 구배가 최대 5°C인 것을 발견했습니다. 또한 수조는 사용하기 쉽고 완충액이 끓을 위험이 적습니다. 투과성의 경우, Triton X-100이 염색에 미치는 영향이 적다는 것을 발견했습니다. 따라서 프로토콜에서 이 단계를 건너뛸 수 있지만 결과에 부정적인 영향을 미치지 않습니다. 일반적으로 인간 샘플은 마우스 샘플보다 더 나은 결과를 제공했습니다. 그 이유는 인간이 생쥐보다 호중구의 비율이 더 높기 때문일 수있습니다 34,35. 또한 쥐 폐 샘플은 눈에 띄는 거시적 염증이 없고 호중구가 더 적은 반면, 쥐 장 샘플은 거시적으로 염증이 있었고 양호한 염색 결과를 보여주었습니다. 따라서 본 연구에서 낮은 점수는 프로토콜이 최적으로 작동하지 않기 때문이 아니라 낮은 염증으로 인한 것일 수 있습니다.

문제 해결을 위해 프로토콜의 사소한 오류나 샘플을 주의 깊게 취급하지 않으면 염색 결과에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. 우리가 확인한 한 가지 주요 문제는 샘플 탈수였습니다. 여기에서 한 번에 10-15개 이상의 슬라이드를 처리하는 것이 매우 중요하다는 것을 알게 되었는데, 이는 모든 단계가 시간이 많이 걸리고 샘플의 탈수를 초래할 수 있기 때문입니다. 탈수된 샘플은 높은 백그라운드 염색과 검출 가능한 특정 형광 신호가 없기 때문에 더 이상 사용할 수 없습니다(그림 4A 참조). 또한 염색 프로토콜을 시작하기 전에 샘플을 완전히 탈파라핀화해야 합니다. 파라핀 잔류물은 강한 배경 신호를 발생시켰고, 염색된 파라핀에서 절단선을 볼 수 있었다(그림 4B 참조). 또한, 20회 이상의 동결-해동 사이클 후, MPO에 대한 2차 항체에 대한 신호는 검출될 수 없었다(도 4C 참조). 이미지 품질에 큰 영향을 미치는 또 다른 중요한 단계는 최종 장착 단계를 처리하는 것입니다. 이 작업에서는 커버슬립 아래의 기포로 인해 형광 신호가 산란되어 이미지가 흐려졌습니다(그림 4D 참조).

Figure 4
그림 4: 문제 해결 팁 (A) 이 패널은 건조된 샘플의 결과를 보여줍니다. 단색의 빨간색 배경 염색은 샘플의 평가를 방해합니다. (비) 여기서 빨간색 화살표는 불충분한 탈파라핀화 후 주름진 외관을 특징으로 하는 파라핀 잔여물을 보여줍니다. 이러한 잔여물은 높은 배경 신호와 낮은 품질의 이미지를 초래합니다. (씨) 부적절한 항체 보관 또는 20회 이상의 동결-해동 주기는 2차 항체의 응집(녹색 화살표)을 초래하고 MPO에 결합하지 않습니다. (디) 조심스럽게 장착하지 않으면 기포가 발생하여 형광등(파란색 화살표)이 산란될 수 있습니다. 이는 특히 산란이 대상을 흐리게 할 때 이미지 품질에 큰 영향을 미칠 수 있습니다. isotype 컨트롤에 대해서는 보충 그림 Isocontrol 4를 참조하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

NET이 과학 연구에서 더 많은 인기를 얻고 있음에도 불구하고 NET 검출 방법에 초점을 맞춘 연구는 아직 충분하지 않습니다 3,13,17,26. 우리가 아는 한, 우리는 FFPE 조직에서 NET의 면역 형광 이미징에 대한 여러 연구의 프로토콜을 비교하는 첫 번째 연구를 제시합니다. 이전에 발표된 맞춤형 프로토콜은 항체 또는 항원 회수 방법이 다르고 한 가지 조직 유형에만 설계된 경우가 많아 NET 이미징 결과를 비교하기가 더 어려웠습니다. 따라서 이 연구에서 우리는 중요한 단계를 식별하고 다양한 마우스 및 인간 조직에 적합한 프로토콜을 설정했습니다. H3cit 염색을 위한 새로운 1차 항체를 사용하고 자가형광 환원제로 배경 염색을 줄임으로써 이를 달성했습니다. 또한, 일정한 고온이 중요하며, 성공적인 NET 염색을 위해서는 샘플을 세심하게 취급하는 것이 필수적이라는 것을 보여주었습니다. 따라서 이 연구는 NET을 염색하는 데 일반적으로 적용 가능한 프로토콜을 개발하기 위한 필수 단계를 제공합니다.

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Disclosures

저자는 공개할 것이 없습니다.

Acknowledgments

이 연구는 독일 연구 협회 (BO5534)에 의해 설립되었습니다. 샘플을 제공해 주신 Antonia Kiwitt, Moritz Lenz, Johanna Hagens, Annika Heuer 박사, PD Ingo Königs 박사에게 감사드립니다. 또한 저자들은 면역형광 현미경 검사를 지원해 준 UKE Microscopy Imaging Facility(핵심 시설, UKE Medical School) 팀에 감사를 표합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
         Dilution
Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg abcam Ab 68672  1:100
Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody  100µg abcam Ab 5103 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg abcam Ab 25989 1:50
Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg abcam Ab 90810 1:50
Axiovision Microscopy Software  Zeiss 4.8.2.
Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml GeneTex  GTX30972
Coverslips Marienfeld 0101202
Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) Dako S2369
DAPI 25 mg Roth 6335.1 1:25000
DCS antibody dilution 500 mL DCS diagnostics DCS AL120R500
Donkey ant goat Cy3 JacksonImmunoResearch 705-165-147 1:200
Donkey anti rabbit AF647 JacksonImmunoResearch 711-605-152 1:200
Donkey anti rabbit Cy3 JacksonImmunoResearch 711-165-152 1:200
Fluoromount-G Mounting Medium Invitrogen 00-4958-02
Glass slide rack Roth H552.1
Human/Mouse MPO Antibody R&D Systems AF 3667  1:20
Hydrophobic Pen KISKER MKP-1
Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg abcam Ab 37415 1:2000 and 1:250
MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml Maxvision MB-L
Microscopy camera Zeiss AxioCamHR3
Microwave Bosch HMT84M421
Mouse IgG1 negative control Dako X0931 Aglient 1:50 and 1:5
Normal Goat IgG Control R&D Systems AB-108-C  1:100
PBS Phosphate buffered saline (10x) Sigma-Aldrich P-3813
PMP staining jar Roth 2292.2
Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg abcam Ab 219406 1:100
Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] - Isotype Control 200µg abcam Ab 172730 1:300
ROTI Histol Roth  6640
SuperFrost Plus slides R. Langenbrinck 03-0060
TBS Tris buffered saline (x10) Sigma-Aldrich T1503
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416
Water bath Memmert 830476
Water bath rice cooker reishunger RCP-30
Wet chamber Weckert Labortechnik 600016
Zeiss Widefield microscope Zeiss Axiovert 200M

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References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
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Erratum

Formal Correction: Erratum: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues
Posted by JoVE Editors on 09/29/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. The Authors section was updated from:

Lavinia Schöenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

to:

Lavinia Schoenfeld1
Birgit Appl1
Laia Pagerols-Raluy1
Annika Heuer3
Konrad Reinshagen1
Michael Boettcher1,2
1Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf, University of Hamburg
2Department of Pediatric Surgery, University Medical Center Mannheim, University of Heidelberg
3Division of Spine Surgery, Department of Trauma and Orthopedic Surgery, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE)

인간 및 생쥐 조직에서 호중구 세포외 트랩의 면역형광 이미징
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Schoenfeld, L., Appl, B.,… More

Schoenfeld, L., Appl, B., Pagerols-Raluy, L., Heuer, A., Reinshagen, K., Boettcher, M. Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues. J. Vis. Exp. (198), e65272, doi:10.3791/65272 (2023).

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