הדמיה אימונופלואורסצנטית של מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים ברקמות אדם ועכבר
Summary
מלכודות חוץ-תאיות נויטרופילים (NETs) קשורות למחלות שונות, ואימונופלואורסנציה משמשת לעתים קרובות להדמיה שלהן. עם זאת, ישנם פרוטוקולי צביעה שונים, ובמקרים רבים, רק סוג אחד של רקמה נבדק. כאן, אנו קובעים פרוטוקול ישים באופן כללי להכתמת רשתות בעכבר וברקמות אנושיות.
Abstract
מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) משתחררות על ידי נויטרופילים כתגובה לזיהום חיידקי או נזק טראומטי לרקמות, אך גם ממלאות תפקיד במחלות אוטואימוניות ודלקות סטריליות. הם מבנים דמויי רשת המורכבים מחוטי דנ”א דו-גדיליים, היסטונים וחלבונים אנטי-מיקרוביאליים. לאחר שחרורם, NETs יכולים ללכוד ולהרוג פתוגנים חוץ-תאיים בדם וברקמות. יתר על כן, NETs משתתפים בוויסות הומיאוסטטי על ידי גירוי הידבקות טסיות וקרישה. עם זאת, הייצור המווסת של NETs נקשר גם עם מחלות שונות, כולל אלח דם או הפרעות אוטואימוניות, מה שהופך אותם למטרה מבטיחה להתערבות טיפולית. מלבד מיקרוסקופ אלקטרונים, הדמיה של NETs באמצעות הדמיה אימונופלואורסצנטית היא כיום אחת השיטות הידועות היחידות להדגמת אינטראקציות NET ברקמות. לכן, נעשה שימוש בשיטות צביעה שונות כדי להמחיש NETs. בספרות מתוארים פרוטוקולי צביעה שונים, וזיהינו ארבעה מרכיבים עיקריים המראים שונות גבוהה בין פרוטוקולים: (1) סוגי הנוגדנים שבהם נעשה שימוש, (2) שימוש בחומרים מפחיתי פלואורסצנטיות אוטופלואורסצנטית, (3) שיטות שליפת אנטיגן, ו-(4) חלחול. לכן, פרוטוקולי צביעה אימונופלואורסצנטית במבחנה הותאמו ושופרו באופן מערכתי בעבודה זו כדי להפוך אותם לישימים עבור מינים שונים (עכבר, אדם) ורקמות (עור, מעי, ריאות, כבד, לב, דיסק בעמוד השדרה). לאחר קיבוע ושיבוץ פרפין, חלקים בעובי 3 מיקרומטר הותקנו על מגלשות. דגימות אלה הוכתמו בנוגדנים ראשוניים עבור myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit) ו neutrophil elastase (NE) על פי פרוטוקול צביעה שונה. השקפים הוכתמו בנוגדנים משניים ונבדקו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב. התוצאות נותחו על פי דף הערכה, וההבדלים נרשמו באופן כמותי למחצה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול צביעת NET מותאם לרקמות שונות. השתמשנו בנוגדן ראשוני חדשני כדי להכתים עבור H3cit והפחתנו כתמים לא ספציפיים עם חומר להפחתת פלואורסצנטיות אוטופלואורסצנטית. יתר על כן, הוכחנו כי צביעת רשת דורשת טמפרטורה גבוהה קבועה וטיפול זהיר בדגימות.
Introduction
מלכודות נויטרופילים חוץ-תאיות (NETs) הודגמו לראשונה על ידי ברינקמן ועמיתיו כמסלול של מוות תאי שונה מאפופטוזיס ונמק בשנת 20041. במסלול זה, נויטרופילים משחררים את הכרומטין המעובה שלהם לתוך החלל החוץ-תאי כדי ליצור מבנים גדולים דמויי רשת המכוסים בחלבונים אנטי-מיקרוביאליים שהיו מאוחסנים בעבר בגרגירים או בציטוזול. חלבונים אנטי-מיקרוביאליים אלה כוללים אלסטאז נויטרופילים (NE), מיאלופרוקסידז (MPO) והיסטון ציטרוליניציה H3 (H3cit), המשמשים בדרך כלל לזיהוי עקיף של NETs2 באימונופלואורסנציה. שיטה זו לא רק מזהה את הנוכחות הכמותית של חלבונים אלה; ואכן, יש לו את היתרון של זיהוי ספציפי מבנים דמויי NET. ב-NETs, החלבונים שהוזכרו מתמקמים יחד עם דנ”א חוץ-תאי, אשר יכול להיות מזוהה על ידי חפיפה של אותות הפלואורסצנטיות של כל חלבון מוכתם והדנ”א החוץ תאי. בניגוד לאותות החופפים הנובעים מדנ”א חוץ-תאי וקולוקליזציה של חלבונים ב-NETs, נויטרופילים שלמים אינם מראים לוקליזציה משותפת. כאן, רכיבי NET מאוחסנים בדרך כלל בנפרד בגרגירים, גרעינים, וציטוזול3.
מאז גילוים הראשון, הוכח כי NETs ממלאים תפקיד מרכזי במחלות רבות, במיוחד אלה הכרוכות בדלקת. NETs מראים תפקודים אנטי-מיקרוביאליים במהלך זיהום באמצעות לכידה והרג של פתוגנים חוץ-תאיים בדם וברקמות 4,5. עם זאת, NETs נקשרו גם למחלות אוטואימוניות ולתגובות היפר-דלקתיות, כמו זאבת אדמנתית מערכתית, דלקת מפרקים שגרונית ואסתמה אלרגית 6,7,8. NETs מקדמים חסימת כלי דם ודלקת בטרשת עורקים, הידבקות טסיות, ומשערים כי הם ממלאים תפקיד בסרטן גרורתי 9,10,11. עם זאת, מאמינים שיש להם תכונות אנטי דלקתיות על-ידי הפחתת רמות הציטוקינים מעודדי דלקת12. בעוד NETs צוברים עניין רב יותר בתחום רחב יותר של מחקר, שיטת זיהוי NET חזקה היא בסיסית למחקר עתידי.
אף על פי שהדמיה של NETs ברקמות שונות באמצעות הדמיה אימונופלואורסצנטית היא מורכבת ודורשת התאמה אישית, מלבד מיקרוסקופ אלקטרונים, היא כיום אחת השיטות הידועות ביותר להמחשת האינטראקציות בין NETs ותאים, והיא משמשת בעיקר ברקמות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE)13,14. עם זאת, השוואת הדמיה נטו קשה, שכן מעבדות שונות משתמשות בפרוטוקולים מותאמים אישית משלהן. פרוטוקולים אלה נבדלים זה מזה בשימוש שלהם בנוגדנים, בשליפת אנטיגן או בשיטת החדירה, ולעתים קרובות הם מותאמים לסוג מסוים של רקמה 3,13,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 ,27.
לאחר שברינקמן ועמיתיו פרסמו את המחקר המתודי הראשון באמצעות הדמיה אימונופלואורסצנטית של NETs ברקמת FFPE, רצינו למטב פרוטוקול זה עבור מגוון רחב יותר של רקמות ומינים15. בנוסף, כדי לבסס פרוטוקול אימונופלואורסצנטי ישים באופן רחב, בדקנו פרוטוקולים שונים ששונו ממחקרים שהשתמשו בשיטות אימונופלואורסצנטיות ברקמת FFPE כדי לזהות NETs 3,13,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25, 26,27. יתר על כן, ניסינו נוגדן H3cit חדש עבור צביעה חוץ-תאית ספציפיתיותר 28. אנו משערים כי על ידי התאמה שיטתית של פרוטוקולי הצביעה הנוכחיים למינים ולרקמות שונים, ניתן לשפר את ההדמיה במבחנה, וכתוצאה מכך לייצג טוב יותר את האינטראקציה בין נויטרופילים ו- NETs הן מקומית והן מערכתית.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעבודה זו שאפנו להתאים ולייעל את הפרוטוקולים הקיימים להדמיית NET לסוגי רקמות נוספים, החל מתהליך הצביעה בפועל. הצעד הקריטי הראשון לשיטה זו הוא בחירת הנוגדנים המתאימים ביותר. עבור NE, ניסינו נוגדן NE מפונדקאי עכבר על רקמה אנושית, אשר לא הראה כתמים אמינים בהשוואה ל- NE ממארח ארנב. יתר על כן, Thålin et al…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נוסד על ידי חברת המחקר הגרמנית (BO5534). אנו מודים לאנטוניה קיוויט, מוריץ לנץ, יוהנה האגנס, ד”ר אניקה הואר וד”ר אינגו קוניגס על שסיפקו לנו דגימות. בנוסף, המחברים מודים לצוות של מתקן הדמיה מיקרוסקופיה UKE (מתקן הליבה, בית הספר לרפואה של UKE) על התמיכה במיקרוסקופ האימונופלואורסצנטי.
Materials
| Dilution | |||
| Anti-Neutrophil Elastase antibody 100µg | abcam | Ab 68672 | 1:100 |
| Anti-Histone H3 (citrulline R2 + R8 + R17) antibody 100µg | abcam | Ab 5103 | 1:50 |
| Anti-Myeloperoxidase antibody [2C7] anti-human 100 µg | abcam | Ab 25989 | 1:50 |
| Anti-Myeloperoxidase antibody [2D4] anti-mouse 50 µg | abcam | Ab 90810 | 1:50 |
| Axiovision Microscopy Software | Zeiss | 4.8.2. | |
| Blocking solution with donkey serum (READY TO USE) 50ml | GeneTex | GTX30972 | |
| Coverslips | Marienfeld | 0101202 | |
| Dako Target Retrieval Solution Citrate pH6 (x10) | Dako | S2369 | |
| DAPI 25 mg | Roth | 6335.1 | 1:25000 |
| DCS antibody dilution 500 mL | DCS diagnostics | DCS AL120R500 | |
| Donkey ant goat Cy3 | JacksonImmunoResearch | 705-165-147 | 1:200 |
| Donkey anti rabbit AF647 | JacksonImmunoResearch | 711-605-152 | 1:200 |
| Donkey anti rabbit Cy3 | JacksonImmunoResearch | 711-165-152 | 1:200 |
| Fluoromount-G Mounting Medium | Invitrogen | 00-4958-02 | |
| Glass slide rack | Roth | H552.1 | |
| Human/Mouse MPO Antibody | R&D Systems | AF 3667 | 1:20 |
| Hydrophobic Pen | KISKER | MKP-1 | |
| Isokontrolle Rabbit IgG Polyclonal 5mg | abcam | Ab 37415 | 1:2000 and 1:250 |
| MaxBlock Autofluorescence Reducing Reagent Kit (RUO) 100 ml | Maxvision | MB-L | |
| Microscopy camera | Zeiss | AxioCamHR3 | |
| Microwave | Bosch | HMT84M421 | |
| Mouse IgG1 negative control | Dako | X0931 Aglient | 1:50 and 1:5 |
| Normal Goat IgG Control | R&D Systems | AB-108-C | 1:100 |
| PBS Phosphate buffered saline (10x) | Sigma-Aldrich | P-3813 | |
| PMP staining jar | Roth | 2292.2 | |
| Recombinant Anti-Histone H3 (citrulline R8) antibody 100µg | abcam | Ab 219406 | 1:100 |
| Recombinant Rabbit IgG, monoclonal [EPR25A] – Isotype Control 200µg | abcam | Ab 172730 | 1:300 |
| ROTI Histol | Roth | 6640 | |
| SuperFrost Plus slides | R. Langenbrinck | 03-0060 | |
| TBS Tris buffered saline (x10) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Water bath | Memmert | 830476 | |
| Water bath rice cooker | reishunger | RCP-30 | |
| Wet chamber | Weckert Labortechnik | 600016 | |
| Zeiss Widefield microscope | Zeiss | Axiovert 200M |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Urban, C. F., et al. Neutrophil extracellular traps contain calprotectin, a cytosolic protein complex involved in host defense against Candida albicans. PLoS Pathogens. 5 (10), e1000639 (2009).
- Abu Abed, U., Brinkmann, V. Immunofluorescence labelling of human and murine neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded tissue. Journal of Visualized Experiments. (151), e60115 (2019).
- Kawasaki, H., Iwamuro, S. Potential roles of histones in host defense as antimicrobial agents. Infectious Disorders – Drug Targets. 8 (3), 195-205 (2008).
- Bianchi, M., Niemiec, M. J., Siler, U., Urban, C. F., Reichenbach, J. Restoration of anti-Aspergillus defense by neutrophil extracellular traps in human chronic granulomatous disease after gene therapy is calprotectin-dependent. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 127 (5), 1243-1252 (2011).
- Hakkim, A., et al. Impairment of neutrophil extracellular trap degradation is associated with lupus nephritis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (21), 9813-9818 (2010).
- Papadaki, G., et al. Neutrophil extracellular traps exacerbate Th1-mediated autoimmune responses in rheumatoid arthritis by promoting DC maturation. European Journal of Immunology. 46 (11), 2542-2554 (2016).
- Toussaint, M., et al. Host DNA released by NETosis promotes rhinovirus-induced type-2 allergic asthma exacerbation. Nature Medicine. 23 (6), 681-691 (2017).
- Fuchs, T. A., et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (36), 15880-15885 (2010).
- Park, J., et al. Cancer cells induce metastasis-supporting neutrophil extracellular DNA traps. Science Translational Medicine. 8 (361), (2016).
- Warnatsch, A., Ioannou, M., Wang, Q., Papayannopoulos, V. Inflammation. Neutrophil extracellular traps license macrophages for cytokine production in atherosclerosis. Science. 349 (6245), 316-320 (2015).
- Schauer, C., et al. Aggregated neutrophil extracellular traps limit inflammation by degrading cytokines and chemokines. Nature Medicine. 20 (5), 511-517 (2014).
- Radermecker, C., Hego, A., Delvenne, P., Marichal, T. Identification and quantitation of neutrophil extracellular traps in human tissue sections. BioProtocol. 11 (18), e4159 (2021).
- de Buhr, N., von Köckritz-Blickwede, M. How neutrophil extracellular traps become visible. Journal of Immunology Research. 2016, 4604713 (2016).
- Brinkmann, V., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Immunodetection of NETs in paraffin-embedded tissue. Frontiers in Immunology. 7, 513 (2016).
- Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. The Journal of Immunology. 187 (1), 538-552 (2011).
- Santos, A., et al. NETs detection and quantification in paraffin embedded samples using confocal microscopy. Micron. 114, 1-7 (2018).
- Savchenko, A. S., et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (6), 860-870 (2014).
- O’Sullivan, K. M., et al. Renal participation of myeloperoxidase in antineutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated glomerulonephritis. Kidney International. 88 (5), 1030-1046 (2015).
- Barliya, T., et al. Possible involvement of NETosis in inflammatory processes in the eye: Evidence from a small cohort of patients. Molecular Vision. 23, 922-932 (2017).
- Xu, D., et al. Overproduced bone marrow neutrophils in collagen-induced arthritis are primed for NETosis: An ignored pathological cell involving inflammatory arthritis. Cell Proliferation. 53 (7), e12824 (2020).
- Nonokawa, M., et al. Association of neutrophil extracellular traps with the development of idiopathic osteonecrosis of the femoral head. American Journal of Pathology. 190 (11), 2282-2289 (2020).
- Tucker, S. L., Sarr, D., Rada, B. Neutrophil extracellular traps are present in the airways of ENaC-overexpressing mice with cystic fibrosis-like lung disease. BMC Immunology. 22 (1), 7 (2021).
- Knackstedt, S. L., et al. Neutrophil extracellular traps drive inflammatory pathogenesis in malaria. Science Immunology. 4 (40), (2019).
- Nakazawa, D., et al. Histones and neutrophil extracellular traps enhance tubular necrosis and remote organ injury in ischemic AKI. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (6), 1753-1768 (2017).
- Duler, L., Nguyen, N., Ontiveros, E., Li, R. H. L. Identification of neutrophil extracellular traps in paraffin-embedded feline arterial thrombi using immunofluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (157), e60834 (2020).
- Stehr, A. M., et al. Neutrophil extracellular traps drive epithelial-mesenchymal transition of human colon cancer. Journal of Pathology. 256 (4), 455-467 (2022).
- Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
- Yamashita, S. Heat-induced antigen retrieval: Mechanisms and application to histochemistry. Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).
- Jamur, M. C., Oliver, C. Permeabilization of cell membranes. Methods in Molecular Biology. 588, 63-66 (2010).
- Smyth, L., et al. Neutrophil-vascular interactions drive myeloperoxidase accumulation in the brain in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica Communications. 10 (1), 38 (2022).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 2-22 (2017).
- Nazir, S., Charlesworth, R. P. G., Moens, P., Gerber, P. F. Evaluation of autofluorescence quenching techniques on formalin-fixed chicken tissues. Journal of Immunological Methods. 496, 113097 (2021).
- Schneider, C., et al. IVIG regulates the survival of human but not mouse neutrophils. Scientific Reports. 7 (1), 1296 (2017).
- Risso, A. Leukocyte antimicrobial peptides: Multifunctional effector molecules of innate immunity. Journal of Leukocyte Biology. 68 (6), 785-792 (2000).
