Summary
Qui mostriamo un metodo per indurre la registrazione e il progresso di una ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) reazione nell'orecchio ratto. Questa è seguita da una dimostrazione della preparazione di tessuto di ratto orecchio per l'imaging a due fotoni del effettrici / risposta delle cellule T memoria.
Abstract
Ipersensibilità di tipo ritardato (DTH) è una reazione immunitaria in cui i protagonisti sono CCR7 - effettrici / linfociti T memoria. Qui, dimostriamo un metodo per indurre il progresso e la registrazione di una reazione DTH nell'orecchio ratto. Questa è seguita da una dimostrazione della preparazione di tessuto di ratto orecchio per l'imaging a due fotoni del CCR7 - effettrici / risposta delle cellule T memoria.
Un DTH adottiva è indotta dalla iniezione intraperitoneale di GFP-etichettata Ova-specifiche CCR7 - effettrici / memoria linea cellulare T (Beeton, C J. Esperimenti Visualized, numero 8). Le cellule sono poi lasciato equilibrare nel ratto per 48 ore prima sfida, iniettando un orecchio con soluzione salina (controllo orecchio) e l'altro con una miscela 1:1 di coniugati Ova e Ova a Texas-Red (Ova-TR) per consentire la visualizzazione residente di cellule presentanti l'antigene.
Descriviamo un metodo di preparazione dei tessuti utili per l'imaging la motilità delle cellule all'interno dello strato dermico profondo durante una risposta immunitaria, in collaborazione con visualizzazione delle fibre di collagene da generazione di seconda armonica. Il tessuto viene tagliato l'orecchio in 5 x 5 millimetri quadrati (leggermente più grande è meglio), montato su slitta copertura in plastica con Vetbond ™, che sono poi protetti con grasso al silicone in una camera di imaging e superfused da ossigeno-bolle terreni di coltura a 37 ° C .
Protocol
Induzione di DTH adottivi
Si prega di consultare l'articolo jove: induzione e monitoraggio del adottivi ipersensibilità ritardata nei ratti
Christine Beeton, George K. Chandy
Dipartimento di Fisiologia e Biofisica, University of California, Irvine
Esperimenti J. visualizzati, Numero 8
Qui, abbiamo modificato questo protocollo usando antigene (ovoalbumina), coniugata con Texas-Red in un rapporto 1:1 con l'antigene senza etichetta per consentire la visualizzazione di fagocitaria cellule presentanti l'antigene.
Orecchio tessuto Harvest
- Euthanize il ratto al momento desiderato-punto per le procedure descritte nel protocollo animali approvato. Qui, usiamo una dose eccessiva di anestetico, isoflurano. Questo viene fatto in un contenitore chiuso all'interno di una cappa ben ventilata. Assicurarsi che l'animale è morto da una decapitazione del aprendo la cavità toracica e tagliando il cuore.
- Utilizzando le forbici grandi rimuovere l'orecchio con un unico taglio, più vicino al corpo dell'animale possibile (Figura 1).
Figura 1. La rimozione dell'orecchio ratto - Posizionare l'orecchio in un tubo da 15 ml contenente circa 10 ml di ghiacciata 1x PBS o RPMI-1640. Mantenere i campioni di tessuto sul ghiaccio fino al momento di preparare il tessuto per l'imaging.
- L'immagine del tessuto il più presto possibile, troviamo, però, che 1 o 2 ore sul ghiaccio non ha alcun effetto distinguibile sulla motilità delle cellule nei tessuti rispetto al tessuto raccolto e ripreso immediatamente.
Preparazione dei tessuti per l'imaging
Rimozione I. strato epidermico e dermico
* Nota: Lo strato dermico profondo deve essere mantenuta intatta. Se fatto correttamente grandi vasi sanguigni rimarrà intatto e la cartilagine dell'orecchio non saranno esposti. Questa è una tecnica difficile, soprattutto quando non c'è l'infiammazione (condizioni di controllo) ed è utile usare un microscopio da dissezione.
- Luogo sia il tessuto e dei media dal tubo conico in un piatto di coltura di tessuti 10 cm.
- Con le mani guantate tenere l'orecchio ratto delicatamente sulla punta dell'orecchio (distale) con la parte dorsale del l'orecchio rivolto verso l'alto (Figura 2).
Figura 2. Pelliccia tagliare l'orecchio - Con il pollice sulla parte superiore dell'orecchio, stabile il tessuto mentre si usa la punta di chiusura Dumont # 5 forbici per separare il derma dal derma profondo. In alternativa, se il bordo del padiglione auricolare ha una sporgenza della pelle / derma profondo, questo può essere afferrato con una pinza e delicatamente tirato a separare questo dal tessuto sottostante (Figura 3).
Figura 3. La rimozione del derma superiore - Una volta che una piccola zona di pelle è stata separata dal tessuto sottostante, ripetere la procedura di separazione in alternativa usare le forbici per tagliare tra gli strati del derma e pinze per rimuovere delicatamente e rimuovere la pelle sloggiato.
- Esporre un 5 x 5 mm o maggiore superficie di tessuto orecchio che è di almeno 3 mm dal sito iniziale di iniezione antigene (Figura 4).
Figura 4. Tessuti esposti per l'imaging
II. Protezione del tessuto allo stage Imaging
- Tagliare un pezzo di plastica di copertura a una dimensione leggermente più grande rispetto al tessuto preparato.
- Stendere uno strato sottile di 3M ™ Vetbond tessuto-safe colla tutta la diapositiva.
- Afferrare l'angolo del tessuto preparato (dove non sono suscettibili di immagine), rimuovere dai media, e tamponare la parte inferiore del tessuto su carta lenti o Kym pulire per rimuovere il supporto in eccesso.
- Toccare il bordo del tessuto alla diapositiva colla coperto (le cure Vetbond immediatamente sul tessuto bagnato). Tratto delicatamente il tessuto piatto, con l'estremità opposta è l'ultimo a toccare la diapositiva (Figura 5)
Figura 5. Monte dei tessuti per fodera - Curare l'™ Vetbond invertendo il campione di tessuto / slide e immersione in un serbatoio di media in modo tale che il tessuto e far scorrere sono a faccia in giù e più o meno ad un angolo di 45 gradi. Tenendo premuto il tessuto a testa in giù in un angolo aiuta a prevenire la colla in eccesso da curare sulla superficie del tessuto esposto. Colla sulla superficie del tessuto blocca il laser (Figura 6).
Figura 6. Cure vetbond tessuto glue per immersione nei media
Nota: 2-5 passaggi possono prendere un po 'di pratica per padroneggiare. Prova pratica con pezzi di tessuto scartati o più prima di provare per la prima volta. - Tamponare una piccola quantità di grasso al silicone sul fondo della diapositiva.
- Mettere il vetrino nella camera di perfusione. Assicurarsi che il supporto perfusione è scorrevole, 37 ° C e ossigenata prima di aggiungere dei tessuti. Premere delicatamente sul bordo del vetrino fare un sigillo con il grasso al silicone tra il fondo della camera di perfusione e la polizza di copertura in plastica.
III. Due-Photon Imaging
- Utilizzando campo chiaro luce trasmessa, messa a fuoco sulla parte superiore del tessuto. Spegnere tutte le luci.
- Accendere il laser, PMT, come richiesto dal sistema multi-fotone microscopio.
- Generazione di seconda armonica (SHG) in altamente ordinato proteine fibrose (collagene e miosina) produce un segnale a metà della lunghezza d'onda del laser di eccitazione. Noi usiamo eccitazione a 900 nm, portando a SHG a 450 nm che può essere visualizzato utilizzando il canale "blu" del microscopio. SHG generazione è un non-lineare (a due fotoni) di processo, e fornisce quindi un effetto ottico "sezionare" simile a quella di eccitazione a due fotoni di fluorescenza. L'efficienza di picco di SHG si verifica quando le fibrille sono perpendicolari al laser, mentre le fibrille che corrono in parallelo non verrà visualizzato 1.
- Individuare una buona zona di imaging con abbondanza di celle, impostare l'area di tale acquisizione che la maggior parte delle cellule si trovano nel centro e iniziare imaging. Nota: Nelle reazioni DTH, le cellule T e cellule infiltrati altri si trovano spesso a concentrarsi insieme mentre altre zone sono prive di infiltrare cellule 2. Pertanto, si può richiedere un certo tempo a cercare i tessuti per trovare la zona migliore per immagine.
- Verificare la presenza di vitalità cellulare, valutando la velocità e la polarità delle cellule durante l'imaging. Utilizzare il minor potenza laser che offre una qualità dell'immagine accettabile per garantire la minima foto-danni.
- Swap in un preparato nuovo tessuto, se necessario.
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References
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