Summary
Här visar vi en metod för att framkalla och inspelning utvecklingen av en fördröjd typ överkänslighet (DTH) reaktion hos råtta örat. Detta följs av en demonstration av utarbetandet av råtta örat vävnad för två-photon avbildning av effektor / minne T-cell svar.
Abstract
Fördröjd överkänslighet (DTH) är en immunreaktion där de viktigaste spelarna är CCR7 - effektor / minne T-lymfocyter. Här visar vi en metod för att framkalla och inspelning utvecklingen av en DTH reaktion hos råtta örat. Detta följs av en demonstration av utarbetandet av råtta örat vävnad för två-photon avbildning av CCR7 - effektor / minnes-T-cells svar.
En adoptivfamilj DTH induceras av intraperitoneal injektion av GFP-märkta ägg-specifika CCR7 - effektor / minne T-cell linje (Beeton, C J. visualiseras Experiment, Utgåva 8). Cellerna är då tillåtet att balansera på råtta i 48 timmar innan utmaningen genom att injicera ett öra med koksaltlösning (kontroll örat) och den andra med en 01:01 blandning av ägg och ägg konjugerat med Texas-Röd (OVA-TR) för att visualisera av inhemska antigen-presenterande celler.
Vi beskriver en metod av vävnad förberedelse användbar för avbildning motilitet celler i djup dermal skiktet under ett immunsvar, i samband med visualisering av kollagen fibrer för sekund harmonic generation. Öron vävnad skärs i 5 x 5 mm rutor (något större är bättre) och monteras på plast täckglas med Vetbond ™, som sedan säkras med silikonfett i en avbildning kammare och superfused av syre bubblas-vävnad odlingsmedium vid 37 ° C .
Protocol
Induktion av Adoptivbarn DTH
Se JUPITER artikel: Induktion och övervakning av Adoptivföräldrar fördröjd hypersensitivitet hos råttor
Christine Beeton, George K. Chandy
Institutionen för fysiologi och biofysik, University of California, Irvine
J. visualiseras Experiment, Utgåva 8
Här har vi ändrat detta protokoll genom att använda antigen (äggalbumin) konjugerat till Texas-Röd i förhållandet 1:1 med omärkt antigen för att möjliggöra visualisering av fagocytiska antigen-presenterande celler.
Öron Tissue Harvest
- Euthanize råtta vid önskad tid-punkt genom förfaranden som beskrivs i ditt godkända djur protokollet. Här använder vi en överdos av narkos, isofluran. Detta sker i en sluten behållare inuti en väl ventilerad huva. Se till att djuret är dött antingen genom halshuggning av genom att öppna brösthålan och skär i hjärtat.
- Använda stor sax bort örat med ett enda snitt, så nära kroppen av djuret som möjligt (Figur 1).
Figur 1. Borttagning av råttan örat - Lägg örat i ett 15 ml koniskt rör som innehåller ~ 10 ml iskall 1x PBS eller RPMI-1640. Håll vävnadsprover på is tills du är redo att förbereda vävnad för avbildning.
- Bild vävnaden så snart som möjligt, finner vi dock att 1 till 2 timmar på is har inga märkbara effekter på cell motilitet i vävnaden jämfört med vävnad skördas och avbildade omedelbart.
Mjukpapper Förberedelse för bildbehandling
I. Borttagning av epidermal och dermal lager
* Obs: Den djupa dermal skiktet skall hållas intakt. Om gjort rätt stora blodkärl förblir intakt och brosket i örat kommer inte att exponeras. Detta är en svår teknik, särskilt när det inte finns någon inflammation (kontroll förhållanden) och det är bra att använda en dissekera mikroskop.
- Placera båda vävnaden och media från den koniska röret i 10 cm vävnadskultur maträtt.
- Med handskar på händerna håller råttan örat försiktigt på spetsen av örat (distala) med ryggsidan av örat uppåt (figur 2).
Figur 2. Trimma pälsen av örat - Med tummen på toppen av örat, stadiga vävnaden medan du använder spetsen på slutna Dumont # 5 saxen för att skilja dermis från den djupa dermis. Alternativt, om kanten av örat har ett överhäng av hud / djupa dermis, kan detta gripas med tång och försiktigt dras att skilja detta från vävnaden under (Figur 3).
Figur 3. Borttagning av övre dermis - När ett litet område av huden har skilts från den underliggande vävnaden, upprepa separation steg alternativt använda sax för att klippa mellan huden skikt och pincett för att försiktigt ta bort och dra av rubbas huden.
- Exponera en 5 x 5 mm eller större område av örat vävnad som är minst 3 mm från den ursprungliga platsen för antigen injektion (Figur 4).
Figur 4. Vävnad utsätts för avbildning
II. Säkra Tissue till Imaging scenen
- Skär ett plasthölje glida till en storlek något större än beredd vävnad.
- Bred ut ett tunt lager av 3M Vetbond ™ vävnad-säker lim över hela bilden.
- Ta tag i hörnet av det beredda vävnad (där du kommer sannolikt inte att bilden), ta bort från media, och badda undersidan av vävnad på objektivet papper eller Kym torka för att avlägsna överflödig media.
- Peka på kanten av vävnad för att limmet omfattas bilden (den Vetbond härdar omedelbart på våt vävnad). Försiktigt sträcka vävnaden platta, med den andra änden är de sista att röra vid bilden (Figur 5)
Figur 5. Montera vävnad för att täcka halka - Bota Vetbond ™ genom att vända vävnadsprovet / bild och doppa den i en reservoar av media så att vävnaden och skjut är nedåt och ungefär i 45 graders vinkel. Håll vävnaden upp och ner i en vinkel hjälper till att förhindra överflödigt lim från härdning på den exponerade vävnaden ytan. Lim på ytan av vävnad kommer att blockera laser (Figur 6).
Figur 6. Cure vetbond vävnad glue genom att doppa i media
Observera: steg 2-5 kan ta lite övning att behärska. Försök öva med kasseras eller extra vävnad bitar innan du försöker för första gången. - Doppa en liten mängd silikonfett på botten av bilden.
- Placera bilden i perfusion kammaren. Se till att perfusionen media flödar, 37 ° C och syresätts innan du lägger vävnad. Tryck försiktigt ned kanterna på bilden gör en tätning med silikon fett mellan botten av perfusion kammaren och plastskyddet halka.
III. Två-Photon Imaging
- Använda ljusa fält genomlysning, fokus på toppen av vävnad. Stäng av alla lampor.
- Sätt på lasern, PMTs som krävs av din multi-photon mikroskop system.
- Andra harmonic generation (SHG) i högt beställt fibrösa proteiner (kollagen och myosin) producerar en signal vid halv våglängd av excitation laser. Vi använder excitation vid 900 nm, vilket leder till SHG vid 450 nm som kan visualiseras med hjälp av "blå"-kanal i mikroskop. SHG generation är en icke-linjär (två-photon), och därmed ger en optisk "snittning" effekt liknande den i två-photon excitation av fluorescens. Den högsta effektiviteten i SHG-uppstår när fibriller är vinkelräta mot lasern medan fibriller som löper parallellt inte kommer att visualiseras. 1
- Hitta en bra avbildning område med massor av celler, ange din förvärvet område så att majoriteten av cellerna är i centrum och börja avbildning. Obs: I DTH reaktioner, är T-celler och andra infiltrerar cell ofta visat sig vara koncentrerade tillsammans medan andra områden saknar infiltrera celler 2. Därför kan det ta lite tid att söka på vävnad för att hitta den bästa området till bild.
- Kontrollera om cellviabiliteten genom att bedöma cell hastighet och polaritet under avbildning. Använd lägsta lasereffekten som ger acceptabel bildkvalitet för att säkerställa minimal foto-skador.
- Byt i en ny vävnad förberedelser som behövs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
References
- Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
- Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
- Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
- Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. , In Press (2008).
