Präsynaptisch Stille Synapsen mit Lichtmikroskopie Studium

Einige präsynaptische Endverschlüsse im Zentralnervensystem scheinen nicht funktionsfähig oder stumm zu sein. Hier stellen wir ein Protokoll zur Identifizierung stiller präsynaptischer Terminals vor. Dieses Protokoll kann angewendet werden, um Behandlungen und Manipulationen zu identifizieren, die im Verdacht stehen, Endterminals zum Schweigen zu bringen oder zu wecken.

Das Protokoll kombiniert die vitale Farbstoffmarkierung von synaptischen Vesikeln während der neuronalen Depolarisation mit der anschließenden Markierung fixierter Zellen mit einem Antikörper, der alle präsynaptischen Terminals, sowohl stille als auch aktive, markiert. Synapse. Mit Farbstoff markiertes Co und Antikörper sind aktiv. Synapsen, die nur durch Antikörper markiert sind, sind stumm.

Hallo, ich bin Amanda Taylor aus dem Labor von Dr. Steve Minick in der Abteilung für Psychiatrie an der Washington University School of Medicine. Ich bin Shahin auch vom Manic Lab. Heute möchten wir Ihnen Ihr Verfahren zur Visualisierung stiller präsynaptischer Terminals mit Hilfe von kultivierten Hippocampus-Neuronen vorstellen.

Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um zu untersuchen, wie die elektrische Aktivität und die anderen einzelnen Signalwege die Neurotransmitterfreisetzung modulieren. Also lasst uns loslegen. In einer sterilen Laminar-Flow-Haube können Sie HIPA nicht von postnatalen Ratten oder Mäusen bis zu drei Ratten oder Mäusen kaufen, um dissoziierte Zellkulturen vorzubereiten.

Gemäß unserem veröffentlichten Protokoll handelt es sich bei unseren Kulturen um gemischte Gliakulturen, die aus denselben Dissektionszellen gewonnen werden, sollten in sterilen 35-Millimeter-Schalen plattiert werden. Jedes enthielt ein Deckglas mit der Nummer Null, das mit fünf Milligramm pro Milliliter Kollagenplatte beschichtet wurde. Die Neuronen haben eine ungefähre Dichte von 500 Zellen pro Quadratzentimeter.

12 Rattenbabys ergeben in der Regel 30 bis 35 Millimeter große Schalen. Lassen Sie die Kulturen 10 bis 14 Tage in einem Kulturbrutkasten wachsen. Für die synaptische Entwicklung und Reifung fügen Sie das Antimitotikum a C hinzu, um das Gliawachstum am Tag in vitro vier zu stoppen.

Führen Sie auch am Tag in vitro fünf einen halben Mediumaustausch mit neuronalem Basalmedium plus B 27-Supplement durch, um das neuronale Überleben während dieser Reifezeit zu verbessern. Führen Sie Behandlungen ein, die die Anzahl der präsynaptisch stummen Synapsen verändern. Wir finden, dass eine bequeme Möglichkeit, einen großen Prozentsatz der Glutamat-Synapsen zum Schweigen zu bringen, eine vierstündige Behandlung mit 30 Millimolar Kalium ist.

Wenn die Kulturen reif sind, sollten die Neuronen eine relativ geringe Dichte mit gut getrennten und ausgedehnten neurotischen Prozessen aufweisen. Nehmen Sie die Kulturen aus dem Inkubator und bringen Sie sie auf die Laborbank. Das Nährmedium wird durch eine gepufferte Kochsalzlösung ersetzt, die 45 millimolare Kaliumchlorid und 10 mikromolare FM 1 43 FX-Chips enthält.

Diese Lösung sollte auch NBQX und A PV enthalten, um wiederkehrende Signale zu verhindern. Es ist wichtig, dass die FM 1 43 FX Stammlösung und die Experimente im Dunkeln aufbewahrt werden, um Photobleaching zu verhindern. Decken Sie also die Kulturschalen für alle nachfolgenden Inkubationsschritte mit Folie ab.

Genau zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Entfernen Sie die Farbstofflösung und waschen Sie sie nur drei bis fünf Sekunden lang in gepufferter Kochsalzlösung mit 500 Mikromolen Adversivum. Sieben. Um unspezifische Farbstoffe zu entfernen, ist das Timing in diesem Schritt von entscheidender Bedeutung.

Da eine längere Exposition gegenüber adv nachteiligem F seven die gesamte FM 43 FX-Markierung entfernt. Waschen Sie dann die Zellen und häufen Sie gepufferte Kochsalzlösung ohne Nachteile. Sieben für fünf Zwei-Minuten-Intervalle in einem chemischen Abzug.

Fixieren Sie die Kulturen 10 Minuten lang in 4 % Paraldehyd und 0,2 % Glutaraldehyd in PBS. Waschen Sie die Zellen kurz mit PBS. Die Zellen können nun aus dem Abzug herausgefahren werden.

Fügen Sie eine Blockierungslösung hinzu, die 4 % normales Ziegenserum und 0,04 % Tritton X enthält, um den Hintergrund zu reduzieren und die Zellen für die Immunfärbung zu permieren. 15 Minuten inkubieren. Färben Sie die Zellen mit vlu T one Antikörper, verdünnt auf eins bis 2000 in Blockierungslösung.

Inkubieren Sie die Kulturen drei Stunden lang in Antikörpern unter leichtem Schaukeln. Waschen Sie die Zellen viermal mit PBS. Inkubieren Sie die Zellen mit Alexa.

6 47 konjugierte Anti-Meerschweinchen-Antikörper, verdünnt auf eins bis 500 in Blockierungslösung. Bewahren Sie die Kulturen 30 Minuten lang unter leichtem Schaukeln im Sekundärantikörper auf. Waschen Sie die Zellen noch viermal mit PBS.

Geben Sie einen kleinen Tropfen Bodenmenge mit einer Pinzette auf einen sauberen Objektträger. Nehmen Sie einen Abdeckzettel und senken Sie ihn vorsichtig auf den Tropfen der Bodenzellen, der der Folie zugewandt sind. Lassen Sie die Folie über Nacht trocknen.

Bereiten Sie ein 60-fach-Ölobjektiv an einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop vor. Legen Sie eine Folie so auf den Tisch, dass das Deckglas zum Ziel zeigt. Finde ein Feld von Neuriten, das nicht übermäßig dicht ist und das sich außerhalb des Somas befindet, das den restlichen Farbstoff zurückhalten kann.

Zoomen Sie auf eine Feldgröße von 51 x 51 Mikrometern. Verwendung von Bilderfassungssoftware. Erfassen Sie einen ZS-Stack, der eine Tiefe von 7,8 Mikrometern über 27 Schritte von 0,3 Mikrometern für jeden Schritt abdeckt.

Scannen Sie zuerst nach dem VLU T 1-Antikörper, um alle glutamatergen Synapsen im Feld zu identifizieren. Scannen Sie dann erneut nach FM 1 43 FX Fluoreszenz, um die Bilder nach der Aufnahme zu analysieren. Verwenden Sie eine Analysesoftware, um die Z-Heftung in ein zusammengesetztes Einzelebenenbild umzuwandeln, das auf der maximalen Intensität einer beliebigen Ebene bei jedem eingestellten Pixelschwellenwert basiert.

Um den Hintergrund zu reduzieren, sind die Klemmen von VG glu T one ohne Bezug auf die Effektbeize FM 1 43 zu kennzeichnen. Und markieren Sie diese Punkte als interessante Regionen. In der Regel wählen wir 10 PUNTA pro Feld aus.

Wiederholen Sie die Auswahl von Schwellenwerten und Punkten auf dem Effektbild von FM 1 43 und überlagern Sie die Bilder, um stumme Synapsen zu identifizieren. Ein absolutes Pixelkriterium oder ein prozentuales Pixelkriterium kann verwendet werden, um aktive FM 1 43 positive von inaktiven FM 1 43 negativen Synapsen zu unterscheiden. In unseren Kulturen stellen wir fest, dass 70 bis 80 % der Glutamatsynapsen, die durch eine V-Schwemm-Eins-Färbung definiert sind, eine nachweisbare FM 1 43-Färbung in überlagerten Bildern von grüner FM 1 43-Fluoreszenz und roter V-Schwemm-Eins-Färbung aufweisen.

Dies zeigt sich in einer Fülle von gelben puncta-Synapsen mit co-lokalisierten Markern. Diese sind durch die Pfeile gekennzeichnet. Etwa 20 bis 30 % des roten V glut one positive Punktzahl weisen keine grüne FM 1 43 Fluoreszenz über dem Ausgangswert auf.

Dies sind die inaktiven präsynaptischen Terminals, und ein Beispiel ist durch die Pfeilspitze gekennzeichnet. Eine dritte Population von Synapsen wird ebenfalls beobachtet. Diese sind positiv für die grüne FM 1 43-Fluoreszenz, aber frei von roter B-Schwemm-Eins-Färbung.

Dabei handelt es sich um aktive GABAerge Synapsen, und ein Beispiel ist durch das Sternchen gekennzeichnet. Diese sind von den meisten unserer Analysen ausgeschlossen, können aber explizit mit einem vesikulären GABA-Transporter-Antikörper untersucht werden. Anstelle des VLU T one Antikörpers haben wir Ihnen gerade gezeigt, wie Sie präsynaptisch stumme Synapsen mit Hilfe von FM 1 43 und VLU one Immunfärbung sichtbar machen können.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist zu beachten, dass FM 1 43 FX sowohl auf die Zeit im Adver sub seven-Waschgang als auch auf die Konzentration des in der Blockierungslösung enthaltenen behandelnden X 100 empfindlich reagiert. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.