Therapie, die Tests in einem Sphäroid-basierten 3D Kultur Zellmodell für Kopf und Hals Squamous Zelle Krebsgeschwür

Das übergeordnete Ziel dieser in vitro Methode ist es, die dreidimensionalen Zellkultur-Sphäroide zu generieren, die die Überprüfung aktueller Standard- oder experimenteller Therapieschemata für Plattenepithelkarzinome im Kopf- und Halsbereich ermöglichen. Diese Methode hilft uns, das dreidimensionale Tumorwachstum von Kopf- und Halskrebszellen zu verstehen, wenn sie einer Bestrahlung oder Chemotherapie ausgesetzt sind. Es bleibt festzuhalten, dass der Umgang mit Primärtumorzellen schwierig ist und nicht immer zu einer zuverlässigen dreidimensionalen Sphäroidbildung führt.

Verfahren wird von Sabina Schwenk-Zieger, einer Technikerin aus unserem Labor, vorgeführt. Legen Sie bei der Verwendung von Primärzellen aus einer Tumorprobe die Probe auf eine geeignete und sterile Oberfläche und schneiden Sie sie mit einem sterilen Einwegskalpell gründlich in sehr kleine Stücke. Nach ausreichender mechanischer Trennung des Primärgewebes wird es in ein Fläschchen mit Kollagenase 1 und 2 überführt und eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubiert.

Anschließend die Mischung durch ein 70-Mikrometer-Falcon-Zellsieb sieben und die Suspension mit HBSS waschen. Nach erfolgreicher Trennung und anschließendem Waschen wird die Suspension mit ein bis zwei Millionen Zellen in einen T75-Zellkulturkolben überführt, um bis zu zehn Tage lang bei 37 Grad Celsius bis zur Subkonfluenz zu wachsen. Bestätigen Sie unter dem Mikroskop das Wachstum der Tumorzellen.

Zählen Sie die Zellen in Kultur. Unter Verwendung einer 96-Well-Platte mit extrem geringer Adhäsion und konkaven runden Böden werden 5.000 Primärtumorzellen oder 1.000 bis 2.000 Zellen einer intermediären Zelllinie in 200 bis 300 Mikrolitern Medium in die Vertiefungen eingesät. Als nächstes kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius.

Führen Sie alle zwei Tage Medienwechsel durch. Achten Sie darauf, das Sphäroid beim Medienwechsel nicht mit der Pipette abzusaugen. Kultivieren Sie die Sphäroide, bis die dreidimensionalen sphäroidförmigen Zellkonglomerate beobachtet werden.

Denken Sie daran, die Vertiefungen mit unregelmäßiger oder mehrfacher Sphäroidbildung von der weiteren Untersuchung auszuschließen. Wechseln Sie anschließend das Medium auf Medien mit Chemotherapeutika und/oder monoklonalen Antikörpern in den gewünschten Konzentrationen. Fügen Sie Cisplatin in Konzentrationen von 2,5, fünf oder 10 Mikromolaren oder 5-Fluorouracil in 30 Mikromolaren hinzu.

Messen Sie bei diesem Verfahren die Sphäroidgröße nach der digitalen Fotodokumentation an Tag sechs, Tag 10 und Tag 16 mit einer Grafiksoftware. Nach dem Zentrifugieren der Platte bei 520 g für 2,5 Minuten wird der Überstand entfernt. Als nächstes waschen Sie die Zellen mit 1x PBS und zentrifugieren die Platte erneut, gefolgt von der Entfernung des Überstands.

Geben Sie anschließend 100 Mikroliter enzymatische Zellablösungslösung in jedes Fläschchen, damit sich die Sphäroide auflösen können. Anschließend inkubieren Sie die Platte acht Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Überprüfen Sie, ob sich die Sphäroide unter dem Mikroskop erfolgreich aufgelöst haben.

Fügen Sie 100 Mikroliter DMEM hinzu. Als nächstes zentrifugieren Sie die Platte bei 520 g für 2,5 Minuten. Entfernen Sie dann den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern DMEM.

Führen Sie anschließend, falls erforderlich, einen kommerziell erhältlichen kolorimetrischen Proliferationsassay durch und lesen Sie den Assay in einem ELISA-Reader aus. Alle Zelllinien konnten zuverlässige Sphäroide mit Unterschieden in Größe und Zeitpunkt der Auslesung erzeugen. Primärzellen bildeten reproduzierbare Sphäroide in extrem niedrigen Anheftungsplatten.

Die Ki-67-Färbung zeigt, dass die Peripherie der Kultur viel höhere Proliferationsraten aufweist als zentrale Zellen, was die Nährstoffverteilung in soliden Schleimhauttumoren nachahmt, die oft nekrotische Kerne aufweisen. Hier zeigt sich die Wirkung verschiedener Chemotherapeutika und Bestrahlung auf die Sphäroidgröße. Die Bestrahlung mit zwei Grautönen vor der Behandlung mit Cisplatin führte zu einer signifikanten Abnahme der Sphäroidgröße im Vergleich zu Cisplatin allein.

Mit der weiteren Etablierung der Erzeugung von Sphäroiden aus primären menschlichen Zellen könnte auf diese Weise das Konzept der Therapieerprobung umgesetzt werden. Sphäroide würden nach einer Tumorbiopsie erzeugt und dann auf molekulare Eigenschaften und Therapieanfälligkeit getestet. Wir waren in der Lage, ein Protokoll zur Generierung reproduzierbarer Sphäroide aus Zellsuspensionen sowohl für Zelllinien als auch für primäre humane Tumorzellen zu etablieren.

Dieser multimodale Assay ist empfindlich genug, um kleine Unterschiede zwischen den Gruppen zu erkennen. In Zukunft könnte der Assay verwendet werden, um zunächst das individuelle Ansprechen auf Standard- und experimentelle Therapieprotokolle zu beurteilen. Zweitens, weitere Charakterisierung der Tumorzellen aus frischen Proben.

Und drittens, korrelieren Sie das Ansprechen auf die Therapie mit molekularen Mustern. Die Verwendung von Primärzellen und die Erzeugung von Sphäroiden würde es ermöglichen, möglichst viele Merkmale des in vivo Tumorwachstums in Kombination mit einem kosteneffizienten Assay zur Untersuchung des individuellen Therapieansprechens zu erhalten.