Encyclopedia of Experiments: Biology
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- Beginnen Sie mit der Zugabe von E3 mittel- bis niedrig Schmelzpunkt Agarose und Erhitzung, bis die Agarose vollständig aufgelöst. Kühlen Sie die Agarose auf 37 Grad Celsius und fügen Sie Tricain-Lösung. Als nächstes anästhesieren Sie die Embryonen durch Zugabe von Tricain zu einer Petrischale mit Embryonen in E3 Medium. Wirbeln Sie die Petrischale, um die Embryonen in der Mitte zu sammeln.
Mit einer Transferpipette, ziehen Sie einen Embryo mit einer minimalen Menge an Medium. Halten Sie die Pipette in einer aufrechten Position und hüpfen Sie den Embryo, um es an der Spitze der Pipette zu positionieren. Nun legen Sie den Embryo in die Agarose-Lösung, ohne überschüssiges Medium hinzuzufügen, das die Agarose verdünnen und das Gelieren verhindern würde. Mischen Sie den Embryo vorsichtig innerhalb der Agarose und übertragen Sie die Lösung in den Brunnen einer Bildplatte mit der Pipette.
Legen Sie die Platte unter ein Mikroskop und verwenden Sie eine Pipettenspitze, um den Embryo in der gewünschten Ausrichtung zu positionieren. Sobald sich die Agarose verfestigt, gießen Sie E3-Medium mit Tricain darauf, um den Agar hydratisiert zu halten und den Embryo abzubilden. In einem Beispielprotokoll werden wir parabiotische Zebrafisch-Embryonen zur Bildgebung und Analyse montieren.
Um Bilder der geschmolzenen Embryonen zu erfassen, bereiten Sie 0,8% niedrige Schmelzpunkt-Agarose vor. Während noch heiß, aliquot einen Milliliter der Agarose in 1,5 Milliliter Mikrofuge Rohre in einem 37 Grad Celsius Heizblock gesetzt. Anästhesisieren Sie die parabiotischen Embryonen durch Zugabe von 1 Milliliter 4 Milligramm pro Milliliter pH 7,0 Tricain zu den 25 Milliliter E3 Medium enthalten die Embryonen. Sanft wirbeln die Schale, so dass die Embryonen Pool in der Mitte.
Dann mit einer breitspitzenKunststoff-Transferpipette, Als nächstes drehen Sie die Pipette aufrecht und hüpfen Sie die Embryonen sanft, so dass sie sich bis zum Boden der Pipette absetzen. Übertragen Sie die Embryonen dann auf einen 1 Milliliter Aliquot niedriger Schmelzpunkt Agarose, indem Sie die Pipettespitze leicht auf der Oberfläche der Agarose berühren. Entsorgen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Pipette und verwenden Sie die Pipette, um die Embryonen vorsichtig zu mischen.
Dann, mit der Pipette, übertragen Sie die Agarose und die Embryonen auf den Brunnen einer Glasboden-Sechs-Brunnen-Platte. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop eine am Ende einer Neckischnadel befestigte Gel-Ladespitze, um die Embryonen in der Nähe des Deckglases und in der gewünschten Ausrichtung für die Bildgebung zu positionieren.
Verwenden Sie für ein ganzes Embryo-Sichtfeld ein 4x subjektives. Verwenden Sie ein 20-faches Objektiv, um ein bestimmtes Gewebe abzubilden. Verarbeiten Sie die Bilder gemäß dem Textprotokoll.
