Agar-Einbettung: Eine grundlegende Methode zur Einbettung lebender Zebrafisch-Embryonen für die Langzeitbildgebung

- Beginnen Sie mit der Zugabe von E3 Agarose bei mittlerem bis niedrigem Schmelzpunkt und erhitzen Sie, bis sich die Agarose vollständig aufgelöst hat. Die Agarose auf 37 Grad Celsius abkühlen lassen und Tricainlösung hinzufügen. Als nächstes betäuben Sie die Embryonen, indem Sie Tricain in eine Petrischale mit Embryonen im E3-Medium geben. Schwenken Sie die Petrischale, um die Embryonen in der Mitte zu sammeln.

Entnehmen Sie mit einer Transferpipette einen Embryo mit einer minimalen Menge Medium. Halten Sie die Pipette in einer aufrechten Position und lassen Sie den Embryo wippen, um ihn an der Spitze der Pipette zu positionieren. Legen Sie nun den Embryo in die Agaroselösung, ohne überschüssiges Medium hinzuzufügen, das die Agarose verdünnen und eine Gelierung verhindern würde. Mischen Sie den Embryo vorsichtig mit der Agarose und geben Sie die Lösung mit der Pipette in die Vertiefung einer Speicherfolie.

Legen Sie die Platte unter ein Mikroskop und positionieren Sie den Embryo mit einer Pipettenspitze in der gewünschten Ausrichtung. Sobald die Agarose erstarrt ist, gießen Sie E3-Medium, das Tricain enthält, darüber, um den Agar hydratisiert zu halten und den Embryo abzubilden. In einem Beispielprotokoll werden wir parabiotische Zebrafischembryonen für die Bildgebung und Analyse einbinden.

Um Bilder der fusionierten Embryonen aufzunehmen, bereiten Sie 0,8 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt vor. Noch heiß aliquotieren Sie einen Milliliter der Agarose in 1,5-Milliliter-Mikrofuge-Röhrchen, die in einem 37 Grad Celsius heißen Heizblock angeordnet sind. Betäuben Sie die parabiotischen Embryonen, indem Sie 1 Milliliter von 4 Milligramm pro Milliliter pH 7,0 Tricain zu den 25 Millilitern E3-Medium, das die Embryonen enthält, hinzufügen. Schwenken Sie die Schale vorsichtig, so dass sich die Embryonen in der Mitte sammeln.

Ziehen Sie dann mit einer Kunststoff-Transferpipette mit breiter Spitze die Embryonen in so wenig Flüssigkeit wie möglich auf. Drehen Sie dann die Pipette aufrecht und lassen Sie die Embryonen vorsichtig hüpfen, so dass sie sich ganz unten in der Pipette absetzen. Übertragen Sie dann die Embryonen auf ein 1 Milliliter Aliquot mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose, indem Sie die Pipettenspitze leicht auf der Oberfläche der Agarose berühren. Entsorgen Sie überschüssige Flüssigkeit aus der Pipette und mischen Sie die Embryonen vorsichtig mit der Pipette in die Agarose.

Übertragen Sie dann mit der Pipette die Agarose und die Embryonen in die Vertiefung einer Sechs-Well-Platte mit Glasboden. Verwenden Sie unter einem Stereomikroskop eine Gelladespitze, die am Ende einer Nadel befestigt ist, um die Embryonen nahe am Deckglas und in der gewünschten Ausrichtung für die Bildgebung zu positionieren. Nachdem die Agarose ausgehärtet ist und das Medium mit Tricain in die Vertiefungen gegeben wurde, verwenden Sie ein konfokales Weitfeld-Epifluoreszenz-Laserscanning-Mikroskop oder ein konfokales Spinning-Disk-Mikroskop, um Bilder aufzunehmen.

Verwenden Sie für ein Sichtfeld des gesamten Embryos eine 4x subjektive. Verwenden Sie ein 20-fach-Objektiv, um ein bestimmtes Gewebe abzubilden. Verarbeiten Sie die Bilder gemäß dem Textprotokoll.