Encyclopedia of Experiments: Biology
Ein Abonnement für JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt ansehen zu können. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- E3 orta ila düşük erime noktası agarose ekleyerek başlayın ve agarose tamamen çözünene kadar ısıtın. Agarose'u 37 santigrat dereceye kadar soğutun ve trikain çözeltisi ekleyin. Sonra, E3 ortamında embriyo içeren bir Petri kabına trikain ekleyerek embriyoları uyuşturun.
Bir transfer pipeti kullanarak, minimum miktarda ortama sahip bir embriyo çizin. Pipeti dik pozisyonda tutun ve embriyoyu pipetin ucuna konumlandırmak için zıplatın. Şimdi embriyoyu agarozu seyreltecek ve jelleşmeyi önleyecek fazla bir ortam eklemeden agarose çözeltisine yerleştirin.
Plakayı bir mikroskop altına yerleştirin ve embriyoyu istenen yönde konumlandırmak için bir pipet ucu kullanın. Agarose katılaştıktan sonra, agarı nemli tutmak ve embriyoyu görüntülemek için üzerine trikain içeren E3 ortamı dökün. Örnek bir protokolde, görüntüleme ve analiz için parabiyotik zebra balığı embriyoları monte edeceğiz.
Kaynaşmış embriyoların görüntülerini elde etmek için% 0.8 düşük erime noktası agarose hazırlayın. Hala sıcakken, agarozun bir mililitresini 37 santigrat derecelik bir ısıtma bloğunda ayarlanan 1.5 mililitre mikrofuge tüplerine ayırın. Embriyoları içeren 25 mililitrelik E3 ortamına mililitre başına 1 mililitre 4 miligram pH 7.0 trikain ekleyerek parabiyotik embriyoları uyuşturun.
Daha sonra geniş uçlu plastik transfer pipeti kullanarak, embriyoları mümkün olduğunca az sıvıya çekin. Sonra, pipeti dik çevirin ve embriyoları pipetin en altına yerleşecek şekilde hafifçe zıplatın. Daha sonra agarozun yüzeyindeki pipet ucuna hafifçe dokunarak embriyoları 1 mililitrelik düşük erime noktası agarose aliquot'una aktarın. Pipetteki fazla sıvıyı atın ve embriyoları agaroseda hafifçe karıştırmak için pipeti kullanın.
Daha sonra pipetle, agarose ve embriyoları bir cam alt altı kuyu plakasının kuyusuna aktarın. Stereo mikroskop altında, embriyoları kapak camına yakın ve görüntüleme için istenen yönde konumlandırmak için bir alay iğnesinin ucuna sabitlenmiş bir jel yükleme ucu kullanın. Agarose kuyulara trikain ile ayarlandıktan ve orta eklendikten sonra, görüntüleri elde etmek için ters geniş alan epifluoresans lazer tarama konfokal veya dönen disk konfokal mikroskobu kullanın.
Tüm embriyo görüş alanı için, 4x öznel kullanın. Belirli bir dokuyu görüntülemek için 20x hedefi kullanın.
