Encyclopedia of Experiments: Biology
Ein Abonnement für JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt ansehen zu können. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
- התחל על ידי הוספת E3 בינוני עד נמוך נקודת התכה agarose וחימום עד agarose מתמוסס לחלוטין.
באמצעות פיפטה העברה, לצייר עובר אחד עם כמות מינימלית של מדיום. להחזיק את פיפטה במצב זקוף להקפיץ את העובר למקם אותו בקצה פיפטה. עכשיו למקם את העובר בתמיסת agarose מבלי להוסיף כל מדיום עודף, אשר לדלל את agarose ולמנוע gelling. בעדינות לערבב את העובר בתוך agarose ולהעביר את הפתרון לתוך הבאר של צלחת הדמיה באמצעות פיפטה.
מניחים את הצלחת מתחת למיקרוסקופ ומשתמשים בקצה פיפטה כדי למקם את העובר בכיוון הרצוי. ברגע שהאגרוז מתמצק, יוצקים עליו מדיום E3 המכיל טריקאין כדי לשמור על האגר hydrated ולדמות את העובר. בפרוטוקול לדוגמה, נטען עוברי זברה פרוביוטיים להדמיה וניתוח.
כדי לרכוש תמונות של העוברים התמזגו, להכין 0.8% נקודת התכה נמוכה התעוררה. בעוד עדיין חם, aliquot מיליליטר אחד של agarose לתוך 1.5 מיליליטר צינורות microfuge להגדיר בלוק חימום 37 מעלות צלזיוס. הרדמה את העוברים הפרביוטיים על ידי הוספת 1 מיליליטר של 4 מיליגרם למיליליטר pH 7.0 tricaine ל 25 מיליליטר של מדיום E3 המכיל את העוברים.
ואז באמצעות פיפטה העברת פלסטיק רחבת קצה, לצייר את העוברים בנוזל קטן ככל האפשר. הבא, להפוך את פיפטה זקוף בעדינות להקפיץ את העוברים, כך שהם להתיישב לתחתית פיפטה.
לאחר מכן, עם פיפטה, להעביר את agarose ועוברים לבאר של צלחת שש באר תחתית זכוכית. תחת מיקרוסקופ סטריאו, השתמש בקצה טעינת ג'ל קבוע לסוף מחט מתגרה כדי למקם את העוברים קרוב לזכוכית הכיסוי ובכיוון הרצוי להדמיה. לאחר agarose יש להגדיר ובינוני עם tricaine התווסף לבארות, להשתמש במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי הפוך רחב שדה לייזר סריקה confocal או ספינינג דיסק confocal כדי לרכוש תמונות.
עבור שדה עובר שלם של תצוגה, השתמש ב- 4x סובייקטיבי.
