Name: Ein Reverse Genetic Ansatz zur funktionellen Redundanz während der Embryogenese-Test (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-11T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Erfahren Sie, wie funktionale Redundanz von Genen während der Embryogenese in Danio rerio untersucht wird. Diese Methode nutzt Morpholino-Injektionen und Reporter-Linien zur Quantifizierung von Zelllinien-Spezifikation.

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Wir danken Mitglieder der Evans-Labor für ihre Hilfe bei der Vorbereitung dieser Präsentation. Die hier verwendeten Morpholinos wurden ursprünglich von Dr. Audrey Holtzinger validiert. TE wird durch Zuschüsse aus dem National Institutes of Health (HL064282 und HL056182) unterstützt. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch das Institute for Animal Care und Verwenden eingesetzten Ausschusses, des Weill Cornell Medical College durchgeführt.

<ol><li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6, 69-77 (2009).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata5+and+Gata6+are+functionally+redundant+in+zebrafish+for+specification+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gata5 and Gata6 are functionally redundant in zebrafish for specification of cardiomyocytes.</a> Dev Biol. 312, 613-622 (2007).</li>
<li>Peterkin, T., Gibson, A., Patient, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redundancy+and+evolution+of+GATA+factor+requirements+in+development+of+the+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Redundancy and evolution of GATA factor requirements in development of the myocardium.</a> Dev Biol. 311, 623-635 (2007).</li>
<li>Holtzinger, A., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gata4+regulates+the+formation+of+multiple+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Gata4 regulates the formation of multiple organs.</a> Development. 132, 4005-4014 (2005).</li>
<li>Sorrentino, R. P., Gajewski, K. M., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATA+factors+in+Drosophila+heart+and+blood+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">GATA factors in Drosophila heart and blood cell development.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 107-116 (2005).</li>
</ol>

In dem hier beschriebenen Experiment, kombiniert man zwei Morpholinos, von denen jeder allein erzeugen eine deutliche Reihe von Phänotypen, und fand eine ganz andere Phänotyp, wenn sie co-injiziert zusammen. Natürlich benötigten wir eine Rechtfertigung dafür dieses Experiment in den ersten Platz. Wir vermuteten, dass die beiden Gene könnten sich gegenseitig für eine frühere Funktion zu kompensieren, in diesem Fall kardiale Spezifikation. Dies liegt daran, die Gene sehr verwandt sind (und in der Lage die Bindung an den g...

<table><tbody><tr><td>Zuchtbehälter und Trennwände für Fische</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fischernetze</td><td>Aquatic Habitats</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Systemwasser</td><td></td><td></td><td>60 mg Instant Ocean&amp;#8221; pro Liter dH2O</td></tr><tr><td>100-mm-Petri-Schalen</td><td>BD Biosciences</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetten-Nadelzieher</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97 Flaming/Brown</td><td></td></tr><tr><td>3,5&quot; Glas-Kapillaren</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklinge</td><td>Personna Medical Care</td><td>94-120-71</td><td></td></tr><tr><td>Mikroschleifer</td><td>Narishige International</td><td>EG-4</td><td></td></tr><tr><td>Skaliertes Mikroskopokular</td><td>Premiere</td><td>MF-02</td><td></td></tr><tr><td>Mikrometer</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>15510-027</td><td></td></tr><tr><td>Spatel</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>Waage</td><td>Mettler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Wägebehälter</td><td>Fisher Scientific</td><td>2-202-B</td><td></td></tr><tr><td>Konventionelle Mikrowelle</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben</td><td>Corning</td><td>4980</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopobjektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-552</td><td></td></tr><tr><td>Messzylinder</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6D</td><td></td></tr><tr><td>Manuelle Pipettierhilfe</td><td>BrandTech</td><td>2026333</td><td></td></tr><tr><td>70 % Ethanol-Waschlösung</td><td>Tarr</td><td>801VWR</td><td></td></tr><tr><td>N2-Flasche</td><td>Tech Air</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI-100</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Micro Instruments</td><td>LTD</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American National Can</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Corporation</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gata5&lt;/em&gt;-Spleißstelle-Morpholino</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-TCTTAAGATTTTTACCTATACTGGA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>gata5-ATG-Blocker</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AAGATAAAGCCAGGCTCGAATACAT-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;gata6&lt;/em&gt;-langer Isoform-ATG-Blocker</td><td>Genetools, LLC</td><td></td><td>5&amp;rsquo;-AGCTGTTATCACCCAGGTCCATCCA-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>Einweg-Pasteur-Pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Tricainmethansulfonat</td><td>Argent Labs</td><td>MS-222</td><td></td></tr><tr><td>Methylcellulose</td><td>ICN Biomedicals</td><td>155495</td><td></td></tr><tr><td>Heizblock</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-718-4</td><td></td></tr><tr><td>Scharfe Pinzette</td><td>Dumont</td><td></td><td>Größe 55</td></tr><tr><td>Vertiefte Mikroskoppräparate</td><td>VWR international</td><td>48339-009</td><td></td></tr></tbody></table>

ein reverse genetic ansatz zur funktionellen redundanz während der embryogenese-test

A Reverse Genetic Approach to Test Functional Redundancy During Embryogenesis

Gene-Funktion während der Embryogenese wird typischerweise durch loss-of-function Experimente definiert, zum Beispiel durch gezielte Mutagenese (KO) in der Maus. In der Zebrafisch-Modell, über wirksame reverse genetische Techniken entwickelt, mit Mikroinjektion von Gen-spezifischen Antisense Morpholinos. Morpholinos Ziel einer mRNA durch spezifische Basenpaarung und Block Genfunktion vorübergehend durch die Hemmung der Translation oder Spleißen für mehrere Tage während der Embryogenese (Zuschlag). Doch bei Wirbeltieren wie Maus oder Zebrafisch, können einige Funktionen von Genen durch diese Ansätze durch die Anwesenheit eines anderen Gens, das für den Verlust entschädigt verdeckt werden. Dies gilt insbesondere für die Gen-Familien, die Schwester Gene, die in der gleichen entwickelnde Gewebe co-exprimiert. In Zebrafisch können funktionelle Kompensation in einem relativ hohen Durchsatz Weise getestet werden, durch Co-Injektion von Morpholinos dieses Ziel Knockdown von beiden Genen gleichzeitig. Ebenso mit Morpholinos, kann eine genetische Interaktion zwischen zwei Genen, die durch Knockdown beider Gene demonstriert zusammen mit sub-Schwellenwerte. Zum Beispiel kann Morpholinos titriert, so dass weder einzelne Knockdown einen Phänotyp erzeugt werden. Wenn unter diesen Bedingungen, Ursachen Co-Injektion von sowohl Morpholinos einem Phänotyp, ist eine genetische Interaktion gezeigt. Hier zeigen wir, wie man funktionale Redundanz im Rahmen von zwei verwandten GATA-Transkriptionsfaktoren zeigen. GATA Faktoren sind für die Spezifikation von kardialen Vorläuferzellen notwendig, aber dies ist nur durch den Verlust der beiden Gata5 und Gata6 enthüllt. Wir zeigen, wie die Durchführung Mikroinjektion Experimente bestätigen die Morpholinos, und bewerten die ausgeglichen Phänotyp für Kardiogenese.

Gene-Funktion kann in loss-of-function Experimente verdeckt werden, wenn es eine Kompensation durch ein anderes Gen. Der Zebrafisch-Modell bietet eine relativ hohem Durchsatz, um eine solche funktionelle Redundanz in lebenden Embryonen zu offenbaren.

Ein Reverse Genetic Ansatz zur funktionellen Redundanz während der Embryogenese-Test

Die Genfunktion während der Embryogenese wird typischerweise durch Loss-of-Function-Experimente definiert, beispielsweise durch gezielte Mutagenese (Knockout) bei der Maus. In ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, festzustellen, ob zwei Gene funktionell redundant für die Spezifikation einer definierten Zelllinie sind. Dies wird erreicht, indem zunächst das Funktionsverlust-Phänotyp jedes einzelnen Gens mithilfe genspezifischer Morpholinos, die in sich entwickelnde Zebrafischembryonen injiziert werden, definiert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, einen Assay zur Quantifizierung der Zelllinienspezifikation oder Differenzierung zu entwickeln.Beispielsweise unter Verwendung einer Reportergen-Fischlinie, wie wir hier zeigen werden. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, zwei morphologische FENOs zu kombinieren, um den Funktionsverlust beider Gene gleichzeitig zu erzielen. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Bewertung des Phänotyps, der durch den doppelten Knockdown verursacht wird.Schließlich können Ergebnisse erzielt werden, die durch Untersuchung des Linienreporters oder Analyse der Expression linien-spezifischer Marker einen Funktionsverlust oder eine Funktionsgewinnung für Zellen einer bestimmten Linie zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Kombination von Knocko

a-reverse-genetic-approach-to-test-functional-redundancy-during

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Ein anpassungsfähiges reversen genetischen Methode für Zebrafisch-Gen-Funktion während der späteren Phasen der Entwicklung und physiologischen Homöostase wie Geweberegeneration unter Verwendung intraventrikuläre Injektion von Gen-spezifischen morpholinos beurteilen.

Rückwärts Genetische Morpholino Ansatz mit Herz ventrikuläre Injektion auf mehrere Schwer zu Zielgeweben in der Zebrafisch-Larve Transfektion

Wir beschreiben ein Xenopus-Eizell- und Tierkappensystem für die Expressionsklonierung von Genen, die in der Lage sind, eine Reaktion in kompetentem Ektoderm zu induzieren, und diskutieren Techniken für die anschließende Analyse solcher Gene. Dieses System ist nützlich bei der funktionellen Identifizierung einer Vielzahl von Genprodukten.

Functional Cloning Mit ein<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizellen Expression System

Das Ziel dieses Protokolls ist es, ein Verlust- zu beschreiben und zu gewinnen-Funktionsmethode, die zur Identifizierung Neogenin als stufenspezifischen Rezeptor anwendbar ist, die und die innere Zellmasse Differenzierung in preimplantation Maus-Embryonen zu Trophektoderm führt.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

Dieses Video Artikel beschreibt eine einfache In - vivo - Methodik , die verwendet werden können , um systematisch und effizient Komponenten komplexer Signalwege und regulatorische Netzwerke in vielen wirbellosen Embryonen zu charakterisieren.

Die Kraft der Einfachheit: Seeigel Embry als<em&gt; In Vivo</em&gt; Entwicklungsmodelle für komplexe Zell-zu-Zell-Signalnetzwerk Wechselwirkungen Studieren

Wir präsentieren eine einfache Suppressor Bildschirm Protokoll in Kernspaltung Hefe. Diese Methode ist effizient, Mutagen-frei und selektiv für Mutationen, die oft auf einen einzigen genomischen Locus auftreten.  Das Protokoll ist geeignet für die Isolierung von Unterdrücker, die Wachstumsstörungen in Flüssigkultur lindern, die durch eine Mutation oder ein Medikament verursacht werden.

Ein Deep-Sequenzierung-gestützte, spontane Suppressor-Bildschirm in der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

Wir haben einen neuartigen Loss-of-Function-Ansatz entwickelt, der die Einführung und genomische Integration künstlicher Mikro-RNA-Sequenzen in Kükenembryonen unter Verwendung der In-ovo-Elektroporation und des Tol2-Transposon-Systems beinhaltet. Diese Technik bietet eine robuste und stabile Gen-Knockdown-Methode für Studien der Genfunktion während der Entwicklung.

Loss-of-Function-Ansatz in der embryonalen Küken-Netzhaut unter Verwendung von Tol2-Transposon-vermittelter transgener Expression künstlicher microRNAs

Der Hell / Dunkel-Übergangs-Test ist eine der am häufigsten verwendeten Tests zur Angst-ähnliches Verhalten bei Mäusen zu messen. Hier präsentieren wir einen Film, der detaillierte Verfahren, wie wir Verhalten der Test zeigt.

Hell / Dunkel Transition Test für Mäuse

Dieses Video zeigt neue Kultur, eine Methode, durch die Hühnerembryonen außerhalb der Eizelle bis zu 24 h kultiviert. Diese Methode ermöglicht ein bis frühen Entwicklung (Primitivstreifens bis 14 som.), Ein Zeitraum entsprechend E7-9 in der Maus zu studieren. Anwendungen dieser Technik sind die Elektroporation, in situ Hybridisierung und Immunhistochemie.

Method for Culture of Early Hühnerembryonen ex vivo (New Culture)

Dieses Video zeigt 2-Farben-whole mount in situ Hybridisierung, eine Methode, durch die die räumliche und zeitliche Expressionsmuster von 2 unterschiedlichen Genen visualisiert werden bei jungen Hühnerembryonen kann. Diese Methode wurde ursprünglich von David Wilkinson, Domingos Henrique, Phil Ingham und David Ish-Horowicz eingeführt.

Doppel Whole Mount in situ Hybridisierung von Anfang Hühnerembryonen

Neuronale Induktion ist der erste Schritt bei der Bildung des Gehirns. Es ist ein Mechanismus, durch den Hensen den Knoten (Veranstalter), weist benachbartes Gewebe ein neuronales Schicksal anzunehmen, dh zu steigen, um das Nervensystem zu geben. Dieses Video zeigt ein Test für neuronale Induktion in Hühnerembryo.

Assay für Neural Induction im Hühnerembryo

Erfahren Sie, wie funktionale Redundanz von Genen während der Embryogenese in Danio rerio untersucht wird. Diese Methode nutzt Morpholino-Injektionen und Reporter-Linien zur Quantifizierung von Zelllinien-Spezifikation.

Ein Reverse Genetic Ansatz zur funktionellen Redundanz während der Embryogenese-Test

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