Ein Reverse Genetic Ansatz zur funktionellen Redundanz während der Embryogenese-Test

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, festzustellen, ob zwei Gene funktionell redundant sind, um eine definierte Zelllinie zu spezifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der Funktionsverlust-Phänotyp jedes einzelnen Gens mit Hilfe von genspezifischen Morphos definiert wird, die in sich entwickelnde Zebrafischembryonen injiziert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, einen Assay zur Quantifizierung der Spezifikation oder Differenzierung der Zelllinie zu entwickeln.

Zum Beispiel mit einem Reporterfischstamm, wie wir hier zeigen werden. Der dritte Schritt des Verfahrens besteht darin, zwei morphe FENOs zu kombinieren, um den Funktionsverlust beider Gene gleichzeitig zu bekämpfen. Der letzte Schritt des Verfahrens besteht darin, den durch den doppelten Knockdown verursachten Phänotyp zu bewerten.

Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die einen Funktionsverlust oder -gewinn für Zellen einer bestimmten Linie zeigen, indem der Linienreporter untersucht oder die Expression auf linienspezifische Marker analysiert wird. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Kombination von Knockouts im Mausmodell besteht darin, dass zwei oder sogar drei Gene im Fischmodell anvisiert werden können, indem einfach validierte Morphos in einem einzigen Experiment kombiniert werden. Über mehrere Tage können über 100 Embryonen injiziert und Phänotypen bewertet werden.

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zu beantworten. In der Entwicklungsbiologie, wie z. B. bei der Definition der Transkriptionswege, die das Zellschicksal steuern, werden wichtige regulatorische Wege oft durch kleine Familien verwandter Gene repräsentiert, die funktionell redundant sind. Ihre Rolle ist daher in Maus-Knockout-Studien aufgrund der Kompensation durch Schwestergene nicht ersichtlich.

Obwohl dieses Modell Einblicke in die Embryogenese von Zebrafischen geben kann, können die Ergebnisse auf andere Systeme wie die Maus übertragen werden, da die gleichen genetischen Programme in der Regel im Laufe der Evolution gut konserviert sind. Bereiten Sie Mikroinjektionsplatten vor, bevor Sie Embryonen injizieren. Gießen Sie etwa 12 Milliliter 2%agros in Systemwasser, das ist sauberes Wasser, das direkt aus dem Aquariensystem entnommen wird, in den umgekehrten Deckel einer 100-Millimeter-Petrischale.

Legen Sie zwei Objektträger in einem Winkel von etwa 45 Grad in die beiden Seiten des Deckels. Wenn das Agros erstarrt ist, ziehen Sie die Objektträger vorsichtig vom Deckel weg und schaffen Sie Tröge, in denen die Embryonen während der Injektion ruhen morph fo, keine Stiele werden bei Raumtemperatur bei einer Konzentration von einem Millimolar und sterilem destilliertem deionisiertem Wasser vor der Injektion aufbewahrt. Inkubieren Sie die Morphos-Bestände fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius, um sicherzustellen, dass sie vollständig in Lösung sind.

Lassen Sie die Vorräte auf Raumtemperatur abkühlen. Jedes neu gestaltete Morpho muss empirisch auf Aktivität und Embryotoleranz validiert werden. In Mikrozentrifugenröhrchen beginnen Sie mit einer bis zwei seriellen Verdünnungen des Stammmorphos in destilliertem deionisiertem Wasser, was Arbeitskonzentrationen von einem Millimolar, 0,5 Millimolar, 0,25 Millimolar und 0,125 Millimolar ergibt.

Verwenden Sie unter einem Präparierskop einen Sauger, um eine kalibrierte Injektionsnadel nach vorne zu laden, die am Mikromanipulator befestigt und richtig positioniert wurde. Laden Sie die Nadel mit etwa einem Mikroliter der Morpho-Lösung mit der niedrigsten Konzentration. Verwenden Sie eine Transferpipette, um befruchtete Einzelzellembryonen in die Tröge der Mikroinjektionsplatte zu bewegen.

Entferne mit der Pipette überschüssiges Wasser von der Platte, so dass die Embryonen auf den Boden des Trogs fallen. Positionieren Sie die Injektionsplatte unter dem Mikroskop und führen Sie die Nadel durch das Corion in das Eigelb. Injizieren Sie jeden Embryo, bevor Sie die Nadel entfernen und die Injektionsplatte neu positionieren, um auf den nächsten Embryo zugreifen zu können.

Beim Erlernen der Injektion kann es hilfreich sein, einen lebenswichtigen Farbstoff zu verwenden, um die Injektion in die Zelle zu visualisieren, wie hier gezeigt, die Embryonen zurück in eine 100-Millimeter-Petrischale zu übertragen, wobei das System sie bei 28,5 Grad Celsius in Wasser kultiviert. Stoßen Sie die restliche Morpho-Lösung aus der Nadel aus und füllen Sie sie mit der nächsthöheren Morpho-Konzentration, um die nächste Charge von Embryonen in einem geeigneten Entwicklungsstadium zu injizieren. Untersuchen Sie die Embryonen bei jeder injizierten Morphokonzentration auf Phänotypen.

Die Schwellendosis für jedes Morpho ist die niedrigste Dosis, bei der ein definierter zuverlässiger Phänotyp vorliegt. Mehrere Titrationsrunden können erforderlich sein, um einen ungenauen Schwellenwert zu definieren. Suche nach einer genetischen Interaktion zwischen zwei unterschiedlichen Genen.

Bereiten Sie eine Mischung aus zwei interessanten Morphos mit jeweils ihrer jeweiligen Schwellenkonzentration vor. Es ist wichtig zu bedenken, dass die Embryonen nicht mehr als 20 Nanogramm Gesamtmorpho pro Injektion vertragen. Injizieren Sie die Embryonen auf die gleiche Weise wie zuvor.

Halten Sie das Injektionsvolumen zwischen Versuchs- und Kontrollgruppen konstant, wobei Sets enthalten sollten, die mit jedem Morpho allein unter dem Präpariermikroskop injiziert werden. Überwachen Sie injizierte Embryonen unmittelbar nach der Injektion und mehrmals am Tag verwenden Sie eine Transferpipette, um tote oder sterbende Embryonen zu entfernen. Da diese mit einer Transferpipette die Lebensfähigkeit der verbleibenden Morphine beeinträchtigen können, werden sedierte oder euthanasierte Embryonen jederzeit verschoben.

Zeigen Sie zur Beobachtung auf eine Vertiefungsfolie. Für die Fotografie. Verwenden Sie bei Bedarf eine scharfe Pinzette, um das Corion zu entfernen.

Stabilisieren Sie den Embryo in einem Tropfen 3%iger Methylcellulose-Screening-Embryonen für einen eindeutigen Phänotyp, der einzigartig für die Kombination von Morphos ist, im Gegensatz zu einer größeren Penetranz des Phänotyps einzelner Morphine. Hier sind mehrere Wildtyp-Embryonen, denen Morphos an der Schwelle injiziert wurden. Für Gata fünf ist der typische Phänotyp Cardio bifida oder zwei Herzen, da die Vorläuferzellen in der Mittellinie nicht miteinander verschmolzen sind.

Beachten Sie die GFP-positiven Kardiomyozyten, die durch die Pfeile angezeigt werden. Der Phänotyp für sechs Morphine umfasst unförmige Herzen, die sich nicht richtig schlingen. Diese Embryonen entwickeln auch GFP-positive Kardiomyozyten.

Den Embryonen, die mit einer Kombination aus gata fünf und gata sechs injiziert wurden, ist jedoch eine Kombination aus den hier gezeigten Morphos gata fünf. Zeigen einen vollständigen Verlust der Kardiomyozytenentwicklung, was darauf hindeutet, dass entweder Gata fünf oder Gata Sechs exprimiert werden müssen, damit sich Kardiomyozyten entwickeln können. Die beiden Gene sind funktionell redundant für die Spezifizierung von Kardiomyozyten.

Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, zuerst Ihre Morphos vollständig zu validieren und so sicher wie möglich zu sein, dass sie einen echten Knockdown eines einzelnen Genziels darstellen. Nach diesem Verfahren ist es wichtig, dass sie ein einzelnes Genziel darstellen. Andere Methoden, wie die Kombination von bedingten Maus-Null-Allelen, können durchgeführt werden, um zu zeigen, dass dieselben Gene funktionieren. Dasselbe gilt für Säugetiere.

Nachdem Sie sich das Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie feststellen können, ob zwei Gene während der Embryogenese funktionell redundant sind.