Functional Cloning Mit ein Xenopus Eizellen Expression System

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Xenopus-Eizelle zu demonstrieren, ein tierisches Kappensystem, das für die Identifizierung von Genprodukten geeignet ist, die in der Lage sind, eine Reaktion bei kompetentem Ektoderm zu induzieren. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, z. B. welche Gene notwendig sind, um eine induktive Reaktion auszulösen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Xenopus-Eizelle als Expressionssystem verwendet wird, um Induktoren zu erzeugen und zu identifizieren, die auf ein Zielgewebe wirken, oder sogar Gene, die stromaufwärts von Induktoren wirken.

visuelle Demonstration dieser Methode ist äußerst nützlich, da die Dissektions- und Rekombinationsschritte stark stadienabhängig sind und eine verfeinerte Technik erfordern. Nachdem Sie Eierstockgewebe von anästhesierten weiblichen Fröschen entnommen haben, reißen Sie das Gewebe in kleine Stücke, die jeweils etwa 10 bis 20 Eizellen enthalten. Und übertragen Sie diese Fragmente, zuerst in frische OR2-Lösung und dann in OR2-haltige 2,0 Milligramm pro Milliliter Kollagenase A. Fahren Sie fort, indem Sie die gewebehaltige Mischung eine Stunde lang vorsichtig auf einem Schüttler rühren.

Übertragen Sie dann die Fragmente in eine frische Kollagenaselösung und rühren Sie eine weitere Stunde lang. Erwarten Sie, dass Sie am Ende dieser Behandlung entflockte Eizellen beobachten werden. Waschen Sie die Eizellen 10 Mal in vollständigem OR2 und dann zweimal in Eizellkulturmedium, abgekürzt als OCM.

Legen Sie anschließend die Eizellen in eine frische OCM und untersuchen Sie sie visuell unter einem Präpariermikroskop. Isolieren Sie die Eizellen im sechsten Stadium, indem Sie die kleineren, unreifen Eizellen verwerfen. Legen Sie dann die Eizellen in eine mit Agarose beschichtete Petrischale, die OCM enthält, und halten Sie sie bis zur Injektion bei 18 bis 20 Grad Celsius.

Um sich auf die Mikroinjektion vorzubereiten, legen Sie den Glaskapillarschlauch in einen Nadelabzieher, ziehen Sie ihn ab und brechen Sie dann die Spitzen vom Glas ab, um Nadeln mit einem Durchmesser von etwa 20 Mikrometern zu erzeugen. Messen Sie die Nadelspitzen an einem zusammengesetzten Mikroskop mit einem kalibrierten Okularmikrometer. Als nächstes schieben Sie den Ton in eine gleichmäßige Schicht auf dem Boden einer 35 x 10 Millimeter großen Petrischale.

Erstellen Sie dann parallele Rillen in dieser Schicht mit einem werkzeug, das einer kleinen Sonde ähnelt. Füllen Sie die mit Ton ausgekleidete Schale mit ca. 2 Millilitern 3%Ficoll in 1x modifizierter Barth's Kochsalzlösung oder MBS. Und dann übertragen Sie die Eizellen mit einer Pipette mit breitem Durchgang darauf.

Positionieren Sie die Eizellen in den Rillen, so dass sie bei der anschließenden Mikroinjektion an Ort und Stelle bleiben. Füllen Sie mit einem Mikroinjektor eine Nadel mit etwa zwei Mikrolitern eines zuvor erzeugten mRNA-Pools und stellen Sie das Gleichgewicht so ein, dass ein leichter positiver Druck erzeugt wird, der verhindert, dass während der Injektion Zytoplasma der Eizelle in die Nadel gezogen wird. Injizieren Sie dann jeder Eizelle 20 Nanoliter RNA in die Äquatorregion.

Anschließend belassen Sie die Eizellen für eine Stunde im Ficoll MBS und überführen sie dann sanft in 1x MBS. Inkubieren Sie die Eizellen acht bis 24 Stunden lang bei 20 Grad Celsius. Um mit dem Tierkappen-Assay zu beginnen, werden 3/4x normales Amphibienmedium, abgekürzt als NAM-Lösung, feine Pinzetten, eine Haarschleife, zuvor injizierte Eizellen und Xenopus-Embryonen im Stadium 11 bis 11,5 entnommen.

Brechen Sie dann die Glasabdeckung in etwa einen Millimeter mal zwei Millimeter große Fragmente auseinander und führen Sie diese Stücke durch eine Flamme, bis ihre Kanten poliert und gezogen sind. Drücken Sie dann den Ton in einer Schüssel zu einer einzigen Schicht, wie zuvor beschrieben. Und verwenden Sie eine Mall-Sonde, um individuelle becherförmige Abdrücke in dieser Beschichtung zu erzeugen.

Füllen Sie die Schale mit etwa zwei Millilitern 3/4x NAM. Übertragen Sie die injizierten Eizellen darauf und positionieren Sie mehrere so, dass jede in einer einzigen Vertiefung immobilisiert ist. Um die Embryonen vorzubereiten, geben Sie sie in eine Schale mit 3/4x NAM-Lösung.

Wählen Sie eine Untergruppe von Gastrula, die als Staging-Kontrollen für das Alter des Ektoderms verwendet werden soll, und übertragen Sie sie in eine andere Schale, die die gleiche Lösung enthält. Und stellen Sie diesen Teller beiseite. Bei Embryonen, die in der Tierkappe verwendet werden, entfernen Sie die Vitellinmembranen mit zwei Paar feiner Pinzetten.

Anschließend die Gastrula mit den Eizellen in die mit Lehm ausgekleidete Schale geben. Zu Beginn schneiden Sie die Tierkappen mit zwei Paaren feinen Forceps von den Embryonen ab und achten Sie darauf, das Äquatorgewebe zu vermeiden. Um Rekombinanten mit der ersten Methode zu erzeugen, positionieren Sie eine Tierkappe so, dass die innere Oberfläche die tierische Hemisphäre einer Eizelle berührt, die bereits in einer Vertiefung positioniert ist.

Und wiederholen Sie diesen Vorgang für mehrere der injizierten Eizellen. Um sicherzustellen, dass diese Rekombinanten zusammengehalten werden, legen Sie ein gebogenes Glasdeckglasfragment auf jedes von ihnen und üben Sie Druck nach unten aus, bis das Tier abgeflacht ist und das Deckglas den Ton berührt. Um Rekombinanten mit der zweiten Methode zu erzeugen, legen Sie tierische Kappen und Eizellen zusammen in leere Einzelvertiefungen in den Ton.

Und stellen Sie sicher, dass die Innenflächen der Tierkappen zur Eizelle zeigen. Befestigen Sie dann die beiden Gewebe mit kleinen Verlängerungen aus Tonerde. Sobald mehrere Rekombinanten mit einer der beiden Methoden erzeugt wurden, kultivieren sie die Embryonen und kontrollieren die stillgelegten Embryonen bei 20 Grad Celsius.

Wenn die Kontrollembryonen das gewünschte Stadium erreicht haben, entfernen Sie die Deckgläser von den Rekombinanten und isolieren Sie das tierische Kapektoderm mit einer Pinzette und einer Haarschlaufe. Fahren Sie fort, um sowohl ektodermale Fragmente als auch Kontrollembryonen eine Stunde lang in MEMFA zu fixieren. Und überführen Sie sie in Ethanol und lagern Sie dieses Gewebe bei minus 20 Grad Celsius.

Hier wurden Sätze von Eizellen mit mRNA-Pools injiziert, die einer immer kleineren Anzahl von Klonen oder Kolonien entsprachen, und dann mit Tierkappen kultiviert. Anschließend wurde die Anzahl der tierischen Kappen in jedem Satz, die foxe3 exprimieren, ein Marker, der normalerweise im präsumtiven Linsenektoderm von den frühen Neuralplattenstadien bis zur Vesikelbildung beobachtet wird, bestimmt und hier zur Bewertung der Linseninduktionsfähigkeit verwendet. Diese Methode identifizierte das für den Kernfaktor kodierende Gen ldb1, das bei 50 von 179 oder 28 % der bewerteten Tierkappen eine linseninduzierende Reaktion hervorrufen kann.

Hier sehen Sie unsere in situ Hybridisierungsbilder, die das foxe3-Signal, angezeigt durch Pfeilspitzen, in Tierkappen zeigen, die mit ldb1-injizierten Eizellen von etwa Stadium 11 bis Stadium 23 kultiviert wurden. In entsprechenden Kontrolltierkappen, die auf nicht injizierten Eizellen platziert wurden, wird keine foxe3-Expression beobachtet. Bei der Generierung von Schnitten aus diesen tierischen Kappen wurde die Foxe3-Expression sowohl in der inneren als auch in der äußeren ektodermalen Schicht beobachtet.

Die Ausprägung in der inneren Schicht ist charakteristisch für eine Linsenreaktion. Oder, wie in beiden Schichten signalisiert, ist ein Hinweis auf andere Strukturen wie die olfaktorische Plakode. Im Anschluss an dieses Verfahren können Methoden wie Immunhistochemie, in situ Hybridisierung oder direkter Nachweis eines fluoreszierenden Reportergens durchgeführt werden, um eine induktive Reaktion im tierischen Kapektoderm zu beurteilen.