Name: Functional Cloning Mit ein Xenopus Eizellen Expression System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Erfahren Sie funktionelles Klonen mit Xenopus-Oozyten zur Identifizierung von Genprodukten, die induktive Reaktionen im kompetenten Ektoderm auslösen. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen in der Entwicklungsbiologie.

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Diese Arbeit wurde durch ein Professional Development Grant an C.Z.P. von der Shepherd University Foundation unterstützt. Die Autoren danken Brett Zirkle und Malia Deshotel für die hilfreichen Diskussionen über die Protokolle und Dr. Carol Hurney für die großzügige Unterstützung.

Alle experimentellen Verfahren wurden von der University of Virginia Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. ANMERKUNG: Abbildung 1 eine schematische Übersicht über die experimentellen Verfahren. 1. Herstellung von Oozyten <ol><li> Pre-prime X. laevis Weibchen mit 150 U Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) etwa eine Woche im Voraus über Eizelle Isolation. Injizieren Sie 1 ml 150 U / ml PMSG in Rücken Lymphsack mit 1 cc sterile Spritze mit 29 G-Nadel. </li><li> Bereiten Sie Lösungen für Oocyteninjektion und Oozyten-Tierkappe Assay. <ol><li> Vorbereitung Ca ++ / Mg ++ -freier OR2 (OR2-): 82 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,5 mM Na 2 HPO 4, 50 mM HEPES pH 7,2. </li><li> Bereiten OR2: OR2- plus 1 mM CaCl 2 und 1 mM MgCl 2. </li><li> Vorbereitung OCM: 60% Leibovitz L15, 0,4 mg / ml BSA, 100 ug / ml Gentamycin, pH 7,8. </li><li> Prepare 1x MBS: 88 mM NaCl, 1 mM KCl, 0,7 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 5 mM HEPES (pH 7,8), 2,5 mM NaHCO 3. </li><li> Bereiten Sie 3% Ficoll in 1x MBS. </li><li> 1fach NAM: 110 mM NaCl, 2 mM KCl, 1 mM Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO 4, 0,1 mM EDTA, 1 mM NaHCO 3, 2 mM Na 3 PO 4, pH 7,4. </li></ol></li><li> Betäuben die Frau in einer 0,03% igen Lösung von Ethyl-3-aminobenzoat Methansulfonatsalz (MS222) in 0,1 MBS (erste aufzulösen 0,3 g MS222 in 10 ml 95% Ethanol, dann in 1 L 0,1 x MBS verdünnen), indem Frosch in Lösung 10-15 Minuten oder bis nicht mehr reagiert. <ol><li> Prüfen Sie, ob der Anästhesie abgeschlossen durch Drehen narkotisierten Frosch auf den Rücken, um sicherzustellen, es reagiert nicht (vollständig betäubten Froschschenkel zu bewegen oder drehen Körper über) ist. </li></ol></li><li> Chirurgisch zu isolieren Eierstockfragmente, indem sie ein Bauchschnitt durch die Haut und Körper Wand mit Skalpell, Isolieren Eierstockgewebe mit einer Pinzetteund Schere. Zeigen Eierstock Fragmente in OR2-. Schließen Sie die Körperwand mit einem 3-0 Seidennaht auf einem 24 mm gebogene Nadel und schließen Sie die Haut separat mit den gleichen Nähten. Eine Wiederherstellung der weiblichen in 1 g / l Aquarium Salz in Wasser. </li><li> Verwenden feinen Pinzette, reißEierStockGewebe in kleine (10 - 20 Eizellen) Stücke und Transfer zum frischen OR2-. </li><li> Defolliculate ovarian Fragmente in 2,0 mg / ml Collagenase A in OR2- durch Rühren vorsichtig auf einem Schüttler für 1 Stunde, der Übertragung auf frische Kollagenase und Rühren für eine weitere Stunde. </li><li> Wasch Oozyten 10mal OR2 [Ca ++ / Mg ++ enthält], Verwerfen kleiner Oozyten. </li><li> Waschen Sie Oozyten in OCM zweimal und übertragen an die frische OCM. Isolieren Stufe VI Oozyten nach Größe bei Sichtprüfung und entsorgen unreifen (kleinere) Oozyten: Stufe VI Oozyten sind größer als die unreifen Eizellen mit noch Pigmentierung im Tier Hemisphäre und etwa 1,2 bis 1,4 mm Durchmesser. </li><li> Pflegen Oozyten bei 18 - 20 ° C in OCM vor der Injektion. Hinweis: Agarose-beschichteten Petrischalen verwendet werden, um ein Anhaften von Eizellen zu minimieren, austeilen wird. </li></ol> 2. Injektion Bibliothek Transcripts <ol><li> Vorbereitung einer direktionalen cDNA-Bank 15 unter Verwendung von RNA in einem geeigneten Stadium der Entwicklung (beispielsweise neuronale Platte Stufe 14 10) extrahiert. Erwerben Sie eine cDNA-Bibliothek oder konstruieren eine Verwendung eines kommerziellen Kits pro Übersicht in den vier Schritten unten. <ol><li> Isolieren Sie etwa 5 ug mRNA mit einem Produkt, für Poly (A) + RNA (Siehe Tabelle der Materialien) zu bereichern und nach den Anweisungen des Herstellers. Anmerkung: Die Transkripte verwendet werden, um die cDNA-Bibliothek kann auf ein induzierendes Gewebe beschränkt sein zu erzeugen (wie beispielsweise das neuronale Platte nach Mikrodissektion des gewünschten Gewebes) oder kann aus ganzen Embryonen in einem bestimmten Stadium können. </li><li> Produzieren cDNA mit einem kommerziellen Kit nach Herstelleranweisungen. </li><li> Ligieren ungefähr 20 ng cDNA in einen vector, das mit dem kommerziellen Kit oder einem anderen geeigneten Vektor. Einen geeigneten Plasmidvektor enthält Sequenzen, die für mRNA-Stabilität, wie beispielsweise 5&#39;-β-Globin-3 Poly (A) -Sequenzen (pCS2 +, pTnT, pCS105). </li><li> Transform-Ligation in kompetente Bakterienzellen mit Lieferanten empfohlenen Protokoll für Hitzeschock-Transformation. Hinweis: Alternativ ist eine Sammlung von offenen Leserahmen (ORFeome) Klone Handel erhältlich und können verwendet werden, um Transkripte für die Injektion zu erzeugen. </li></ol></li><li> Herstellung von 10 Pools von Plasmiden von 10 3 bis 10 4 Komplexität (10. April - 10. MAI Gesamtkomplexität). Dies entspricht 10 Platten mit 1.000 - je 10.000 Kolonien. <ol><li> Plattenbibliothekskultur auf 10 15-cm-LB-Ampicillin-Platten, wachsen 12 bis 18 h bei 37 ° C, und sammeln Sie Kolonien von jeder durch sanften Druck mit einem Glas Treuer in 7 ml LB. </li><li> Bereiten Sie eine Glycerin-Stamm von 0,5 ml (0,2 ml sterilem Glycerin und Speicher hinzuzufügen bei -20 &amp;# 730; C), und verwenden Sie die verbleibenden 6,5 ml, um DNA mit einem Standard-Vorbereitung im Handel erhältlichen DNA Miniprep Kit folgenden Herstellers. </li></ol></li><li> Linearisieren gepoolte Plasmid-DNA (1,0 bis 2,0 &amp; mgr; g) mit geeigneten Restriktionsenzymverdau 16 bei 37 ° C für 1 - 1,5 Stunden. Isolieren Sie die linearisierte DNA mit Phenol / Chloroform-Extraktion, gefolgt von Ethanolfällung und Resuspension in Wasser nach den Vorgaben der RNA-Polymerase-Kit verwendet wird. Synthetisieren Sinn-RNA mit einer RNA-Polymerase kommerziellen Kits nach Herstelleranweisungen. </li><li> Vorbereitung Nadeln für die Mikroinjektion (Verwendung einer Nadel Abzieher mit Glaskapillarröhren) von etwa 20 um Durchmesser; messen Nadelspitzen auf einem zusammengesetzten Mikroskop mit einem kalibrierten Okularmikrometer. Hinweis: Nadelzieher Einstellungen müssen empirisch bestimmt, um eine Nadel mit einer feinen Spitze, so dass, wenn sie mit einer feinen Pinzette gebrochen ergibt die gewünschte Düsengröße zu erzeugen. </li><li> Prepare (Push Ton ingleichmäßige Schicht auf der Unterseite der Schale) Lehm ausgekleideten 35 x 10 mm Petrischalen mit parallelen Rillen an Eizellen in während Mikroinjektion zu halten; produzieren Nuten mit einem Einkaufszentrum Sonde oder Pasteur-Pipette an der Spitze in Flammen fusioniert. Als Alternative zu Ton, vorzubereiten Agarose Gerichte machen Vertiefungen mit einem Elastomer Form 17. Übertragungs Oozyten mit weiter Bohrung Pipette bis 3% Ficoll in 1X MBS (ca. 2 ml) in Reihen in den Lehm ausgekleidet Gerichte. </li><li> Verwendung Mikroinjektor, füllen Nadel mit 1 ng / nl RNA und stellen Balance leichten Überdruck zu erzeugen (Ausarbeitung Eizelle Zytoplasma zu verhindern). </li><li> Injizieren Oozyten, die mit etwa 20 nl RNA in der Äquatorregion. Lassen Sie 1 Stunde für die injizierten Oozyten in Ficoll-MBS bleiben, dann übertragen Sie vorsichtig, um 1x MBS. Inkubation für 8 bis 24 Stunden bei 20 ° C vor der animal cap Assay. </li></ol> 3. Tier Cap Assay <ol><li> Bereiten Sie 3 / 4x NAM und erhalten feinen Pinzette, Haarschleife, gekrümmte Deckglas-Fragmente, Ton ausgekleideten dishes mit becherförmigen Vertiefungen, um Eizellen zu halten. Machen Sie gebogene Deckglas-Fragmente durch Auseinanderbrechen Deckgläser in kleine Fragmente (ungefähr 1-2 mm x 2 - 4 mm) und durch Flammen, bis Kanten polieren und hängen, wodurch ein Kurvenstück. </li><li> Düngung X. laevis Eiern 18 durch in vitro oder natürliche Paarung und Kultur Stufen Gastrula (10 - 11 Stunden nach der Befruchtung bei RT) in 0,1 x MBS vor der Sortierung nach Stufe; Sammeln Mitte der Gastrula (Stufe 11 bis 11,5) 10 Embryonen. </li><li> Transfer-Embryonen in eine Petrischale etwa zur Hälfte mit 3/4-fach NAM. Die Verwendung von zwei Paaren von feinen Pinzette, entfernen Fertilisation (Dotter) Membran von Gastrulen. </li><li> Transfer Oozyten bis 3 / 4x NAM (etwa 2 ml) in Ton ausgekleideten Gerichte und unbeweglich in einzelnen Eindrücke im Ton, Erzeugung Eindrücke auf einzelne Embryonen unterzubringen als Nuten wurden oben beschrieben. </li><li> Transfer-Embryonen, um den Ton ausgekleideten Gerichte und schneiden animal caps off gastrulae mit zwei Paaren von feinen Pinzette. Achten Sie darauf, Tierkappe Ektoderm nur und nicht die Äquatorial Gewebe 18 zu isolieren. </li><li> Platzieren eines Tieres Kappe auf dem Tierhemisphäre jede Oozyte mit der Innenfläche des Tierkappe Kontaktieren der Eizelle. Halten Rekombinanten gemeinsam durch Anlegen gekrümmten Deckglas-Fragment und nach unten gedrückt, um das Glas, Abflachen des Ektoderms wie die Deckkontakte des Tons (animal caps kann mit der Innenschicht auf die Oberfläche der Eizelle für 6 ausgesetzt bleiben offen - 8 h oder länger ). Hinweis: Sie können auch den Tierkappe in einem Ton-Einzug mit seiner Innenfläche nach oben und legen Sie eine Eizelle an der Kappe; sichern die rekombinante mit kleinen Erweiterungen von Ton. </li><li> Kultur bei 20 ° C, bis Steuer Embryonen reach gewünschte Bühne für Assay. </li><li> Separate rekombinanten durch Entfernen Deckglas / Ton und Isolieren Ektoderm mit einer Pinzette und einer Haarschleife. </li><li> Fix ektodermalen Fragmente für 1 Stunde in MEMFA (3,8%Formaldehyd in MEM [0,1 M MOPS, pH 7,4, 2 mM EGTA und 1 mM MgSO 4]). </li><li> Transfer-Fragmente (und Kontrolle Embryonen) aus MEMFA zu Ethanol und bei -20 ˚C. </li></ol> 4. Analyse der Antwort in Ektoderm durch in situ Hybridisierung (ISH) <ol><li> Bereiten Sie Lösungen für die ISH. <ol><li> Vorbereitung 1x PBS: 0,01 M phosphatgepufferter Kochsalzlösung, 0,138 M NaCl, pH 7,4 </li><li> Vorbereitung PBS-Tween (PTW): 1x PBS, 0,1% Tween-20 </li><li> Vorbereitung 100x Denhart-Lösung: 2% BSA, 2% Polyvinylpyrrolidon, 2% Ficoll </li><li> Vorbereitung Hybridisierungspuffer: 50% Formamid, 5 × SSC, 1 mg / ml Hefe-RNA torula, 1 ug / ml Heparin, 1x Denhart-Lösung, 0,1% Tween-20, 0,1% CHAPS, 10 mM EDTA, DEPC-H 2 O </li><li> Vorbereitung Maleinsäure-Puffer (MAB): 100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, pH 7,5 </li><li> Bereiten MAB + Block: MAB, 2% Blockierungsreagenz (Wärme bis 60 ° C zu lösen) </li><li> Vorbereitung alkalische Phosphatase (AP) Puffer: 100 mM TrispH 9,5, 50 mM MgCl 2, 100 mM NaCl, 0,1% Tween, dH 2 O </li></ol></li><li> Bereiten Sie die RNA-Sonde. <ol><li> Unter Verwendung eines kommerziellen RNA-Polymerase-Kit und graben-NTP-Mix, fügen Sie in ein 1,5-ml-Röhrchen (50 &amp; mgr; l-Reaktion): 25,5 &amp; mgr; l DEPC-H 2 O, 10 ul 5X Transcription Buffer, 2,5 ul 10x dig-NTP-Mix, 5 ul 100 mM DTT, 2 ul RNAsin, 2 ul linearisierte DNA-Templat (~ 1 ug / ul), 3 ul RNA Polymerase und Inkubation 37 ° C für 90 min. </li><li> In 2 ul RNA Polymerase und Inkubation 37 ° C für 60 min. </li><li> Prüfen 2 ul Reaktions auf 1% Agarose-Gel. </li><li> 1 ul RQ1 RNase-Free DNase und Inkubation 37 C für 20 min. </li><li> Fällt die Sonde durch Zugabe von 50 &amp; mgr; l DEPC-H 2 O, 25 ul 10 M Ammoniumacetat und 313 ul Ethanol. Lagerung bei -20 C über Nacht (O / N), dann erholen RNA durch Zentrifugation bei 13.800 × g für 20 min. Mit 500 ul 75% Ethanol waschen, kurz drehen, entfernenEthanol und ermöglichen Pellet an der Luft trocknen. In 50 ul DEPC-H 2 O. </li><li> Hinzufügen Hybridisierungspuffer bis zu einer Endkonzentration von ~ 0,5 ug / ul. </li></ol></li><li> Bereiten Tissue für die Hybridisierung. Wenn nicht anders angegeben, füllen Fläschchen an die Spitze mit jeder Lösung Änderung beschrieben (ca. 4 ml). <ol><li> Entfernen von Ethanol aus Fläschchen und Transfer-Embryonen in 75% Ethanol / PTW, dann 50% Ethanol / PTW für jede 10 min, horizontal auf Wippe. </li><li> Dreimal Waschen in PTW für jeden auf Wippe 5 min. </li><li> Transfer zum 10 ug / ul Proteinase K-Behandlung in PTW; Rockröhren vertikal 15 min. </li><li> Spülen Sie zweimal je 10 min in 0,1 M Triethanolamin pH-Wert 7,8 - Rockröhren vertikal. </li><li> In 12,5 ul Essigsäureanhydrid, um Rohre und Rock vertikal 5 min. Wiederholen Sie mit zusätzlichen 12,5 ul Essigsäureanhydrid für 5 min. </li><li> Waschen Sie in PTW 5 min vertikal auf Wippe. </li><li> REFIX in 4% Paraformaldehyd 20 min auf Wippe. Wärmehybridisierungspufferbis 60 ° C. </li><li> Dreimal Waschen in PTW für jeden auf Wippe 5 min. </li><li> Entfernen Sie alle, aber ~ 1 ml PTW aus jedem Röhrchen und fügen Sie 250 ul Hyb-Puffer; leicht schwenken Rohre zu mischen. Rockröhren vertikal 5 min. </li><li> Ersetzen Sie mit 60 ˚C Hyb-Puffer (0,5 ml) und leicht rühren bei 60 ° C 10 min. Ersetzen mit frischem Hyb Puffer und rühren bei 60 ° C zwei bis 4 Stunden. </li><li> Wärmesonde (1 ml bei 0,5 ug / ul in Hyb-Puffer) bis 60 ° C (3 min). Entfernen Hyb Puffer und Sonde in Rohren. Leicht bewegen O / N bei 60 ° C. </li></ol></li><li> Bereiten Tissue für Antikörper. <ol><li> Warm Hyb Puffer und 2x SSC + 0,1% Tween-20-Lösungen bis 60 ° C. </li><li> Ersetzen Sondenlösung mit Hyb Buffer (Speichern Sonden bei -20 ° C für 2 - 3x Wiederverwendung). Für 10 Minuten bei 60 ° C waschen. </li><li> Dreimal bei 60 ° C in 2 × SSC-Tween (20 min je unter Rühren) zu waschen. </li><li> Dreimal bei 60 ° C in 0,2 × SSC-Tween (20 min je unter Rühren) zu waschen. </li><li> Zweimal für jeweils 15 min horizontal auf Wippe waschen in MAB (RT). </li><li> 1 ml MAB + Block. Waschen Sie 2 Stunden vertikal auf Wippe. </li><li> Transfer zum 1 ml MAB + Block mit einer 1 / 2.000 Anti-Digoxygenin-AP. Rock vertikal bei 4 CO / N. </li></ol></li><li> Bereiten Tissue für Farbreagenz. <ol><li> Ersetzen Antikörperlösung mit MAB; waschen dreimal MAB 5 min jeweils horizontal auf Wippe. </li><li> Drei Mal in MAB 1 Stunde jeweils horizontal auf Wippe waschen. </li><li> Zweimal in AP-Puffer jeweils 10 Minuten horizontal auf Wippe waschen. </li><li> Bringen Gewebe Mehr auch Kunststoffwanne, entfernen AP-Puffer und fügen BM Lila Reagenz (~ 1 ml). Erlauben Reaktion auf in der Dunkelheit 5 Minuten bis O / N fortfahren. </li><li> Wenn entsprechende Färbung erreicht ist, zu übertragen, um Gewebedurchstechflaschen mit PTW. Zwei Mal jeweils 10 Minuten auf Wippe waschen in PTW. </li><li> Fix in Bouin-Lösung bei 4 CO / N auf Wippe. </li><li> Waschen Sie Bouin-mit drei 70% Ethanol / 30% PTW Wäschen bei RT. Gehen to Aufnahme von Bildern mit Auflicht und ein Mikroskop montierten Kamera, Bleichen wenn nötig 18. </li></ol></li></ol> 5. Sib Auswahl und Klonierung <ol><li> Wählen Sie Pool mit der höchsten Aktivität (größte Resonanz in ektodermalen Gewebe). </li><li> Man titriert (verdünnte mit LB, geeignete Dichte) das Glycerin Lager für den Pool mit der höchsten Aktivität und Platte aus zehn neuen Platten mit etwa einem Zehntel der Kolonien aus dem vorherigen Schritt (unter Verwendung von Abschnitt 2 in Protokoll oben). </li><li> Poolgröße zu reduzieren, bis Aktivität auf einzelne Kolonie zurückverfolgt. </li><li> DNA-Sequenz zu erhalten, unter Verwendung von Standard-Primer im Vektor. </li></ol>

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<li>Karpinka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenbase%2C+the+Xenopus.+model+organism+database%3B+new+virtualized+system%2C+data+types+and+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Xenbase, the Xenopus. model organism database; new virtualized system, data types and genomes.</a> Nucleic Acids Research. 43, D756-D763 (2015).</li>
<li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signaling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signaling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PLoS ONE. , e79469(2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die für die funktionale Klonierung von Genen in der Lage, eine Antwort in kompetente Ektoderm Induzieren hier beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um eine Vielzahl von Genprodukten zu identifizieren. Diese Methode baut auf früheren Arbeiten durch die Kombination von Gewebe-induzierende Assays mit Ausdruck Klonierungstechniken. Wir nutzen die Stoffwechselwege des Xenopus-Oozyten als Quelle der Erzeugung von induzierende Faktoren, die direkt oder indirekt folgende RNA-Injektion. Dies in Kombination mit d...

Vorausschauende genetische Ansätze zur Identifizierung von Genen von Interesse durch ihre Funktion oder ihren Funktionsverlust1,2 sind ein integraler Bestandteil des Verständnisses komplexer Musterereignisse in der Entwicklung. In Verbindung mit leistungsstarken reversen genetischen Techniken, die einem immer breiteren Spektrum von Systemen und Forschern zur Verfügung stehen3-5, ist es nun möglich, Gene mit einer wichtigen funktionellen Rolle in einem Signalweg zu identifizieren und diese Funktion dann auf zellulärer Ebene und in Interaktion mit anderen Genprodukten aufzuklären. Ein Ansatz zur funktionellen Identifizierung von Genen von Interesse, der in der Vergangenheit viele wichtige Erkenntnisse erbracht hat, ist das Expressionsklonieren6,7.
Unser jüngstes Ziel8 war es, frühe linseninduktive Faktoren zu identifizieren, da gezeigt wurde, dass erste Schritte im linseninduzierten Prozess von Wirbeltieren bereits in den Gastrula-Stadien stattfinden. Zu diesem Zweck verwendeten wir das transient linsenkompetente9-tierische Kapektoderm (Stadium 11-11.510) von Xenopus-Embryonen als ansprechendes Gewebe für die Induktion und die Xenopus-Eizelle im Stadium VI als Produktionsquelle für die induzierenden Faktoren.
Das folgende Protokoll baut auf den Expression-Klonierungs- und Sib-Auswahlprotokollen von Smith und Harland6,7 auf, die auch von anderen11-13 erfolgreich verwendet werden. In unserem Oozytenexpressionssystem (das erstmals von Lustig und Kirschner14 zur Produktion von induzierenden Faktoren verwendet wurde) werden Pools von injizierten Transkripten ausgewählt und identifiziert, die in der Lage sind, die Eizellen direkt oder indirekt dazu zu bringen, Faktoren zu produzieren, die eine linseninduktive Reaktion im tierischen Kapektoderm hervorrufen. Da das System für die direkte Expression sekretierter induzierender Moleküle nützlich ist (Eizell-injizierte INHBB-mRNA bewirkt eine Mesoderminduktion bei mesoderm-kompetenten tierischen Kapektodermen8), erwarteten wir ursprünglich, dass das Screening-Verfahren vor allem für die Identifizierung parakriner Faktoren nützlich sein würde. Da wir jedoch einen nuklearen Faktor in unserem Screening (ldb18) identifiziert haben, ist klar, dass das System zur Identifizierung einer Vielzahl von Molekülen wie transkriptionellen oder translationalen regulatorischen Faktoren, miRNAs, Cofaktoren oder juxtacrinen Faktoren verwendet werden kann.

<table><tbody><tr><td>12/101</td><td>Antikörper-Entwicklungsstudien Hybridoma Bank</td><td>12/101</td><td>Monoklonaler Antikörper zum Nachweis von Muskelgewebe</td></tr><tr><td>20x SSC Buffer</td><td>Sigma</td><td>S6639</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>Essigsäureanhydrid</td><td>Sigma</td><td>A6404</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>Anti-Dig-AP</td><td>Roche</td><td>11093274910</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>Aurum Plasmid Mini Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>732-6400</td><td>Aufreinigung von Plasmid-DNA</td></tr><tr><td>Blockierungsreagenz</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>BM Purple</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>Boekel Hybridisierungsofen</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-245-121</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>Bouin's Solution</td><td>Sigma</td><td>HT10132</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td>für OCM</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma</td><td>C3023</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>Kollagenase A</td><td>Roche</td><td>10103578001</td><td>Defollikulation von Eizellen</td></tr><tr><td>Cystein</td><td>Sigma</td><td>C121800</td><td>Dejelly Embryonen</td></tr><tr><td>DEPC-H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP5611</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>Dig-RNA Labeling Mix</td><td>Roche</td><td>11277073910</td><td>für ISH-Sonden</td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinzetten</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td>für Vitellline Envelope Entfernung</td></tr><tr><td>Ethyl-3-aminobenzoat</td><td>Sigma</td><td>A5040</td><td>MS222 Anästhetikum</td></tr><tr><td>Ficoll PM 400</td><td>Sigma</td><td>F4375</td><td>für Injektionsmedien</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma</td><td>F9037</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>Gentamicinsulfat</td><td>Sigma</td><td>G1914</td><td>für OCM</td></tr><tr><td>Glaskapillaren</td><td>World Precision Instruments</td><td>4878</td><td>3,5" lang, I,D, 0,530 mm</td></tr><tr><td>Probenfläschchen aus Glas</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-408B</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>Hair Loop</td><td></td><td></td><td>In einer Pasteurpipette für die Gewebemanipulation befestigtes Haar</td></tr><tr><td>Heparin-Natriumsalz</td><td>Sigma</td><td>H4784</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>Injector Nanoliter 2010</td><td>World Precision Instruments</td><td>Nanoliter 2010</td><td>Mikroprozessorgesteuerter Mikroinjektor</td></tr><tr><td>Instant Ocean</td><td>Carolina</td><td>972433</td><td>Aquarium Salt for Frog</td></tr><tr><td>Recovery IRBG XGC Xenopus verifizierte Cam cDNA-Quelle in voller Länge</td><td>Bioscience</td><td>989_IRBG</td><td>cDNA-Bibliothek&nbsp;</td></tr><tr><td>LB Agar Platten mit 100 & Mikro; g/ml Ampicillin</td><td>Teknova</td><td>L5004</td><td>150 mm vorgegossene LB-Amp Platten für die Geschwisterauswahl</td></tr><tr><td>LB Luria</td><td>Broth Teknova</td><td>L8650</td><td>LB für die Entnahme von Kolonien in der Geschwisterauswahl aus Platten und Verdünnung von Kulturen</td></tr><tr><td>Magnetisches mRNA Isolation Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>S1550S</td><td>für die Isolierung von poly(A)-angereicherter RNA</td></tr><tr><td>Maleinsäure</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>Manueller Microfil Mikromanipulator</td><td>World Precision Instruments</td><td>M3310R</td><td>Manueller Mikromanipulator</td></tr><tr><td>Nutating Mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-152</td><td>Wippe für ISH</td></tr><tr><td>Permoplast</td><td>Nasco</td><td>SB33495M</td><td>Ton für Injektions- und Sezierschalen</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma</td><td>P5368</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>PMSG</td><td>Sigma</td><td>G4877</td><td>zur Stimulierung der Eizellentwicklung</td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidon</td><td>Sigma</td><td>PVP40</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>Programmable Puller</td><td>World Precision Instruments</td><td>PUL-1000</td><td>Mikropipette Nadelabzieher</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma</td><td>P6556</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>pTnT Vektor</td><td>Promega</td><td>L5610</td><td>cDNA-Bibliotheksbau</td></tr><tr><td>Riboprobe Combination System</td><td>Promega</td><td>P1450</td><td>in vitro Transkription</td></tr><tr><td>Hochgestelltes cDNA-Bibliotheksbauset in voller Länge</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>18248013-Kit für den Bau von cDNA-Bibliotheksnähten</td></tr><tr><td>, 3-0 Seide</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-037-516</td><td>Nahtfaden und Nadel für die Entfernung nach der Eizelle</td></tr><tr><td>Torula RNA</td><td>Sigma</td><td>R3629</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>Triethanolamin</td><td>Sigma</td><td>T1502</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>für ISH</td></tr><tr><td>Universal RiboClone cDNA Synthesesystem</td><td>Promega</td><td>C4360</td><td>alternatives Kit für den Aufbau von cDNA-Bibliotheken</td></tr><tr><td>Xenopus Full ORF Entry Clones - ORFeome Collaboration</td><td>Source Bioscience</td><td>5055_XenORFeome</td><td>ORFeome Clones</td></tr><tr><td>XL2-Blue Ultracompetent Cells</td><td>Agilent Technologies</td><td>200150</td><td>Zellen für die Transformation von cDNA Bibliothek</td></tr></tbody></table>

functional cloning mit ein<em&gt; xenopus</em&gt; eizellen expression system

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Die Identifizierung von Genen, die für die embryonale Induktion verantwortlich sind, stellt eine Reihe von Herausforderungen dar; um nur einige zu nennen: Sekretierte Moleküle von Interesse können in der Häufigkeit gering sein, nicht sezerniert werden, sondern an die Signalzelle(n) gebunden sein, oder das Vorhandensein von Bindungspartnern oder vorgeschalteten regulatorischen Molekülen erfordern. Auf der Suche nach Genprodukten, die in der Lage sind, eine frühe linseninduktive Reaktion in kompetenten Ektodermen hervorzurufen, verwendeten wir daher ein Expressionsklonierungssystem, das die Identifizierung von parakrinen oder juxtacrinen Faktoren sowie transkriptionellen oder anderen regulatorischen Proteinen ermöglicht. mRNA-Pools wurden in Xenopus-Eizellen injiziert und das reagierende Gewebe direkt auf die Eizellen aufgesetzt und co-kultiviert. Nach der funktionellen Klonierung von ldb1 aus einer cDNA-Bibliothek im Neuralplattenstadium basierend auf seiner Fähigkeit, die Expression des frühen Linsenplacode-Markers foxe3 in linsenkompetenten tierischen Kapektodermen hervorzurufen, charakterisierten wir das mRNA-Expressionsmuster und untersuchten die Entwicklungsprogression nach Überexpression oder Knockdown von ldb1. Dieses System eignet sich für eine Vielzahl von Kontexten, in denen die Identifizierung eines Induktors oder seiner vorgeschalteten regulatorischen Moleküle anhand einer funktionellen Reaktion in kompetentem Gewebe angestrebt wird.

Als Reaktion auf die Expression von mRNA in Oozyten injiziert und reagiert animal cap-Gewebe wurde für die Expression von OTX2 durch in situ-Hybridisierung (Figur 2 und Tabelle 1) untersucht; OTX2 wird in der mutmaßlichen Linsen Ektoderm (PLE) aus Neuralrohrschlusses durch Linsenplakode exprimiert Verdickung 19. Da jedoch OTX2 ist auch in der vorderen neuronalen Ektoderm sowie nichtneuralen Kopf Ektoderm außerhalb des PLE au...

Wir beschreiben ein Xenopus-Eizell- und Tierkappensystem für die Expressionsklonierung von Genen, die in der Lage sind, eine Reaktion in kompetentem Ektoderm zu induzieren, und diskutieren Techniken für die anschließende Analyse solcher Gene. Dieses System ist nützlich bei der funktionellen Identifizierung einer Vielzahl von Genprodukten.

Functional Cloning Mit ein<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizellen Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Xenopus-Oozyt-Animal-Cap-System vorzustellen, das geeignet ist, Genprodukte nachzuweisen, die in der Lage sind, eine Antwort im kompetenten Ektoderm auszulösen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise, welche Gene notwendig sind, um eine induktive Reaktion hervorzurufen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Verwendung des Xenopus-Oozyten als Expressionssystem, um Induktoren, die auf ein Zielgewebe wirken, oder sogar Gene, die upstream von Induktoren agieren, zu erzeugen und zu identifizieren.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist äußerst nützlich, da die Dissektions- und Rekombinationsschritte stark vom Entwicklungsstadium abhängen und eine ausgefeilte Technik erfordern. Nach dem Sammeln von Ovarialgewebe von anesthetisierten weiblichen Fröschen, zerreißt man das Gewebe in kleine Stücke, von denen jedes ungefähr 10 bis 20 Oozyten enthält. Anschließend überführt man diese Fragmente zuerst in frische OR2-Lösung und danach in OR2, das 2,0 Milligramm pro Milliliter Kollagenase A enthält. Danach wird das gewebehaltige Gemisch eine Stunde lang vorsichtig auf einem Schüttler bewegt.Überführen Sie die Fragmente anschließend in eine frische Kollagenase-Lösung und schütteln Sie sie eine zusätzliche Stunde lang. Am Ende dieser Behandlung erwarten Sie deflokkulierte Oozyten. Waschen Sie die Oozyten danach zehnmal in vollständigem OR2 und anschließend zweimal in Oozyten-Kulturmedium, abgekürzt als OCM.Anschließend die Oozyten in frisches OCM geben und sie unter einem Stereomikroskop visuell überprüfen. Die Oozyten im sechsten Entwicklungsstadium durch Aussortieren der kleineren, unreifen Oozyten isolieren. Danach die Oozyten in eine mit Agarose beschichtete Petrischale mit OCM geben und bei 18 bis 20 Grad Celsius bis zur Injektion aufbewahren.Um die Mikroinjektion vorzubereiten, bringen Sie Glas-Kapillarrohre in einen Nadelzieher ein, ziehen Sie diese und brechen Sie anschließend die Spitzen der Glasnadeln ab, um Nadeln mit einem Durchmesser von etwa 20 Mikrometern zu erhalten. Messen Sie die Nadelspitzen unter einem Auflichtmikroskop mit einem kalibrierten Okularmikrometer. Danach drücken Sie Ton zu einer gleichmäßigen Schicht auf den Boden einer 35 mal 10 Millimeter großen Petrischale.Erstellen Sie anschließend parallele Rillen in dieser Schicht, indem Sie ein probenähnliches Werkzeug verwenden. Füllen Sie die mit Ton ausgekleidete Schale mit etwa 2 Milliliter 3 % Ficoll in 1x modifizierter Barth'scher Salzlösung (MBS) und überführen Sie die Oozyten mit einer Pipette mit großer Öffnung hinein.Platzieren Sie die Oozyten in den Rillen, damit sie während der anschließenden Mikroinjektion an Ort und Stelle gehalten werden. Füllen Sie mittels eines Mikroinjektors eine Nadel mit etwa zwei Mikrolitern eines zuvor hergestellten mRNA-Pools und stellen Sie das Gleichgewicht so ein, dass ein leichter positiver Druck entsteht, um zu verhindern, dass Zytoplasma der Oozyte während der Injektion in die Nadel gesaugt wird. Injizieren Sie anschließend jeweils 20 Nanoliter RNA in den äquatorialen Bereich jeder Oozyte.Anschließend die Oozyten eine Stunde lang in Ficoll-MBS belassen und sie dann vorsichtig in 1x MBS überführen. Die Oozyten acht bis 24 Stunden bei 20 Grad Celsius inkubieren. Um den Animal-Cap-Test zu beginnen, sammeln Sie 3/4x normale amphibische Mediumlösung (abgekürzt NAM-Lösung), feine Pinzette, eine Haarschleife, zuvor injizierte Oozyten und Xenopus-Embryonen im Stadium 11 bis 11,5.Danach zerbrechen Sie Glasscheiben in Fragmente mit einer Größe von etwa einem Millimeter mal zwei Millimetern und führen diese Stücke durch eine Flamme, bis sich ihre Kanten polieren und ziehen. Anschließend drücken Sie Ton wie zuvor beschrieben in einer einzigen Schicht in eine Schale. Verwenden Sie eine dünne Sonde, um einzelne, tassenförmige Vertiefungen in dieser Schichtung zu erzeugen.Füllen Sie die Petrischale mit etwa zwei Millilitern 3/4x NAM auf und überführen Sie die injizierten Oozyten hinein, wobei mehrere so positioniert werden, dass sich jeweils eine in einer Vertiefung befindet und immobilisiert ist. Um die Embryonen vorzubereiten, überführen Sie diese in eine Schale, die eine 3/4x NAM-Lösung enthält.Wählen Sie eine Teilmenge der Gastrula aus, die als Alterskontrollen für das Ektoderm dienen sollen, und überführen Sie sie in eine andere Schale, die die gleiche Lösung enthält. Stellen Sie diese Schale beiseite. Entfernen Sie bei den Embryonen, die für den Animal-Cap-Assay verwendet werden sollen, die Vitellinmembranen mit zwei Paar feiner Pinzetten.Anschließend die Gastrula in die mit Ton ausgekleidete Schale mit den Oozyten überführen. Zunächst schneiden Sie die Animalcaps von den Embryonen mit zwei Paar feiner Pinzetten ab und achten dabei darauf, das äquatoriale Gewebe zu vermeiden. Um Rekombinanten mit der ersten Methode zu erzeugen, positionieren Sie eine Animalcap so, dass ihre innere Oberfläche mit der animalen Hemisphäre eines bereits in einer Vertiefung positionierten Oozyten in Kontakt kommt.Und wiederholen Sie diesen Vorgang für mehrere der injizierten Oozyten. Um sicherzustellen, dass diese Rekombinanten zusammengehalten werden, legen Sie ein gebogenes Fragment aus einem Glas-Deckgläschen auf jede einzelne Probe und üben Sie Druck nach unten aus, bis das Präparat abgeflacht ist und das Deckgläschen die Tonmasse berührt. Um Rekombinanten mit der zweiten Methode zu erzeugen, platzieren Sie Tierpole und Oozyten gemeinsam in leere, einzelne Vertiefungen in der Tonmasse.Und stellen Sie sicher, dass die inneren Oberflächen der Animal-Caps in Richtung des Oozyten weisen. Befestigen Sie dann das Gewebe mit kleinen Tonfortsätzen. Sobald mehrere Rekombinanten mit einer der beiden Methoden erzeugt wurden, kultivieren Sie diese zusammen mit den separat aufbewahrten Kontrollembryonen bei 20 Grad Celsius.Wenn die Kontrollembryonen das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben, entfernen Sie die Deckgläser von den Rekombinaten und isolieren Sie das animal cap-Ektoderm mit einer Pinzette und einer Haarschleife. Fixieren Sie anschließend sowohl die ektodermalen Fragmente als auch die Kontrollembryonen eine Stunde lang in MEMFA. Danach überführen Sie sie in Ethanol und lagern Sie das Gewebe bei minus 20 Grad Celsius.Hier wurden Gruppen von Oozyten mit Pools von mRNA injiziert, die jeweils einer sukzessive kleiner werdenden Anzahl von Klonen oder Kolonien entsprachen, und anschließend mit Animal Caps kultiviert. Danach wurde die Anzahl der Animal Caps in jeder Gruppe bestimmt, die foxe3 exprimierten, ein Marker, der normalerweise im presumptiven Linsenektoderm von frühen Neuralplattenstadien bis zur Vesikelbildung beobachtet wird und hier zur Beurteilung der Linseninduktionsfähigkeit verwendet wurde. Diese Methode identifizierte das Gen ldb1, das einen linseninduzierenden Effekt in 50 von 179, also 28 %, der untersuchten Animal Caps hervorrufen kann.Hier gezeigte In-situ-Hybridisierungsbilder, die das foxe3-Signal, markiert durch Pfeilspitzen, in Animal Caps zeigen, die mit ldb1-injizierten Oozyten von etwa Stadium 11 bis Stadium 23 kultiviert wurden. In entsprechenden Kontroll-Animal Caps, die auf nicht injizierte Oozyten platziert wurden, ist kein foxe3-Expressionsmuster zu beobachten. Bei der Herstellung von Schnitten aus diesen Animal Caps wurde die foxe3-Expression sowohl in der inneren als auch in der äußeren ektodermalen Schicht nachgewiesen.Die Expression in der inneren Schicht ist charakteristisch für eine Linsenreaktion. Oder, falls sie in beiden Schichten nachgewiesen wird, weist sie auf andere Strukturen wie die olfaktorische Placode hin. Im Anschluss an dieses Verfahren können Methoden wie Immunhistochemie, In-situ-Hybridisierung oder der direkte Nachweis eines fluoreszierenden Reportergens durchgeführt werden, um eine induktive Reaktion im Animal-Cap-Ektoderm zu überprüfen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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Die Befruchtung der Xenopus Oozyten Über den Host-Transfer-Methode

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