Functional Cloning Mit ein

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein Xenopus-Oozyt-Animal-Cap-System vorzustellen, das geeignet ist, Genprodukte nachzuweisen, die in der Lage sind, eine Antwort im kompetenten Ektoderm auszulösen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Entwicklungsbiologie zu beantworten, beispielsweise, welche Gene notwendig sind, um eine induktive Reaktion hervorzurufen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in der Verwendung des Xenopus-Oozyten als Expressionssystem, um Induktoren, die auf ein Zielgewebe wirken, oder sogar Gene, die upstream von Induktoren agieren, zu erzeugen und zu identifizieren.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist äußerst nützlich, da die Dissektions- und Rekombinationsschritte stark vom Entwicklungsstadium abhängen und eine ausgefeilte Technik erfordern. Nach dem Sammeln von Ovarialgewebe von anesthetisierten weiblichen Fröschen, zerreißt man das Gewebe in kleine Stücke, von denen jedes ungefähr 10 bis 20 Oozyten enthält. Anschließend überführt man diese Fragmente zuerst in frische OR2-Lösung und danach in OR2, das 2,0 Milligramm pro Milliliter Kollagenase A enthält. Danach wird das gewebehaltige Gemisch eine Stunde lang vorsichtig auf einem Schüttler bewegt.

Überführen Sie die Fragmente anschließend in eine frische Kollagenase-Lösung und schütteln Sie sie eine zusätzliche Stunde lang. Am Ende dieser Behandlung erwarten Sie deflokkulierte Oozyten. Waschen Sie die Oozyten danach zehnmal in vollständigem OR2 und anschließend zweimal in Oozyten-Kulturmedium, abgekürzt als OCM.

Anschließend die Oozyten in frisches OCM geben und sie unter einem Stereomikroskop visuell überprüfen. Die Oozyten im sechsten Entwicklungsstadium durch Aussortieren der kleineren, unreifen Oozyten isolieren. Danach die Oozyten in eine mit Agarose beschichtete Petrischale mit OCM geben und bei 18 bis 20 Grad Celsius bis zur Injektion aufbewahren.

Um die Mikroinjektion vorzubereiten, bringen Sie Glas-Kapillarrohre in einen Nadelzieher ein, ziehen Sie diese und brechen Sie anschließend die Spitzen der Glasnadeln ab, um Nadeln mit einem Durchmesser von etwa 20 Mikrometern zu erhalten. Messen Sie die Nadelspitzen unter einem Auflichtmikroskop mit einem kalibrierten Okularmikrometer. Danach drücken Sie Ton zu einer gleichmäßigen Schicht auf den Boden einer 35 mal 10 Millimeter großen Petrischale.

Erstellen Sie anschließend parallele Rillen in dieser Schicht, indem Sie ein probenähnliches Werkzeug verwenden. Füllen Sie die mit Ton ausgekleidete Schale mit etwa 2 Milliliter 3 % Ficoll in 1x modifizierter Barth'scher Salzlösung (MBS) und überführen Sie die Oozyten mit einer Pipette mit großer Öffnung hinein.

Platzieren Sie die Oozyten in den Rillen, damit sie während der anschließenden Mikroinjektion an Ort und Stelle gehalten werden. Füllen Sie mittels eines Mikroinjektors eine Nadel mit etwa zwei Mikrolitern eines zuvor hergestellten mRNA-Pools und stellen Sie das Gleichgewicht so ein, dass ein leichter positiver Druck entsteht, um zu verhindern, dass Zytoplasma der Oozyte während der Injektion in die Nadel gesaugt wird. Injizieren Sie anschließend jeweils 20 Nanoliter RNA in den äquatorialen Bereich jeder Oozyte.

Anschließend die Oozyten eine Stunde lang in Ficoll-MBS belassen und sie dann vorsichtig in 1x MBS überführen. Die Oozyten acht bis 24 Stunden bei 20 Grad Celsius inkubieren. Um den Animal-Cap-Test zu beginnen, sammeln Sie 3/4x normale amphibische Mediumlösung (abgekürzt NAM-Lösung), feine Pinzette, eine Haarschleife, zuvor injizierte Oozyten und Xenopus-Embryonen im Stadium 11 bis 11,5.

Danach zerbrechen Sie Glasscheiben in Fragmente mit einer Größe von etwa einem Millimeter mal zwei Millimetern und führen diese Stücke durch eine Flamme, bis sich ihre Kanten polieren und ziehen. Anschließend drücken Sie Ton wie zuvor beschrieben in einer einzigen Schicht in eine Schale. Verwenden Sie eine dünne Sonde, um einzelne, tassenförmige Vertiefungen in dieser Schichtung zu erzeugen.

Füllen Sie die Petrischale mit etwa zwei Millilitern 3/4x NAM auf und überführen Sie die injizierten Oozyten hinein, wobei mehrere so positioniert werden, dass sich jeweils eine in einer Vertiefung befindet und immobilisiert ist. Um die Embryonen vorzubereiten, überführen Sie diese in eine Schale, die eine 3/4x NAM-Lösung enthält.

Wählen Sie eine Teilmenge der Gastrula aus, die als Alterskontrollen für das Ektoderm dienen sollen, und überführen Sie sie in eine andere Schale, die die gleiche Lösung enthält. Stellen Sie diese Schale beiseite. Entfernen Sie bei den Embryonen, die für den Animal-Cap-Assay verwendet werden sollen, die Vitellinmembranen mit zwei Paar feiner Pinzetten.

Anschließend die Gastrula in die mit Ton ausgekleidete Schale mit den Oozyten überführen. Zunächst schneiden Sie die Animalcaps von den Embryonen mit zwei Paar feiner Pinzetten ab und achten dabei darauf, das äquatoriale Gewebe zu vermeiden. Um Rekombinanten mit der ersten Methode zu erzeugen, positionieren Sie eine Animalcap so, dass ihre innere Oberfläche mit der animalen Hemisphäre eines bereits in einer Vertiefung positionierten Oozyten in Kontakt kommt.

Und wiederholen Sie diesen Vorgang für mehrere der injizierten Oozyten. Um sicherzustellen, dass diese Rekombinanten zusammengehalten werden, legen Sie ein gebogenes Fragment aus einem Glas-Deckgläschen auf jede einzelne Probe und üben Sie Druck nach unten aus, bis das Präparat abgeflacht ist und das Deckgläschen die Tonmasse berührt. Um Rekombinanten mit der zweiten Methode zu erzeugen, platzieren Sie Tierpole und Oozyten gemeinsam in leere, einzelne Vertiefungen in der Tonmasse.

Und stellen Sie sicher, dass die inneren Oberflächen der Animal-Caps in Richtung des Oozyten weisen. Befestigen Sie dann das Gewebe mit kleinen Tonfortsätzen. Sobald mehrere Rekombinanten mit einer der beiden Methoden erzeugt wurden, kultivieren Sie diese zusammen mit den separat aufbewahrten Kontrollembryonen bei 20 Grad Celsius.

Wenn die Kontrollembryonen das gewünschte Entwicklungsstadium erreicht haben, entfernen Sie die Deckgläser von den Rekombinaten und isolieren Sie das animal cap-Ektoderm mit einer Pinzette und einer Haarschleife. Fixieren Sie anschließend sowohl die ektodermalen Fragmente als auch die Kontrollembryonen eine Stunde lang in MEMFA. Danach überführen Sie sie in Ethanol und lagern Sie das Gewebe bei minus 20 Grad Celsius.

Hier wurden Gruppen von Oozyten mit Pools von mRNA injiziert, die jeweils einer sukzessive kleiner werdenden Anzahl von Klonen oder Kolonien entsprachen, und anschließend mit Animal Caps kultiviert. Danach wurde die Anzahl der Animal Caps in jeder Gruppe bestimmt, die foxe3 exprimierten, ein Marker, der normalerweise im presumptiven Linsenektoderm von frühen Neuralplattenstadien bis zur Vesikelbildung beobachtet wird und hier zur Beurteilung der Linseninduktionsfähigkeit verwendet wurde. Diese Methode identifizierte das Gen ldb1, das einen linseninduzierenden Effekt in 50 von 179, also 28 %, der untersuchten Animal Caps hervorrufen kann.

Hier gezeigte In-situ-Hybridisierungsbilder, die das foxe3-Signal, markiert durch Pfeilspitzen, in Animal Caps zeigen, die mit ldb1-injizierten Oozyten von etwa Stadium 11 bis Stadium 23 kultiviert wurden. In entsprechenden Kontroll-Animal Caps, die auf nicht injizierte Oozyten platziert wurden, ist kein foxe3-Expressionsmuster zu beobachten. Bei der Herstellung von Schnitten aus diesen Animal Caps wurde die foxe3-Expression sowohl in der inneren als auch in der äußeren ektodermalen Schicht nachgewiesen.

Die Expression in der inneren Schicht ist charakteristisch für eine Linsenreaktion. Oder, falls sie in beiden Schichten nachgewiesen wird, weist sie auf andere Strukturen wie die olfaktorische Placode hin. Im Anschluss an dieses Verfahren können Methoden wie Immunhistochemie, In-situ-Hybridisierung oder der direkte Nachweis eines fluoreszierenden Reportergens durchgeführt werden, um eine induktive Reaktion im Animal-Cap-Ektoderm zu überprüfen.