Rückwärts Genetische Morpholino Ansatz mit Herz ventrikuläre Injektion auf mehrere Schwer zu Zielgeweben in der Zebrafisch-Larve Transfektion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, morphe Eno-Oligonukleotide über ventrikuläre Injektionen in die Larven-, Kotschelfen- und Knockdown-Gene zu verabreichen, um ihre Funktion während der Regeneration zu beurteilen. Dies wird erreicht, indem die Larve zuerst betäubt und in eine Rille des Aros-Schimmels gelegt wird. Anschließend wird die Injektionsnadel in die Herzkammer eingeführt.

Dann wird die Morpho-Lösung vier- bis sechsmal in den Ventrikel injiziert, wobei die Gewichtungsintervalle zwischen den Impulsen eingehalten werden, um eine Reinigung des Herzens zu ermöglichen. Zum Schluss wird die Kotschelflosse amputiert und drei Tage lang regeneriert. Letztendlich kann der Effekt auf die Flossenregeneration dann bewertet werden, indem die regenerierte Fläche der Flosse mit dem Line-Tracing-Tool der Open-Source-Software Fiji image J gemessen wird.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Transgenese oder Mutagenese besteht darin, dass sie den Abbau von Genen durch Minos in Larvengeweben ermöglicht, die nicht für direkte Injektionen geeignet sind. Unter Verwendung von Glaskapillaren mit einem Durchmesser von 0,75 Millimetern wird eine in einen Nadelabzieher gesteckt und die Nadel mit den folgenden Parametern mit einer Uhrmacherpinzette gezogen: Und brechen Sie unter einem Stereoskop mit einem Mikrometer-Okular die gezogene Kapillare, um eine Nadel mit einem Durchmesser von 20 Mikrometern zu erhalten. Verwenden Sie dann eine Drehmaschine mit einem Gummispinnrad, um die Nadel zu schärfen und eine 20-Mikrometer-Fase herzustellen. Bereiten Sie den Morpho-Stamm vor, indem Sie das lyophilisierte Morpho in einem XPBS auf eine Endkonzentration von 7,5 Millimolar auflösen.

Mischen Sie die Morpho-Injektionslösung, indem Sie 2,5 Mikroliter Morpho-Stammlösung mit 2,8 Mikrolitern einer millimolaren Endo-Porter-Stammlösung für eine Endkonzentration von 3,5 Millimolar Morph und 0,5 Millimolar Endo-Porter für die Durchführung von Injektionen kombinieren. Verwenden Sie eine Mikropipette mit einer 10-Mikroliter-Spitze, um die abgeschrägte Glasnadel mit fünf Mikrolitern Morpholösung zu beladen. Führen Sie dann die Glasnadel in den Nadelhalter des Mikromanipulators ein, der mit der pneumatischen Pico-Pumpe verbunden ist.

Stellen Sie den Winkel für die Injektionen auf ca. 45 Grad ein, so dass die Nadel nur in eine Hobelrichtung bewegt werden muss. Legen Sie als Nächstes die Werte des Mikroinjektors wie folgt fest: einen Nachdruck von 20 Pfund pro Quadratzoll oder PSI, einen Auswurfdruck von 15 PSIA, einen Anschnittbereich von 100 Millisekunden und einen Periodenwert von 1,9, was 10,9 Millisekunden entspricht. Bereiten Sie 20 Milliliter geschmolzene 1,5%aros in einem XPBS vor und gießen Sie es in eine 10 Zentimeter große Petrischale.

Platzieren Sie dann eine gerillte Spritzgussform in den warmen Aros, um Furchen im ausgehärteten Gel zu bilden, um die Larven zu betäuben. Geben Sie sie in 100 Milliliter Aquarienwasser mit 20 Milligramm pro Liter Trican. Wenn sie nicht mehr auf Berührung reagieren, verwenden Sie eine pastorale Plastikpipette, um die Larve vorsichtig in eine Rille des nassen Aros-Schimmels zu übertragen, so dass die Bauchseite der vertikalen Aros-Wand der Rille zugewandt ist.

Legen Sie die aros Platte so unter das Stereomikroskop, dass der Ventrikel von der Injektionsnadel abgewandt ist. Senken Sie dann die Nadel ab und führen Sie sie etwa ein bis zwei Mikrometer in die Herzkammer ein. Achten Sie darauf, es nicht zu tief einzuführen.

Injizieren Sie dann einen Drei-Nanoliter-Impuls Morpho-Lösung in den Ventrikel und das Gewicht, um die Reinigung des Herzens zu ermöglichen, bevor Sie nach der Injektion mit fünf weiteren Impulsen fortfahren, entfernen Sie die Nadel und legen Sie sie in eine Petrischale, die ein XPBS enthält, um ein Austrocknen zu verhindern. Übertragen Sie dann die Larven mit einer mit E drei Medium gefüllten Transferpipette vorsichtig zurück in eine Petrischale mit frischem E drei Medium, um die Aufnahme und Aufrechterhaltung des Morpho in den Zellen sicherzustellen. Wiederholen Sie die Injektionen alle 12 bis 24 Stunden für die Dauer des Experiments, um die Injektionen zu beurteilen.

Nachdem Sie die Fische betäubt haben, legen Sie sie auf eine flache, nasse Platte, die mit E drei Medien bedeckt ist, und verwenden Sie ein Stereomikroskop mit Hellfeld und Fluoreszenz, um sie abzubilden. Analysieren Sie Bilder für die Regeneration mit der kostenlosen Software Fiji Image J, um das Linienverfolgungstool zu verwenden, um das Ausmaß des regenerativen Wachstums zu bestimmen, das stattgefunden hat. Kalibrieren Sie zunächst die Bilder, indem Sie eine Datei per Drag & Drop in das Hauptfenster von Fiji im Hauptmenü ziehen.

Legen Sie den Maßstab für alle Bilder fest, indem Sie im Dropdown-Menü auf Analysieren klicken. Klicken Sie auf "Maßstab festlegen" und aktivieren Sie dann die globale Option, indem Sie auf das Markierungsfeld klicken. Ziehen Sie nun das Bild erneut per Drag & Drop, um das Ausmaß des regenerativen Wachstums in der Symbolleiste zu messen.

Wählen Sie das Freihandauswahlwerkzeug und kreisen Sie den zu messenden Bereich ein. Drücken Sie abschließend Strg M.Dies öffnet ein neues Ergebnisfenster, das den Wert des eingekreisten Bereichs in quadratischen Pixeln anzeigt. Wie hier zu sehen ist, verteilt sich die Morpho-Endo-Porter-Lösung innerhalb von Minuten nach der Injektion im gesamten Gefäßsystem in verschiedene Gewebe wie die Flossenfalte und das Gehirn für mindestens 12 oder mehr Stunden.

Um die Regeneration der distalen Larvenflossenstrukturen zu beurteilen, wurden die folgenden entfernt: die distale Spitze der Flossenfalte und des Rückenmarks, das distale Nicht-Strang, der distale Rumpfmuskel, der hier nicht sichtbar ist, und Pigmentzellen, die durch direkte Injektion schwer zu erreichen sind, aber nach seriellen ventrikulären Injektionen das Morpho zu integrieren scheinen. Somit fördert diese Methode relativ leicht die Abgabe von Morpho an Gewebe, die schwer individuell zu erreichen sind, und sie ermöglicht die Beurteilung der Genfunktion in mehreren Geweben in der regenerierenden Flosse gleichzeitig. Um die Bedeutung spezifischer Gene zu analysieren, die an der Regeneration beteiligt sind, wird die Futterflosse der Larve teilweise amputiert und alle Gewebe, die die Morpho eingebaut haben, reseziert.

Die Flossenfalte der Larven regeneriert ihre Struktur innerhalb weniger Tage nach der Amputation, wie gezeigt. Hier zielt Morpho auf Gene ab, die für die Regeneration erforderlich sind, was die Regenerationsreaktion im Vergleich zu nicht injizierten und nicht übereinstimmenden Morpho-Kontrollkontrollen nach seiner Entwicklung stört. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Regeneration den Weg, um die molekularen Mechanismen zu erforschen, die an der Regeneration der Zebrafischflosse beteiligt sind.