Rückwärts Genetische Morpholino Ansatz mit Herz ventrikuläre Injektion auf mehrere Schwer zu Zielgeweben in der Zebrafisch-Larve Transfektion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, Morpholino-Oligonukleotide durch Injektionen in die Ventrikel in die Larven, Kardinalflosse einzubringen und Gene auszuschalten, um deren Funktion während der Regeneration zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem man zunächst die Larve anästhesiert und sie in eine Nut der Aros-Form platziert. Anschließend wird die Injektionsnadel in den Herzenventrikel eingeführt.

Dann wird die Morpho-Lösung vier- bis sechsmal mit gewichteten Intervallen zwischen den Impulsen in das Ventrikel injiziert, um eine Reinigung des Herzens zu ermöglichen. Schließlich wird die Coddle-Flosse amputiert und drei Tage lang regenerieren gelassen. Letztendlich kann der Effekt auf die Flossenregeneration durch Messung des regenerierten Flossenareals mit dem Linienverfolgungswerkzeug der Open-Source-Software Fiji ImageJ bewertet werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Transgenese oder Mutagenese besteht darin, dass sie die Genunterdrückung durch Minos in larvalen Geweben ermöglicht, die sich nicht für direkte Injektionen eignen. Verwenden Sie Glas-Kapillaren mit einem Durchmesser von 0,75 Millimeter, führen Sie eine davon in einen Nadelextrahierer ein und ziehen Sie die Nadel mit den folgenden Parametern. Brechen Sie anschließend die gezogene Kapillare mit einer feinen Pinzette und unter einem Stereomikroskop mit Mikrometerskalenokular so, dass eine Nadel mit einem Durchmesser von 20 Mikrometer entsteht. Verwenden Sie dann eine Drehbank mit einer fest verbundenen, rotierenden Gummischeibe, um die Nadel zu schleifen und eine 20 Mikrometer breite Schräge zu erzeugen. Bereiten Sie den Morpho-Stammlösung vor, indem Sie das lyophilisierte Morpho in einem XPBS auf eine Endkonzentration von 7,5 Millimolar auflösen.

Mischen Sie die Morpho-Injektionslösung, indem Sie 2,5 Mikroliter Morpho-Stammlösung mit 2,8 Mikrolitern einer einmillimolaren Endo-Porter-Stammlösung kombinieren, um eine Endkonzentration von 3,5 Millimolar Morph und 0,5 Millimolar Endo-Porter für die Durchführung der Injektionen zu erhalten. Verwenden Sie eine Mikropipette mit einer 10-Mikroliter-Spitze, um die abgeschrägte Glasnadel mit fünf Mikrolitern der Morpho-Lösung zu befüllen. Stecken Sie anschließend die Glasnadel in den Nadelhalter des Mikromanipulators, der mit der pneumatischen Pico-Pumpe verbunden ist.

Stellen Sie den Winkel für die Injektionen auf etwa 45 Grad ein, sodass die Nadel nur in einer ebenen Richtung bewegt werden muss. Stellen Sie anschließend die Werte des Mikroinjektors wie folgt ein: einen Halte-Druck von 20 pounds per square inch oder PSI, einen Ausstoßdruck von 15 PSIA, einen Gating-Bereich von 100 Millisekunden und einen Periodenwert von 1,9, was 10,9 Millisekunden entspricht. Bereiten Sie 20 Milliliter geschmolzenes 1,5 % Agarose in 1x PBS vor und gießen Sie es in eine 10 cm große Petrischale.

Dann eine gerillte Injektionsform in das warme Agarose-Gel einbringen, um Rillen im gehärteten Gel zu erzeugen, um die Larven zu betäuben. Diese in 100 Milliliter Aquarienwasser mit 20 Milligramm pro Liter Tricain geben. Nachdem sie nicht mehr auf Berührung reagieren, die Larve mit einer plastischen Pasteurpipette vorsichtig in eine Rille der feuchten Agarose-Form überführen, sodass die ventrale Seite der vertikalen Agarose-Wand der Rille zugewandt ist.

Platzieren Sie die Aros-Platte unter dem Stereomikroskop, sodass das Ventrikel vom Injektionsnadel wegzeigt. Senken Sie anschließend die Nadel ab und führen Sie sie etwa ein bis zwei Mikrometer in das Herzkammerinnere ein, wobei darauf geachtet werden sollte, sie nicht zu tief einzuführen.

Danach injizieren Sie einen drei Nanoliter großen Tropfen Morpholösung in das Ventrikel und warten Sie, bis das Herz sich geleert hat, bevor Sie nach der Injektion fünf weitere Tropfen verabreichen. Entfernen Sie anschließend die Nadel und legen Sie sie in eine Petrischale, die 1×PBS enthält, um Austrocknung zu verhindern. Überführen Sie dann mithilfe einer Transferpipette, die mit E3-Medium gefüllt ist, die Larven vorsichtig zurück in eine Petrischale mit frischem E3-Medium, um die Aufnahme und Erhaltung des Morphos in den Zellen sicherzustellen. Wiederholen Sie die Injektionen alle 12 bis 24 Stunden während der gesamten Dauer des Experiments, um die Injektionen zu überprüfen.

Nach der Anästhesie der Fische legen Sie diese auf eine flache, feuchte Agarplatte, die mit E3-Medium bedeckt ist, bevor Sie sie mit einem Stereomikroskop im Hellfeld und unter Fluoreszenz abbilden. Analysieren Sie die Bilder zur Regeneration mithilfe der kostenlosen Software Fiji ImageJ, indem Sie das Linienverfolgungswerkzeug verwenden, um die Menge des regenerativen Wachstums zu bestimmen. Kalibrieren Sie zunächst die Bilder, indem Sie eine Datei in das Hauptfenster von Fiji im Hauptmenü ziehen und dort ablegen.

Legen Sie den Maßstab für alle Bilder fest, indem Sie im Dropdown-Menü auf „analyze“ klicken. Klicken Sie auf „set scale“ und aktivieren Sie dann die globale Option, indem Sie das Kontrollkästchen anwählen. Ziehen und legen Sie nun das Bild erneut ab, um die Menge des regenerativen Wachstums in der Symbolleiste zu messen.

Wählen Sie das Freihand-Auswahlwerkzeug und umkreisen Sie den Bereich, der gemessen werden soll. Drücken Sie abschließend Strg+M. Dadurch öffnet sich ein neues Ergebnisfenster, das den Wert des umkreisten Bereichs in Quadratpixeln anzeigt. Wie hier innerhalb von Minuten nach der Injektion zu sehen ist, verteilt sich die Morpho-Endo-Porter-Lösung über das Gefäßsystem in verschiedene Gewebe wie die Flossenfalte und das Gehirn und verbleibt dort mindestens 12 oder mehr Stunden lang.

Um die Regeneration distaler larvaler Flossenstrukturen zu beurteilen, wurden folgende Strukturen entfernt: die distale Spitze der Flossenspitze und des Rückenmarks, der distale Bereich ohne Rückenmark, der distale Rumpfmuskel, der hier nicht sichtbar ist, sowie Pigmentzellen, die sich nur schwer durch direkte Injektion gezielt ansprechen lassen, jedoch nach wiederholten ventrikulären Injektionen offenbar den Morpholino aufnehmen. Dadurch wird mit vergleichsweise geringem Aufwand die gezielte Abgabe von Morpholinos an Gewebe ermöglicht, die schwer einzeln anzusteuern sind, und es ist möglich, die Genfunktion in mehreren Geweben der regenerierenden Flosse gleichzeitig zu untersuchen. Um die Bedeutung spezifischer Gene, die an der Regeneration beteiligt sind, zu analysieren, wird die larvale Flosse teilweise amputiert und alle Gewebe, die den Morpholino aufgenommen haben, werden reseziert.

Die larvale Flossenfalte regeneriert ihre Struktur innerhalb weniger Tage nach der Amputation, wie gezeigt. Hier zielt Morpho auf Gene ab, die für die Regeneration erforderlich sind, und stört die Regenerationsantwort im Vergleich zu nicht injizierten und Mismatch-Morpho-Kontrollen nach ihrer Entwicklung. Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Regeneration den Weg, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die an der Regeneration der Zebrafischflosse beteiligt sind.