Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
Ein Abonnement für JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt ansehen zu können. Melden Sie sich an oder starten Sie Ihre kostenlose Testversion.
Transcript
Please note that all translations are automatically generated.
Häll först kall källarmembranmatris i en glasbottenform och sprid den jämnt med en pipettspets. Låt membranet stelna vid 37 grader Celsius, med en kontinuerlig tillförsel av koldioxid. Trypsinize fluorescerande märkta cancerceller för att lossa dem från plåtytan och återanvända dem i ett odlingsmedium.
Överför dessa återanvända celler till ett koniskt rör och snurra. Ta bort supernaten och återanvänd cellerna i odlingsmediet. När du har räknat, blanda denna cellupphängning som innehåller önskat antal celler med källarmatrisen i ett lika stort förhållande.
Plätera försiktigt cellmatrisblandningen på den stelnade matrisbelagda skålen i källarmembranet. Låt cellmatrisblandningen stelna vid 37 grader Celsius, med en kontinuerlig tillförsel av koldioxid. När blandningen stelnat, tillsätt odlingsmedium till skålen och inkubera den under önskad period.
Cancerceller kan bilda aktinrika membranutskjutningar och frigöra proteaser för att bryta ner den extracellulära matrisen och därmed invadera matrisen. Placera skålen under ett fluorescerande mikroskop med olika tidsintervall för att analysera cellerna som bildar utskjutande delar. I exempelprotokollet kommer vi att odla bröstcancerceller på en 3D-källarmembranmatris för att studera invasionsprocessen.
Innan du börjar kulturproceduren, placera källarmembranmatrisen, en P200-pipett och pipettspetsar på is över natten, vid 4 grader Celsius. Nästa dag, använd spetsen på den iskalla 200-mikroliterpipetten för att sprida 50 mikroliter av matrisen i ett spiralmönster över botten av en confocal nummer 1 glasbotten skål. Placera sedan skålen i en cellkulturinkubator vid 37 grader Celsius, med 5% koldioxid, i minst 30 minuter.
Medan matrisen genomgår stelning, trypsinize en 70% till 80% sammanflöde 100-millimeters platta av celler. När cellerna har börjat lossna, inaktivera trypsin med 10 milliliter medium och överför sedan cellfjädringen till ett 15 milliliter koniskt rör.
Centrifugera cellerna i tre minuter vid 100 Gs och 4 grader Celsius. Medan cellerna snurrar ner, alikvot 50 mikroliter matris i ett 1 milliliter mikrocentrifugrör per skål med källarmembranmatris och placera rören på is. När cellerna har snurrat klart, aspirera supernaten utan att störa pelleten och sedan återanvänd cellerna i 1 milliliter media och räkna dem.
Överför sedan 2,5 gånger 10 till de 4: e cellerna till ett nytt mikrocentrifugrör och toppa cellfjädringen med media till en slutlig volym på 50 mikroliter. Tillsätt sedan de 50 mikroliter av iskallt källarmembranmatris till cellerna med ett 1:1-förhållande, för en slutlig volym på 100 mikroliter. Plätera försiktigt matrisen till cellblandningen på den stelnade källarmembranmatrisen och låt cellerna bli inbäddade i matrisen i cellkulturinkubatorn.
Efter 30 minuter täcker du matrisen med 2 milliliter media och placerar tillbaka skålen i inkubatorn och byter media varje dag under hela experimentet. Använd 10x-målet för ett ljusmikroskop en gång om dagen under hela experimentet för att ta 20 differentialinterferenskontrastbilder av kolonin upphängd i källarmembranmatrisen. Analysera bilderna blint för att bestämma cellkolonins stellatbildning. En koloni anses vara stellat om en eller flera projektioner från cellernas sfäroid observeras.
