Encyclopedia of Experiments: Cancer Research
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Transcript
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Primeiro, despeje a matriz de membrana fria do porão em um prato de fundo de vidro e espalhe-o uniformemente com uma ponta de pipeta. Deixe a membrana solidificar a 37 graus Celsius, com um suprimento contínuo de dióxido de carbono. Trypsinize as células cancerígenas fluorescentes para desprezá-las da superfície da placa e resuspensá-las em um meio de cultura.
Transfira essas células resuspended em um tubo cônico e gire. Remova o supernatante e resuspense as células no meio da cultura. Após a contagem, misture esta suspensão celular contendo o número desejado de células com a matriz do porão em uma proporção igual.
Emplaque suavemente a mistura de matriz celular no prato solidificado de membrana de porão revestido de matriz. Deixe a mistura de matriz celular solidificar a 37 graus Celsius, com um suprimento contínuo de dióxido de carbono. Uma vez que a mistura se solidificar, adicione meio de cultura ao prato e incuba-o para o período desejado.
As células cancerígenas podem formar saliências de membrana ricas em actina, e liberar proteases para degradar a matriz extracelular, invadindo assim a matriz. Coloque o prato sob um microscópio fluorescente em diferentes intervalos de tempo para analisar as células que formam saliências. No protocolo de exemplo, vamos cultivar células cancerígenas de mama em uma matriz de membrana 3D para estudar o processo de invasão.
Antes de iniciar o procedimento cultural, coloque a matriz de membrana do porão, uma pipeta P200 e pontas de pipeta no gelo durante a noite, a 4 graus Celsius. No dia seguinte, use a ponta da pipeta de 200 microliteres gelada para espalhar 50 microliters da matriz em um padrão espiral sobre o fundo de um prato de fundo de vidro confocal número 1. Em seguida, coloque o prato em uma incubadora de cultura celular a 37 graus Celsius, com 5% de dióxido de carbono, por pelo menos 30 minutos.
Enquanto a matriz está passando por solidificação, trippsinize uma placa de 70% a 80% confluente de 100 milímetros de células. Uma vez que as células tenham começado a se soltar, inative a trippsina com 10 mililitros de médio e, em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo cônico de 15 mililitros.
Centrifugar as células por três minutos a 100 Gs e 4 graus Celsius. Enquanto as células estão girando para baixo, alíquota de 50 microlitadores de matriz em um tubo de microcentrífuga de 1 mililitro por prato de matriz de membrana do porão e colocar os tubos no gelo. Quando as células terminarem de girar, aspirem o supernasce sem perturbar a pelota e, em seguida, resuspend as células em 1 mililitro de mídia e conte-as.
Em seguida, transfira 2,5 vezes 10 para as 4ª células em um novo tubo de microcentrifuuge, desligando a suspensão celular com mídia para um volume final de 50 microliters. Em seguida, adicione os 50 microliters de matriz de membrana de porão frio gelado às células em uma proporção de 1:1, para um volume final de 100 microliters. Emplacar suavemente a matriz à mistura celular na matriz de membrana solidificada do porão e permitir que as células fiquem embutidas na matriz na incubadora de cultura celular.
Após 30 minutos, cubra a matriz com 2 mililitros de mídia, e coloque o prato de volta na incubadora, mudando a mídia todos os dias durante a duração do experimento. Use o objetivo de 10x de um microscópio leve uma vez por dia durante a duração do experimento para tirar 20 imagens de contraste de interferência diferencial da colônia suspensas na matriz de membrana do porão. Analise as imagens cegamente para determinar a formação estelar da colônia celular. Uma colônia é considerada estelar se uma ou mais projeções do esferoide das células forem observadas.
