Lungenvorbereitung der Maus für die Durchflusszytometrie: Erzeugung von Zellsuspension aus Lungengewebe für die durchflusszytometrische Analyse

- Beginnen Sie damit, eine euthanasierte Maus zu nehmen und sie mit Laborklebeband auf einem Sezierbrett zu befestigen. Schneide die Haut mit einer Schere auf. Machen Sie einen vertikalen Schnitt durch das Zwerchfell und schneiden Sie die Rippen, um die Brusthöhle zu erreichen, die Herz und Lunge freilegt. Machen Sie als nächstes einen kleinen Schnitt in der linken Herzkammer des Herzens. Lokalisieren Sie anschließend den rechten Ventrikel und führen Sie eine Spritze mit PBS in das Lumen des Ventrikels ein. Perfundieren Sie PBS durch den rechten Ventrikel und lassen Sie das Blut aus dem vorgefertigten Schnitt am linken Ventrikel fließen, bis die Lunge weiß wird. Das Lungengewebe mit Tumorknötchen herausnehmen und in kleine Stücke zerkleinern.

Inkubieren Sie die Stücke im Lungenverdauungspuffer. Kollagenase im Lungenverdauungspuffer hilft, Zellen zu isolieren, und DNAse hilft, DNA aus den toten Zellen zu eliminieren. Die resultierende Suspension durch ein Zellsieb abseihen, um Klumpen zu entfernen und die Zellsuspension gleichmäßig zu machen. Zentrifugieren Sie das Pellet und resuspendieren Sie es im Ammoniumchlorid-Kalium-Puffer, um die verbleibenden Erythrozyten zu lysieren. Zentrifuge, um die Leukozyten und Tumorzellen im Pellet zu sammeln. Resuspendieren Sie das Pellet in PBS, das mit FCS ergänzt ist, um die Zellstabilität zu erhalten. Im folgenden Protokoll zeigen wir die Herstellung einer Lungenzellsuspension für die durchflusszytometrische Analyse.

Nach dem entsprechenden Versuchsendpunkt wird der Schlachtkörper in 70 %igem Ethanol eingeweicht und das Tier auf einem Sezierbrett befestigt. Machen Sie einen Schnitt an der ventralen Mittellinie und invertieren Sie die Haut sanft, um die Brustwandmuskulatur und die Bauchorgane freizulegen. Verwenden Sie eine Schere, um das Zwerchfell zu punktieren und die Rippen zu schneiden, die die Brusthöhle freilegen. Schneiden Sie eine kleine Öffnung in den linken Ventrikel und perfundierten Sie die Lunge mit einer 27-Gauge-Nadel dreimal durch den rechten Ventrikel mit 6 bis 8 Millilitern eiskaltem PBS pro Infusion. Nach der letzten Perfusion sollte die Lunge vollständig blutfrei sein und weiß erscheinen. Nach der Entnahme das Lungengewebe mit einer Schere in kleine Stücke zerkleinern.

Die Lungenfragmente werden in ein 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit 1,5 Millilitern Lungenverdauungspuffer für eine 30- bis 60-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius unter Schütteln überführt. Am Ende des Aufschlusses wird die Zellsuspension durch ein 70-Mikron-Zellsieb in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt und mit dem Ende eines sterilen 10-Milliliter-Spritzenkolbens die verbleibenden Gewebefragmente durch den Filter gedrückt. Spülen Sie das Sieb mit 15 Millilitern PBS, ergänzt mit 2 % FCS, und sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation. Resuspendieren Sie das Pellet in 1 Milliliter Ammoniumchlorid-Kalium-Lysepuffer für eine 5-minütige Inkubation bei Raumtemperatur und zentrifugieren Sie die Zellen erneut. Dann resuspendieren Sie das Pellet der weißen Blutkörperchen in 1 Milliliter PBS, ergänzt mit 2% FCS, und färben Sie die Zellen für die durchflusszytometrische Analyse gemäß dem Versuchsprotokoll.