Isolation und Charakterisierung von Hoechst ^Low CD45 ^Negative Mouse Lung mesenchymalen Stammzellen

Dieses Video zeigt ein Protokoll für die Isolierung von mesenchymalen Stammzellen aus der Lunge mit niedrigem Zöliakie-Gehalt und niedrigem Zöliakie. Geweberesonante mesenchymale Stammzellen oder MSCs sind wichtige Regulatoren der Gewebereparatur oder -regeneration, der Fibrose, der Entzündung und der Angiogenese. Zuerst wird die Lunge einer geopferten Maus präpariert.

Das Lungengewebe wird verdaut, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. Die Zellen werden mit Hoax-Die und CD 45 gefärbt und mittels Durchflusszytometrie sortiert, um wirtsarme CD 45-negative Lungen-MSCs zu erhalten. Die Lungen-MSCs werden dann in Kultur expandiert und ein koloniebildender Assay durchgeführt, um die Differenzierungsfähigkeiten der MSC zu beurteilen.

Anschließend können weitere Studien durchgeführt werden, um die Rolle von MSCs während der Gewebehomöostase und der Erkrankung zu untersuchen. Die hier gezeigte Methode kann zur Isolierung von mesenchymalen Stammzellen der Lunge von Mäusen oder Menschen verwendet werden und kann auf diese Studie von Lungenerkrankungen wie Lungenfibrose, pulmonaler Hypertonie und COPD angewendet werden. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, aufgrund der Vielzahl der verfügbaren Methoden für die Gewebevorbereitung sowie der Einrichtung geeigneter Kontrollen und Analysen mit dem Durchflusszytometer zu kämpfen haben.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da es schwierig ist, die richtige Technik zum Zerkleinern und Verdauen des Lungengewebes für eine optimale Lebensfähigkeit der Zellen allein mit Worten zu beschreiben. Auch die Einrichtung des Durchflusszytometrie-Instruments und die Analysen werden am besten durch Demonstrationen vermittelt. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die Lunge entfernen, die zur Gewinnung mesenchymaler Stammzellen aus einer geopferten erwachsenen Maus verwendet wird.

Schneide den Brustkorb mit einer kleinen, scharfen Schere seitlich auf jeder Seite der Maus durch. Öffnen Sie die Brusthöhle und entfernen Sie dann das Zwerchfell. Führen Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer 20-einhalb-Gauge-Nadel in den rechten Herzventrikel ein und drücken Sie vorsichtig auf den Kolben, um ihn mit drei bis fünf Millilitern PBS zu durchbluten und das Blut aus der Lunge zu spülen.

Schneiden Sie dann mit einer Schere die Luftröhre und die große Bronch ab und entsorgen Sie sie. Dann mit einer Pinzette. Nehmen Sie die kleinen weißen Lungenlappen und legen Sie sie in eine Petrischale, die mit gepufferter Kochsalzlösung oder HBSS gefüllt ist.

Entfernen Sie dann das Herz und trennen Sie die Lungenlappen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Mäuse in der Studie. Übertragen Sie die Lungenlappen auf den Deckel der Schale.

Befeuchten Sie das Gewebe mit gerade so viel HBSS, dass es nicht austrocknet. Zerkleinern Sie dann mit einem Einwegskalpell die Lungenlappen, um Knochenmark für die Verwendung der Aufrechterhaltungskontrolle für die Durchflusszytometrie zu gewinnen. Verwende eine scharfe Schere, um den Knöchel und die Oberseite des Oberschenkelknochens zu schneiden.

Lege das Glied in eine neue Petrischale. Schneiden Sie dann das Knie ab, wobei ein lineares Stück Oberschenkelknochen und ein zweites Stück mit Schien- und Wadenbein übrig bleiben. Ziehe den Muskel mit einer Pinzette ab, um das Schienbein, das Wadenbein und den Oberschenkelknochen freizulegen.

Nehmen Sie nun eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer 26-einhalb-Gauge-Nadel und führen Sie die Nadel in die Knochenmarköffnung ein. Halten Sie den Knochen an einem Ende der Tibia mit dem anderen Ende in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, das mit 15 Millilitern HBSS gefüllt ist, und drücken Sie den Kolben, um HBSS abzugeben und Knochenmark in das Röhrchen zu spülen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einer Fibula und einem Oberschenkelknochen.

Färben Sie das Knochenmark mit dem Wirt 3 3 3 4 2 bei einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter in supplementiertem DMEM mit hohem Glukosegehalt. Als nächstes wird aus dem isolierten Gewebe eine einzellige Suspension des Lungengewebes erzeugt. Geben Sie jede Lunge in ein Röhrchen mit prewarm.0,2%Worthington.

Kollagenase Typ zwei In sterilem HBSS hergestellt, dann das Röhrchen in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad tauchen und 30 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation verwenden Sie die 10-Milliliter-Pipette, um die Probe zu tritrieren, bis der Aufschluss leicht durch die Pipette fließt. Etwa 10 Wiederholungen werden für weitere 15 Minuten inkubiert, was 37 Grad Celsius entspricht, um die Gewebeverdauung abzuschließen.

Sobald der Verdau abgeschlossen ist, verdünnen Sie die Zellsuspension mit HBSS und verwenden Sie eine Fünf-Milliliter-Pipette, um erneut zu versuchen, um alle verbleibenden Gewebefragmente zu dispergieren. Um unverdaute Gewebefragmente zu entfernen, gießen Sie die Suspension durch ein 70-Mikromolar-Zellsieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Fügen Sie nach und nach die Suspension hinzu, damit die Probe durch das Zellsieb fließen kann.

Wenn unverdaute Gewebefragmente den Fluss der Zellsuspension vollständig blockieren. Durch ein neues Zellsieb in ein neues Röhrchen gießen. Pelletieren Sie die Zellsuspension 10 Minuten lang bei 450 RCF.

Nach dem Schleudern den Überstand dekantieren und das Zellpellet bei Raumtemperatur vorsichtig resuspendieren. Puffer für die Lyse roter Blutkörperchen, fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Fügen Sie dann ein gleiches Volumen HBSS hinzu, um den Lysepuffer zu inaktivieren.

Gießen Sie die Zellsuspension in ein 40-Mikromolar-Zellsieb, um Ablagerungen und Zellaggregate zu entfernen, und sammeln Sie den Durchfluss in einem neuen konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Bestimmen Sie anschließend mit einem Hämozytometer die Zellzahlen sowohl für die Lungen- als auch für die Knochenmarkprobe. Notieren Sie die Konzentration und das Gesamtvolumen der Zellsuspension.

Dann pelletieren Sie die Einzellungenzellsuspension durch Zentrifugation bei 450 RCF für 10 Minuten. Um die Zellen zu erhalten, resuspendieren Sie sowohl die Lungen- als auch die Knochenmarkzellen gleichzeitig. 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter in vorgewärmt supplementiertem DMEM mit hohem Glukosegehalt.

Um die DNA zu färben, geben Sie den Farbstoff HOAXED 3 3 3 4 2 bis zu einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Liter hinzu. Anschließend werden die Zellen durch sanfte Umkehrung gemischt und in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad genau 90 Minuten lang inkubiert. Dann nach dem Schleudern 10 Minuten bei 450 G bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Fahren Sie mit der Färbung des Lungen- und Knochenmarkgewebes mit Anti-CD 45 und Propidiumiodid fort, um die Analyse durch Durchflusszytometrie vorzubereiten. Nachdem die Zellen gefärbt wurden, lagern Sie die Röhrchen auf lichtgeschütztem Eis, bis eine durchflusszytometrische Analyse durchgeführt wird. Bereiten Sie sich auf die Durchflusszytometrie vor, indem Sie sicherstellen, dass die Laser des Instruments ausgerichtet und für die Zellsortierung eingerichtet sind.

Das verwendete Gerät muss mit blauen 488-Nanometer-, Rot-, 635-Nanometer- und UV-Lasern von 350 bis 355 Nanometern ausgestattet sein, mit zwei Detektoren auf dem UV-Laserweg mit blauen 45 über 65 und roten 6, 75 über 50 Filtern. Darüber hinaus muss der UV-Rot-Detektor eine hohe Empfindlichkeit für das rote Signal aufweisen und das Gerät muss mit einer Kühleinheit ausgestattet sein, um die Probe bei 10 Grad Celsius zu halten. Richten Sie in der Gerätesoftware Histogrammdiagramme ein, um lineare Vorwärts- und Seitenstreuung anzuzeigen, ein für das Gerät geeignetes Dublettenunterscheidungsdiagramm.

Ein Histogrammdiagramm von PI unter Verwendung eines logarithmischen Signals, eine rote versus blaue Küste unter Verwendung linearer Signale und ein Histogrammdiagramm von CD 45 A PC unter Verwendung eines logarithmischen Signals. Sobald das Instrument fertig ist, legen Sie die gefärbte Knochenmarkprobe in die Ladeöffnung des Instruments. Diese Probe wird als Kontrolle für die Färbung und die Einrichtung des Instruments verwendet.

Beginnen Sie mit dem Sammeln von Ereignissen und passen Sie die linearen Signale für die Vorwärts- und Streuung an. Um die Zellpopulation deutlich zu visualisieren, sollten sich die Zellen ungefähr in der unteren Mitte der Vorwärtsstreuung des Diagramms als x-Achse befinden. Da der Kernfleck PI membran-IMP-permeant ist, wird er aus lebenden Zellen ausgeschlossen.

Zeichnen Sie eine Gangregion auf die PI-positiven toten Zellen im PI-Histogramm. Weisen Sie die Gerätesoftware an, die abgestorbenen Zellen einzufärben. In diesem Tor rot.

Es ist hilfreich, die farblich belüfteten toten Zellen als Navigator zu verwenden, um die Wirtspopulation G null G eins zu identifizieren. Die PI-Färbung wird auch durch den UV-Laser angeregt und der Großteil der abgestorbenen Zellen sollte außerhalb des Scales liegen. Auf der rechten Seite des roten versus blauen Fluoreszenzdiagramms sollte die G null G eins-Population des Knochenmarks als eine enge Anhäufung von Ereignissen im roten versus blauen Fluoreszenzdiagramm gesehen werden.

Passen Sie die Detektorspannungen so an, dass der Cluster G null G eins oben rechts in der Mitte des Diagramms platziert wird. Ein Teil der S-Phase und das gesamte G zwei des Zellzyklus können außerhalb der Skala liegen. Oben rechts im Diagramm mit roten und blauen Meldungen ist das niedrige Populationsniveau zu sehen, das von der linken Seite des G-Null-G-Clusters bis zur unteren linken Ecke des Diagramms verläuft.

Zeichnen Sie nun ein Gate um den Zellcluster im FSC versus SSC. Plotten Sie die im Dublett-Diagramm identifizierte Singulett-Population und die lebenden Zellen im PI-Histogramm. Weisen Sie dann dem Hoaxdiagramm zu, dass nur diese Gated Populations angezeigt werden.

Zeichnen Sie nach dem Festlegen des Host-Plots einen Bereich um die Seitenpopulation. Weisen Sie diese Region dem CD 45 A PC-Histogramm zusammen mit den Lichtstreu-Singulett- und Live-Cell-Gates als Gate zu. Nachdem das System eingerichtet ist, nehmen Sie die Probe aus der Ladeöffnung und legen Sie die Lungenprobe in die Ladeöffnung.

Die Geräteeinstellungen sollten für diese Probe nicht erneut angepasst werden müssen. Beginnen Sie mit dem Sammeln von Ereignissen auf dem Hoax-Diagramm "Rot gegen Blau". Das Cluster G null G eins für die Lungenprobe erscheint in der Regel in Richtung der x-Achse länglicher und ähnelt dem Tilda-Symbol auf einer Tastatur.

Das Gang-Hoax-Tief der Seitenpopulation sollte sich in einer ähnlichen Position befinden wie die für die Knochenmarkprobe. Diese geringfügigen Anpassungen nach oben oder unten können erforderlich sein, um eine enge Auflösung der Seitenpopulation zu gewährleisten. Sorgen Sie für eine geringe Druckdifferenz während der Sortierung, indem Sie sicherstellen, dass das Probendurchflussventil nicht zu weit geöffnet wird.

Platzieren Sie neben der Isolierung von MSC eine 96-Well-Sammelplatte in der Sortierkammer und richten Sie die Sortiertore auf dem CD 45 A PC-Histogramm ein, um positive und negative Populationen zu trennen. Sammeln Sie schließlich die Zellen entweder als gemischte Population in ein Röhrchen oder als einzelne Zellen, um Klone in eine 96-Well-Platte zu isolieren. Nach der Entnahme des Lungen-MSC durch Zellsortierung werden die Zellen in 30-Millimeter-Schalen mit einem MEM, das mit 20 % FBS ergänzt ist, plattiert. Zunächst erscheinen sortierte Zellen nach etwa zwei bis drei Wochen klein, rund und hell.

Kolonien mit dem mesenchymalen Phänotyp werden sichtbar und die Proliferation ist bei jeder Zellpräparation deutlicher. Bewertung der Fähigkeit der Lungen-MSC, sich in traditionelle mesenchymale Linien von Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten zu differenzieren, und deren Zelloberflächenexpression akzeptierter mesenchymaler Marker. Führen Sie eine zytogenetische Bannanalyse durch, um das Fehlen von groben Chromosomenanomalien zu bestätigen.

Nach der Isolierung durch Durchflusszytometrie und der Erzeugung von Einzelzellklone wird ein koloniebildender Assay durchgeführt, um die MSC-Zellen und die Differenzierungsmöglichkeiten zu charakterisieren. Beginnen Sie mit Zellen, die auf dreimal 10 der vier Zellen pro Milliliter verdünnt werden. Unvollständiges Cul Medium in 100 Millimeter Schalen, führen Getreideverdünnung zwei, sechs mal 10 der vier, dreimal 10 der vier, 1,5 mal 10 zu den vier und 0,75 mal 10 zu den vier Zellen pro Schale in 10 Milliliter Medium in dreifacher Ausfertigung durch.

Legen Sie dann die Platten nach 10 Tagen Kultur in den Inkubator, gießen Sie das Medium ab und spülen Sie die Zellen mit PBS aus. Fixieren Sie sie dann, indem Sie 100 % Methanol fünf Minuten lang bei Raumtemperatur hinzufügen. Nach fünf Minuten gießen Sie das Methanol ab.

Um die Koloniebildung zu erkennen, fügen Sie dann 0,4 Vol.-% gza hinzu, verdünnt von eins bis 20 mit dem ionisierten Wasser, inkubieren Sie es 10 bis 15 Minuten lang. Gießen Sie dann den Fleck ab und spülen Sie ihn mit dem ionisierten Wasser ab. Lassen Sie die Proben an der Luft trocknen und quantifizieren Sie die Anzahl der Kolonien mit mehr als 25 Zellen pro Kolonie mit einem inversen Mikroskop oder einer Visualisierung.

Die Kolonien sind groß und bestehen aus einigen hundert Zellen, wie hier gezeigt, und weisen einen mesenchymalen Phänotyp auf. MSC wurden, wie in diesem Video gezeigt, isoliert und in 96-Well-Platten plattiert, um das Wachstum zu simulieren. Arrestierte CFSE-markierte Antigen-präsentierende Zellen wurden dann zu den Lungen-MSCs hinzugefügt.

Die Proliferation isolierter MSCs wurde dann als Abnahme der mittleren Fluoreszenzintensität von CFSE im Vergleich zum Hintergrund gemessen, der nur aus CFSE-markierten T-Zellen bestand, wie in dieser Abbildung gezeigt, in Abwesenheit von Lungen-SC und Vorhandensein von Antigen-präsentierenden Zellen, A PC plus minus O-Albumin CD 40 positive effektive T-Zellen zeigen eine Abnahme der CFSE-Intensität, Dies deutet auf eine rot eingekreiste Proliferation hin. Die CFSE-Fluoreszenzintensität der T-Zellmembran nimmt ökonometrisch mit jeder Zellteilung ab, d.h. die Hälfte mit jeder Teilung in Gegenwart von Lungen-M-S-C-A-P-C plus minus OVA CD 40 positiv betroffene T-Zellen zeigen keine signifikante Veränderung der CFSE-Intensität, was auf einen Mangel an Proliferation nach ihrer Entwicklung hinweist. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Lungenstammzellbiologie den Weg, um die Rolle mesenchymaler Stammzellen bei Lungenerkrankungen wie pulmonaler arterieller Hypertonie und Lungenfibrose zu erforschen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa fünf Stunden nach diesem Verfahren durchgeführt werden. Andere Methoden wie Differenzierungsassays können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, einschließlich der Frage, ob die mutmaßlichen mesenchymalen Stammzellen der Lunge eine angemessene Differenzierung mehrerer Linien aufweisen, die Potenzial für Knochenfett und Knorpel aufweist oder nicht.