Name: Isolation und Charakterisierung von Hoechst Low CD45 Negative Mouse Lung mesenchymalen Stammzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 55 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Hoechst Low CD45 negativen mesenchymalen Stammzellen aus Mäuselungen mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Charakterisierung ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften.

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AHA GIA0855953G, NIH 1R01 HL091105-01: Diese Arbeit wurde durch Stipendien an SMM finanziert. Zusätzliche Unterstützung wurde bereitgestellt durch: DW: NIH RO1DK075013, DDK und der Kleberg Foundation, die UCCC Durchflusszytometrie Core (NIH 5 P30 CA 46934-15), der UCCC Microarray-Kern (NCI P30 CA 46934-14).

1. Lung Isolation <ol><li> Sacrifice erwachsenen Mäusen (8-10 Wochen im Alter; 18-20 g; C57Bl6J) Mäuse mit einer Überdosis Isofluran durch Ausbluten mit sterilen Technik gefolgt. Profile variiert leicht zwischen den Stämmen. </li><li> Chirurgisch entfernen Sie die Membrane, öffnet den Brustraum durch Schneiden der Brustkorb seitlich auf jeder Seite der Maus. Spülen Sie das Blut aus der Lunge durch Perfusion der rechten Herzkammer vorsichtig mit 3-5mls von Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Präparieren Sie die Lungenlappen Entfernen der Luftröhre und großen Bronchien und in eine Petrischale mit Hanks gefüllt Salzlösung (HBSS). Nach Sammlung aller Lungenlappen Pinzette verwendet, um Gewebe auf den Deckel der Schale statt. Das Gewebe wird dann in kleine Stücke mit Einweg-Skalpelle mit genügend Flüssigkeit, um sie feucht, aber nicht so sehr, dass sie und Schwimmer bewegen zerkleinert. </li><li> Zerlegen einen Hinterlauf eines der Mäuse und zu isolieren, das Knochenmark als eine Färbung verwenden, um das flo gesetztw-Zytometrie Tore. Stain des Knochenmarks (BM), wie oben beschrieben 1. </li></ol> 2. Erstellung eines Single Cell Suspension aus Lungengewebe <ol><li> ; In sterile HBSS gelöst 5mls vorgewärmtes 0,2% Worthington Collagenase Typ 2 (cat # LS004202 Worthington Biochemicals, Lakewood, NJ): Jede Lunge wird durch die Verwendung eines optimierten Gewebe Gewicht zu Volumen-Verhältnis von 0,2 g verdaut. Die Mischung wird in einem 37 ° C Wasserbad für 30 min 2,3 getaucht. </li><li> Man reibt Probe gut, bis Lungengewebe verdauen fließt leicht durch ein 10ml-Pipette (ca. 10 Wiederholungen). Inkubieren für weitere 15 min bei 37 ° C zur Vervollständigung der Gewebe verdaut und sorgt für eine gleichmäßigere einzigen Zellsuspension. </li><li> Verdünnen Sie die Lunge Zellsuspension mit HBSS und verreiben mit einer 5ml Pipette, um restliches Gewebestücke zu zerstreuen. </li><li> Filter die Suspension mit einer 70μM Zelle Sieb, um unverdaute Gewebestücke zu entfernen. Probe in Multipl aufgeteilt werdene konische Röhrchen an dieser Stelle auf eine Überlastung einer Zelle Sieb und die Zeit verringern. </li><li> Pellet die Zellsuspension für 10 min bei 1500 rpm und Dekantieren des Überstandes. </li><li> Resuspendieren Zellpellet vorsichtig mit Raumtemperatur RBC Lysispuffer (eBiosciences, San Diego, CA; cat # 00-4333-57) und inkubieren bei RT 5 min. Fügen Sie ein gleiches Volumen an HBSS dem Lysepuffer inaktiviert und Filtern der Zellsuspension mit einer 40 um Zellsieb zu Schutt und Zellaggregate zu entfernen. </li><li> Pipette 10 &amp;mgr; l jeder Probe werden gefärbt und zählen Zellzahlen sowohl für die Lungen-und BM-Proben mit einer Zählkammer. Hinweis: Notieren Sie sich die Gesamtmenge der Zellen. </li><li> Pellet die einzigen Zellsuspension von Lungenzellen durch Zentrifugation bei 1500 rpm für 10 min. </li><li> Resuspendieren beide Lungen-und BM-Zellen bei 1x10 6 Zellen / ml in vorgewärmten (37 ° C) DMEM + (Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit hoher Glukose (Gibco, Carlsbad, CA, cat # 11965-092) mit 2% fetalem bovine Serum (FBS) und 10mm HEPES. </li><li> Bereiten Sie eine 1mg/ml Stammlösung von Hoechst 33342 Farbstoff (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO; cat # B2261) in Wasser und Filter sterilisieren 1,4. Die Hoechst-Farbstoff kann als Aliquots bei -80 ° C gelagert werden </li><li> Add Hoescht 33342 Farbstoff zu einer Endkonzentration von 5μg/ml (a 200x Verdünnung einer 1mg/ml stock) zu den einzelnen Zell-Suspension. </li><li> Mischen Sie die Zellen durch vorsichtiges Inversion und inkubieren in 37 ° C Wasserbad für genau 90 Minuten. </li></ol> 3. Färbung und Vorbereitung der Lung Zellsuspension für Durchflusszytometrie <ol><li> Nach 90 min alle Schritte mit Hoechst gefärbt Lungenzellen muss bei 4 ausgeführt werden ° C oder auf Eis zu färben Efflux zu verhindern. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 1500 rpm für 10 min bei 4 ° C, und Zellen in eiskaltem Färbepuffer (PBS +2% FBS). </li><li> Die Zellen in einer Konzentration von nicht mehr als 1x10 7 Zellen / Tube mit 300-600μl PBS mit 2%FBS und 10 mM HEPES. </li><li> Ausreichend kicherten hinzufügen CD45-Antikörper (typischerweise 1:200 Verdünnung des CD45-APC (BD Pharmingen, San Diego, CA; cat # 559864), um die Lungen-und BM-Proben auf Eis inkubieren für 10-15 min Inklusive ungefärbten Kontrolle während der.. experimentelle Vorgehensweise ist sinnvoll, die Analyse Toren gesetzt. </li><li> Pellet-Zellen bei 4 ° C für 5 min bei 1500 Umdrehungen pro Minute. Dekantieren Sie den Überstand und die Zellen in 500 ul von gekühlten Färbepuffer (PBS +2% FBS). Transfer zum vorgekühlten Schnappdeckel Polypropylenröhrchen (Fisherbrand, Schaumburg, IL, cat # 14-956-1D). </li><li> Add Propidiumiodid (PI, 200μg/ml Lager in PBS), um die Proben für eine Endkonzentration von 2μg/ml um tote Zellen auszuschließen. PI muss in Kombination mit dem Hoechst 33342 Farbstoff auf die richtige Fluoreszenz-Profil auf die durchflusszytometrische Analyse zu erreichen verwendet werden. </li><li> Shop Röhrchen auf Eis, von leichten bis Durchflusszytometrie geschützt. </li></ol> 4. Durchflusszytometrie-Analyse zu definieren und zu isoliereneine Lunge mesenchymalen Stammzellen (MSC Lunge) Bevölkerung mit Hoechst-Farbstoff Efflux zu einem Side Population (SP) Detect <ol><li> Dieser Test hat folgende gerätespezifische Anforderungen: </li><ul><li> 488 nm und UV (350-355 nm) Laser </li><li> 2 Detektoren auf dem UV-Laser-Pfad mit blauen (450/65) und rot (675/50) Filter. </li><li> Die UV-Infrarot-Detektor müssen eine hohe Sensibilität für das rote Signal. Dies kann ein Problem mit älteren Zellsortern werden. </li><li> Chiller-Einheit, um die Probe bei 5-10 ° C zu halten </li></ul><li> Richten Laser und eingerichtet für Zellsortierung nach dem Protokoll des Herstellers. </li><li> Sammeln Sie die rote (x-Achse) und Blau (y-Achse) Hoechst-Signale mit einer linearen Skala. </li><li> Passen Sie die Photomultiplier Spannungen an die G0/G1 Gipfel in der oberen rechten Ecke des Zentrums Platz auf dem Grundstück für eine angemessene Darstellung von der hinteren Seite der Bevölkerung zu ermöglichen. Ein Teil der S-Phase und die gesamte G2 des Zellzyklus kann off-Skala auf der rechten oberen Ecke des Grundstückes. Die blaue signal ist relativ hell, während das rote Signal ist schwach. Typische MoFlo XDP (Beckman Coulter, Miami, FL) Spannungen sind 425 für den blauen und 650 für den red. </li><li> Tote Zellen werden gated unter Verwendung von PI. Die Standard-PI-Pfad (Anregung 488nm, Emission 630nm) verwendet werden kann. Alternativ ist PI auch durch die UV-Laser angeregt und die Toten Zellpopulation liegt außerhalb des Messbereichs auf der rechten Seite der Side Population (SP) Plot. Somit entfällt die Notwendigkeit, die PI-Signal von einem anderen Fluorochromen wie FITC und PE zu kompensieren. Die ursprüngliche Goodell Methode folgte dem letzteren Verfahren 5-7. </li><li> Achten Sie auf eine relativ geringe Druckdifferenz während der Analyse und Sortierung der engen Auflösung der Side Population zu gewährleisten. </li><li> Die SP wird als Seitenarm abseits der großen Population von Lungenzellen. Diese Bevölkerung wird als Hoechst gering. </li><li> Die Hoechst low / SP wird analysiert, um die CD45 positiven und negativen Populationen mit Hilfe eines Histogramms 2,3 (F separatenBBILDUNG 1). </li><li> Nach Auswahl und Verknüpfung der Hoechst niedrigen CD45 neg Lunge MSC Bevölkerung können die Zellen durch die Sortierung entweder als eine gemischte Bevölkerung in einem Rohr oder einzelne Zellen, um Klone in eine 96-Well-Platte 3 zu isolieren gesammelt werden. </li><li> Für Teller Sortierung der Art stream Ablenkung ist auf 25% eingestellt, um eine vertikale Art stream als die in der Regel für Rohr Sortierung verwendet erstellen. </li><li> Richten Sie die Art stream, indem ein Test-Stream-Puls auf die obere linke und dann die rechte untere Vertiefung einer 96-Well-Platte. </li><li> Setzen Sie den Sorter Software Platte Karte, um die gewünschte Anzahl von Zellen in jedes Well hinterlegen. </li><li> Zur Isolierung einzelner Zellklone eine einzige Lunge MSC wird in die Vertiefung einer 96-Well-Platte in 150 &amp;mgr; l von Kulturmedien (α-MEM mit 20% FBS) sortiert. Nach der Art einer zusätzlichen 100 &amp;mgr; des Mediums zugegeben. </li></ol> 5. Isolation, Kultur und Charakterisierung von Lungen-MSC und Clones <ol><li> Culture und den Ausbau von gemischten Lunge MSC Bevölkerung und einzelne Zellklone folgende Sortierung ist identisch mit Standard-Kulturbedingungen (37 ° C, 5% CO 2 und&gt; 95% Luftfeuchtigkeit). Die Zellen sind erlaubt, nach der Isolierung für 16 Stunden einzuhalten. Media ist alle 48 Stunden ersetzt (α-MEM mit 20% FBS). Wenn die Zellen beginnen sich schneller zu vermehren und zu erreichen zwischen 75-80% Konfluenz passagiert werden (Abbildung 2). </li><li> Die Zellen werden mit vorgewärmtem HBSS gespült und mit 0,5% Trypsin / EDTA (CellGro, Manassas, VA; cat # 25-053-Cl) bei 37 ° C für weniger als 2 min. Cells werden anhand einer invertierten Rahmen, um das Erscheinungsbild einer Zellsuspension zu bestätigen. </li><li> Lung MSC werden dann in Verhältnissen von 1:2 oder 1:3 je nach der aktuellen Proliferationsrate der Kultur unterteilt. </li><li> Die Fähigkeit der Lunge MSC in traditionellen mesenchymale Linien der Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten und ihrer Zelloberfläche Ausdruck akzeptiert mesenchymalen Markern differenzieren is für jede Zelle Vorbereitung ausgewertet. Zytogenetische Bandenanalyse wird auch durchgeführt, um das Fehlen grober Chromosomenanomalien 2,3,8-11 bestätigen. </li></ol> 6. Enumeration der Lunge MSC mit einem Colony Forming Assay (CFU-F) <ol><li> Verdünnen Zellen in komplette MesenCult Medium (Stem Cell Technologies, Vancouver, BC) bis zu einer Endkonzentration von 1x10 6 Zellen / ml. </li><li> Führen Verdünnungsreihen auf Endkonzentrationen in einem 100mm Teller 6x10 4 Zellen, 3x10 4 Zellen, 1,5 x10 4 Zellen und 0,75 x10 4 Zellen in 10 ml Medium zu erreichen. Die Analysen werden in doppelte oder dreifache für jede Zelle Konzentration durchgeführt und kann bei kleineren Flächen skaliert werden. </li><li> Kultur-Zellen für 10 Tage unter Standardbedingungen. Am Tag 10 Zellen werden mit PBS gespült und fixiert mit 100% Methanol für 5 Minuten bei Raumtemperatur. </li><li> Ermitteln Sie die CFU-F Kolonien durch Färbung mit 0,4% w / v Giemsa-Färbelösung(Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) 1:20 verdünnt mit destilliertem Wasser. Werden die Proben an der Luft trocknen und zu quantifizieren, die Anzahl der Kolonien mit mehr als 25 Zellen pro Kolonie (Abbildung 3). </li></ol> 7. Die Analyse der immunmodulatorischen Eigenschaften von Lungen-MSC auf T-Zell-Proliferation und Apoptose <ol><li> 6.25x10 4 Lunge MSC-Zellen pro Well in 96-well-Platten ausplattiert und über Nacht 2 stehen. </li><li> CD4 +-Zellen aus der Milz von T-Zell-Rezeptor (TCR) transgenen Mäusen, OT-II mit T-Zellen, die Ovalbumin 323-339 Peptid erkennt, werden durch abbauende CD8 +, CD19 +, MHC-II + und CD25 +-Zellen mit gereinigtem ein Miltenyi AutoMACS Zellsortierer (Miltenyi, Auburn, CA). Antigen-präsentierenden Zellen (APC) werden durch positiv Sortierung MHC-II + Zellen 12 isoliert. </li><li> APC sind in 4% Paraformaldehyd fixiert, gewaschen 3 mal in PBS / 5% BSA/2mM EDTA, und beladen mit 0.5μg/ml oder 5μg / ml OVA323 Peptid. </li><li> Simulierte, Wachstum verhaftet APC sind in die Lunge MSC in 96-Well-Platten gegeben. </li><li> Mehr als 95% reinen CD4 + 1x10 5 Zellen werden mit 5 &amp;mgr; M Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE, Sigma, St.Louis MO) bezeichnet in PBS und inkubiert für 5 min im Dunkeln, mit PBS gewaschen-5% BSA, und dann zu den zusätzlichen APC und Lunge MSC-Zellen in DMEM 5% FBS Medien. Die Zellen werden dann für 96 Stunden inkubiert. </li><li> CD4 (APC-Cy7);; CD8 (ViolBlue); T-Zellen werden dann mit anti anti-CD40 (Cy5) angefärbt Vbeta 5 (PE) und untersucht mit Hilfe eines Miltenyi MacsQuant 7-Kanal-Durchflußzytometer (Miltenyi, Aurburn, CA) und Flojo Analyse-Software (Treestar, Ashland, OR). Proliferation als die Abnahme der mittleren Fluoreszenzintensität von CFSE im Vergleich zum Hintergrund gemessen, T-Zellen mit CFSE markiert und nicht zu APC ausgesetzt (Abb. 4). T-Zellen sind in dieser Zeit und die Lebensfähigkeit mit Trypanblau-Ausschluss beurteilt gezählt. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 1. Durchflusszytometrische Analyse und Definition von Lung MSC. Einzel-Zell-Suspensionen von Lungengewebe zu verdauen sind mit Hoechst 33342 gefärbt und mittels Durchflusszytometrie analysiert, um Unterschiede in A zu erkennen. forward scatter (FSC) und Seitwärts-Streulicht (SSC) und B. Hoechst blaue und rote Fluoreszenz. Die Anwesenheit eines Side Population (SP) ist sichtbar in das Tor. Die Hoechst niedrige SP wird dann analysiert, um die C trennen. CD45 negativen Bevölkerung von Lungen-MSC. Die CD45-positiven zu negativen Kennzahlen der Lungenfunktion SP sind in der Regel 70:30 / 60:40. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Isolierung und Kultivierung von Lung MSC. Nach dem Sammeln der Lunge MSC durch Zellsortierung werden die Zellen in 30mm Gerichte mit α-MEM Nachtr. vernickelttierte mit 20% FBS. A. Frisch sortierten Zellen erscheinen klein, rund und leuchtend. B. Nach etwa 2-3 Wochen Kolonien mit einem mesenchymalen Phänotyp deutlich geworden und Proliferation ist offensichtlich. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig3.jpg" alt="Abbildung 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 3"> Abbildung 3. Auszählung von MSC durch Colony Forming-Fibroblast-Assay. Expanded Lunge MSC sind gemäß dem beschriebenen Protokoll für die CFU-F-Assay vernickelt. A. Nach 10 Tagen und Giemsa-Färbung Kolonien sind evident. B. Kolonien sind groß und aus einem Einige hundert Zellen. C. Die Zellen zeigen eine mesenchymalen Phänotyp. A &amp; B, Maßstab = 0,5 cm; C Skala bar = 0,14 cm. <img src="/files/ftp_upload/3159/3159fig4.jpg" alt="Abbildung 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 4"> Abbildung 4. CFSE Based T-Zell-Proliferation Assay. In Abwesenheit von Lungen-MSC und Gegenwart antigen-präsentierenden Zellen (APC) + / - Ovalbumin (OVA) CD40 positive Effektor-T-Zellen zeigen eine Abnahme der CFSE-Intensität, welche die Proliferation zeigt (roter Kreis). CFSE Fluoreszenz-Intensität des T-Zell-Membran verringert stöchiometrisch mit jeder Zellteilung, dh. mit jeder Sparte. In Anwesenheit von Lungen-MSC, APC + / - OVA zeigen CD40 positive Effektor-T-Zellen keine signifikante Veränderung in CFSE Intensität, die einen Mangel an Verbreitung zeigt (roter Kreis).

<ol><li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li>
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</ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wir haben eine Methode zunächst zur BM hämatopoetischen Zellen zu identifizieren, um eine spezifische Population von Resident Lunge MSC isolieren angepasst. Aufgrund der Reproduzierbarkeit der Isolierung dieser Zellen wurden dann auch MSC aus. Ihre Herkunft hat als Resident in der adulten Maus Lunge (im Gegensatz zu BM abgeleitet Gegensatz) und einer phänotypischen und molekularen Profil dokumentierten 2 definiert. Die Fähigkeit, immer wieder zu isolieren diese charakterisiert Bevölkerung ermöglicht die weitere Erforschung der biologischen Bedeutung und Rolle der Lunge MSC während Gewebshomöostase und Krankheit. Die jüngste Definition dieser Population in vivo in beiden murinen und humanen Lungengewebe ermöglicht die Entwicklung einer therapeutischen Strategie bei der Rettung von körpereigenen Zellen der Lunge Reparatur während Verletzungen und Krankheiten zu erleichtern gerichtet.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) </td><td> Sigma </td><td> P-5368 </td><td></td></tr><tr><td> Hanks Salzlösung (HBSS) </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30588.01 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,2% Worthington Collagenase Typ 2 </td><td> Worthington Biochemicals </td><td> LS004202 </td><td></td
></tr><tr><td> Rote Blutzellen Lysepuffer </td><td> eBiosciences </td><td> 00-4333-57 </td><td></td
></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td
></tr><tr><td> Hoechst 33342 Farbstoff </td><td> Sigma </td><td> B2261 </td><td></td
></tr><tr><td> CD45-APC </td><td> BD Pharmingen </td><td> 559864 </td><td></td
></tr><tr><td> Propidiumiodid </td><td> Sigma </td><td> 81845 </td><td></td
></tr><tr><td> a-MEM </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30265.01 </td><td>; </td
></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-069 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,5% Trypsin / EDTA </td><td> CellGro </td><td> 25 bis 053-Cl </td><td></td
></tr><tr><td> Komplette MesenCult Medium </td><td> Stem Cell Technologies </td><td> 05511 </td><td></td
></tr><tr><td> 0,4% w / v Giemsa-Färbelösung </td><td> Sigma </td><td> GS1L </td><td></td
></tr><tr><td> 4% Paraformaldehyd </td><td> Electron Microscopy Dienstleistungen </td><td> 15710 </td><td> 16% paraformeldehyde ist auf 4% mit PBS verdünnt </td
></tr><tr><td> Carboxyfluorescein Succinimidylester (CFSE) </td><td> Sigma </td><td> 21888 </td><td></td
></tr></tbody></table>

isolation und charakterisierung von hoechst low cd45 negative mouse lung mesenchymalen stammzellen

Isolation &#38; Characterization of Hoechstlow CD45negative Mouse Lung Mesenchymal Stem Cells

Tissue Wohnsitz mesenchymalen Stammzellen (MSC) sind wichtige Regulatoren der Reparatur von Gewebe oder Regeneration, Fibrose, Entzündung, Angiogenese und Tumorbildung. Zusammen stellen diese Studien deuten darauf hin, dass Resident Lunge MSC eine Rolle spielen bei der Lungengewebe Homöostase, Verletzung und Reparatur während Erkrankungen wie Lungenfibrose (PF) und arterielle Hypertonie (PAH) übernommen. Hier beschreiben wir eine Technologie, um eine Bevölkerung von Resident Lunge MSC definieren. Die Definition dieser Population in vivo Lungengewebe mit einer der Marker zu definieren erleichtert die wiederholte Isolierung eines gut charakterisierten Stammzellen Bevölkerung mittels Durchflusszytometrie und das Studium einer bestimmten Zelltyp und Funktion.

In diesem Artikel zeigen wir die Isolierung von murinen Wohnsitz Lunge mesenchymalen Stammzellen (MSC Lunge), deren Expansion, Charakterisierung und Analyse der immunmodulatorischen Eigenschaften.

Isolation und Charakterisierung von Hoechst Low CD45 Negative Mouse Lung mesenchymalen Stammzellen

Gewebeständige mesenchymale Stammzellen (MSC) sind wichtige Regulatoren der Gewebereparatur oder -regeneration, Fibrose, Inflammation, Angiogenese und Tumoren ...

Dieses Video demonstriert ein Protokoll zur Isolierung von Wirt-Lungen-Mesenchymalen Stammzellen mit niedrigem CD45-Negativ-Ausdruck. Gewebe-residente mesenchymale Stammzellen oder MSCs sind wichtige Regulatoren der Gewebereparatur oder Regeneration, Fibrose, Entzündung und Angiogenese. Zunächst werden die Lungen von einem getöteten Maus entnommen.Das Lungengewebe wird verdaut, um eine Einzelzell-Suspension zu erhalten. Die Zellen werden mit Hoax-Farbstoff und CD 45 markiert und mittels Durchflusszytometrie sortiert, um CD 45-negative, wirtseigene Lungens-MSCs zu gewinnen. Die Lungens-MSCs werden anschließend in Kultur vermehrt, und ein Koloniebildungs-Assay wird durchgeführt, um die Differenzierungsfähigkeit der MSCs zu bewerten.Weitere Studien können dann durchgeführt werden, um die Rolle von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) während der Gewebehomöostase und bei Erkrankungen zu untersuchen. Die hier gezeigte Methode kann verwendet werden, um entweder murine oder humane mesenchymale Lungensamtammzellen zu isolieren, und ist auf die Untersuchung von Lungenerkrankungen wie pulmonaler Fibrose, pulmonaler Hypertonie und COPD anwendbar. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten aufgrund der Vielzahl verfügbarer Methoden zur Gewebepräparation sowie der Einrichtung geeigneter Kontrollen und der Analyse am Durchflusszytometer.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, da es schwierig ist, die korrekte Technik zum Zerkleinern und Verdauen des Lungengewebes für eine optimale Zellviabilität allein mit Worten zu beschreiben. Außerdem werden die Einrichtung und Analyse mittels Durchflusszytometrie am besten durch Demonstration vermittelt. Beginnen Sie dieses Protokoll, indem Sie die Lungen von einer getöteten erwachsenen Maus entfernen, die zur Gewinnung mesenchymaler Stammzellen verwendet werden sollen.Verwenden Sie ein kleines Paar scharfer Scheren, um den Rippenkorb des Mäuses beidseits lateral zu durchtrennen. Öffnen Sie die Brusthöhle und entfernen Sie anschließend das Zwerchfell. Führen Sie eine 10-Milliliter-Spritze mit einer Nadel der Stärke 20,5 Gauge in den rechten Herzkammer vor und drücken Sie vorsichtig den Kolben nieder, um drei bis fünf Milliliter PBS durchzupumpen, wodurch das Blut aus den Lungen ausgespült wird.Danach mit einer Schere die Luftröhre und die großen Bronchien abschneiden und entsorgen. Anschließend mit einer Pinzette die kleinen weißen Lungenlappen aufnehmen und in eine Petrischale geben, die mit Hank’s Buffered Saline oder HBSS gefüllt ist.Entfernen Sie dann das Herz und trennen Sie die Lungenlappen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle Mäuse der Studie. Überführen Sie die Lungenlappen in den Deckel der Schale.Befeuchten Sie das Gewebe mit ausreichend HBSS, um Austrocknung zu verhindern. Zerkleinern Sie dann mit einem Einweg-Skalpell die Lungenlappen, um Knochenmark zu gewinnen, das als Erhaltungskontrolle für die Durchflusszytometrie verwendet wird. Verwenden Sie eine scharfe Schere, um am Knöchel und am oberen Ende des Femurs zu schneiden.Legen Sie das Glied in eine neue Petrischale. Schneiden Sie dann das Knie ab, sodass ein lineares Stück des Femurs und ein zweites Stück, das Tibia und Fibula enthält, übrigbleiben. Ziehen Sie mit einer Pinzette den Muskel ab, um Tibia, Fibula und Femur freizulegen.Nehmen Sie nun eine Fünf-Milliliter-Spritze mit einer 26½-Gauge-Nadel und führen Sie die Nadel in die Knochenmarköffnung ein. Halten Sie den Knochen an einem Ende der Tibia, während das andere Ende in ein 50-Milliliter-Kegelrohr gerichtet ist, das mit 15 Millilitern HBSS gefüllt ist, und drücken Sie den Kolben, um HBSS auszubringen und das Knochenmark in das Rohr auszuspülen. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit einer Fibula und einem Femur.Färben Sie das Knochenmark mit Wirt 3 3 3 4 2 bei einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Milliliter in ergänztem DMEM mit hohem Glucosespiegel. Als Nächstes wird eine Einzelzell-Suspension von Lungengewebe aus dem isolierten Gewebe hergestellt. Geben Sie jede Lunge in ein Gefäß mit vorgewärmtem 0,2 % Worthington.Kollagenase Typ II in sterilem HBSS hergestellt, dann das Röhrchen in ein Wasserbad mit 37 Grad Celsius eintauchen und 30 Minuten lang inkubieren. Nach der Inkubation die Probe mit einer 10-Milliliter-Pipette solange trituriert, bis der Verdauungsansatz leicht durch die Pipette fließt. Ungefähr 10 Wiederholungen durchführen und anschließend weitere 15 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, um den Gewebeverdau abzuschließen.Nach Abschluss des Verdauungsschritts verdünnen Sie die Zellsuspension mit HBSS und verwenden Sie eine fünf Milliliter pipette, um erneut zu versuchen, alle verbleibenden Gewebefragmente zu dispergieren. Als Nächstes gießen Sie die Suspension durch einen 70 µm Zellfilter in ein 50 Milliliter kegelförmiges Reagenzglas, um unverdaute Gewebefragmente zu entfernen. Geben Sie die Suspension schrittweise hinzu, um sicherzustellen, dass die Probe kontinuierlich durch den Zellfilter fließt.Wenn undigestierte Gewebefragmente den Durchfluss der Zellsuspension vollständig blockieren, durch einen neuen Zellfilter in ein neues Röhrchen gießen. Die Zellsuspension 10 Minuten bei 450 RCF pelletieren.Nach der Zentrifugation das Überstand abgießen und das Zellpellet vorsichtig in Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen bei Raumtemperatur resuspendieren, fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend ein gleiches Volumen HBSS hinzufügen, um den Lysepuffer zu inaktivieren.Geben Sie die Zellsuspension in einen 40-Mikrometer-Zellsieb, um Verunreinigungen und Zellaggregate zu entfernen, und sammeln Sie die Durchflussfraktion in einem neuen 50-Milliliter-Konischglas. Bestimmen Sie anschließend mit einem Hämozytometer die Zellzahlen für die Proben aus Lunge und Knochenmark. Notieren Sie die Konzentration und das Gesamtvolumen der Zellsuspension.Sedimentieren Sie dann die Einzelzell-Suspension der Lunge durch Zentrifugation bei 450 RCF für 10 Minuten. Um die Zellen zu erhalten, resuspendieren Sie sowohl die Lungen- als auch die Knochenmarkzellen gleichzeitig in einer Konzentration von 10⁶ Zellen pro Milliliter in vorgewärmtem, supplementiertem DMEM mit hohem Glukosegehalt.Um die DNA anzufärben, fügen Sie den HOAXED 3 3 3 4 2 Farbstoff in einer Endkonzentration von fünf Mikrogramm pro Liter hinzu. Mischen Sie anschließend die Zellen durch vorsichtiges Umstülpen und inkubieren Sie sie genau 90 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Danach zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 450 ×g und vier Grad Celsius nach dem Spin.Fahren Sie mit der Färbung des Lungengewebes und Knochenmarkgewebes mit Anti-CD45 und Propidiumjodid zur Vorbereitung der Analyse per Durchflusszytometrie fort. Nach der Färbung der Zellen die Röhrchen vor Licht geschützt auf Eis lagern, bis die Durchflusszytometrie-Analyse durchgeführt wird. Bereiten Sie die Durchflusszytometrie vor, indem Sie sicherstellen, dass die Laser des Geräts justiert sind und es für das Zellsortieren eingerichtet ist.Das verwendete Gerät muss mit blauen 488 Nanometer, roten 635 Nanometer und UV-Lasern im Bereich von 350 bis 355 Nanometer ausgestattet sein sowie über zwei Detektoren auf dem UV-Laserstrahlengang mit blauen 45&nbsp;über&nbsp;65- und roten 675&nbsp;über&nbsp;50-Filtern verfügen. Zusätzlich muss der UV-Rot-Detektor eine hohe Empfindlichkeit für das rote Signal aufweisen, und das Gerät muss mit einer Kühleinheit ausgestattet sein, um die Probe bei 10&nbsp;Grad&nbsp;Celsius zu halten. Richten Sie in der Gerätesoftware Histogrammplots ein, um lineare Vorwärtsstreuung gegen Seitwärtsstreuung darzustellen, sowie einen Doublettdiskriminierungsplot, der für das Gerät geeignet ist.Ein Histogramm-Plot von PI mit einem logarithmischen Signal, ein Rot gegen Blau-Plot mit linearen Signalen und ein Histogramm-Plot von CD45 APC mit einem logarithmischen Signal. Sobald das Gerät bereit ist, geben Sie die angefärbte Knochenmarkprobe in die Ladeöffnung des Geräts ein. Diese Probe dient als Kontrolle für die Färbung und die Geräteeinstellung.Beginnen Sie mit der Erfassung von Ereignissen und passen Sie die linearen Signale des Vorwärtsstreulichts an. Um die Zellpopulation deutlich sichtbar zu machen, sollten sich die Zellen ungefähr im unteren Zentrum des Diagramms befinden, wobei die Vorwärtsstreuung auf der x-Achse dargestellt ist. Da der Kernfarbstoff PI membranimpermeant ist, wird er von lebenden Zellen ausgeschlossen.Zeichnen Sie ein Gatter für den Gating-Bereich auf die PI-positiven toten Zellen im PI-Histogramm. Weisen Sie die Gerätesoftware an, die toten Zellen in diesem Gatter rot zu färben.Es ist hilfreich, die farblich markierten, durchlässigen toten Zellen als Orientierungshilfe zu verwenden, um die Wirtspopulation in der G0/G1-Phase zu identifizieren. Die PI-Färbung wird ebenfalls durch den UV-Laser angeregt, und der Großteil der toten Zellen sollte über Skala liegen. Auf der rechten Seite des Plots der roten versus blauen Hoecsht-Fluoreszenz sollte die G0/G1-Population des Knochenmarks als enger Cluster von Ereignissen im Plot der roten versus blauen Hoecsht-Fluoreszenz sichtbar sein.Stellen Sie die Detektorspannungen so ein, dass der G0-G1-Cluster in der oberen rechten Bildmitte angezeigt wird. Ein Teil der S-Phase und die gesamte G2-Phase des Zellzyklus können außerhalb der Skala liegen. In der oberen rechten Ecke des Plots mit rot gegen blau dargestellten Daten ist die Side-Population mit niedriger Intensität als Ausläufer von der linken Seite des G0-G1-Clusters bis in die untere linke Ecke des Plots zu erkennen.Zeichnen Sie nun ein Tor um den Zellcluster im FSC-SSC-Diagramm. Stellen Sie die im Dublett-Diagramm identifizierte Einzelzellenpopulation und die lebenden Zellen im PI-Histogramm dar. Weisen Sie anschließend dem Hoax-Diagramm zu, nur diese torgefilterten Populationen anzuzeigen.Nachdem der Host-Plot ausgewählt wurde, zeichnen Sie einen Bereich um die Side-Population. Weisen Sie diesen Bereich als Gate dem CD45-APC-Histogramm zusammen mit den Gates für Streulicht-Singuletts und lebende Zellen zu. Nachdem das System eingerichtet ist, nehmen Sie die Probe vom Ladeanschluss und setzen die Lungenprobe in den Ladeanschluss ein.Die Instrumenteneinstellungen sollten für diese Probe nicht erneut angepasst werden müssen. Beginnen Sie mit der Erfassung von Ereignissen im Rot-gegen-Blau-Hoax-Diagramm. Der G0/G1-Cluster für die Lungenprobe erscheint gewöhnlich stärker länglich in Richtung der x-Achse und ähnelt dem Tilde-Symbol auf einer Tastatur.Die Seitenpopulation Gait Hoax Low sollte sich in einer ähnlichen Position befinden wie die für die Knochenmarkprobe eingestellte. Geringfügige Anpassungen nach oben oder unten können erforderlich sein, um eine scharfe Auflösung der Seitenpopulation sicherzustellen. Halten Sie während des Sortierens einen niedrigen Druckunterschied aufrecht, indem Sie sicherstellen, dass das Probendurchflussventil nicht zu weit geöffnet wird.Als Nächstes zur Isolierung von MSC eine 96-Loch-Sammelplatte in die Sortierkammer stellen und die Sortiertore im CD45-APC-Histogramm einstellen, um positive und negative Populationen zu trennen. Schließlich die Zellen entweder als gemischte Population in ein Reagenzglas oder als Einzelzellen zur Isolierung von Klonen in eine 96-Loch-Platte sammeln. Nach der Sammlung der Lungen-MSC durch Zellsortierung werden die Zellen in 30-Millimeter-Dishs mit MEM ergänzt durch 20 % FBS ausplattiert. Zunächst erscheinen sortierte Zellen klein, rund und hell, nach ungefähr zwei bis drei Wochen.Kolonien mit dem mesenchymalen Phänotyp werden sichtbar und die Proliferation ist bei jeder Zellpräparation deutlicher. Beurteilen Sie die Fähigkeit der lungenspezifischen mesenchymalen Stromazellen (MSC), sich in die klassischen mesenchymalen Linien von Osteoblasten, Adipozyten und Chondrozyten zu differenzieren, sowie deren Oberflächenexpression etablierter mesenchymaler Marker. Führen Sie eine zytogenetische Bandenanalyse durch, um das Fehlen grober chromosomaler Abnormalitäten zu bestätigen.Nach der Isolierung mittels Durchflusszytometrie und der Erzeugung von Einzelzellklonen wird ein Koloniebildungsassay durchgeführt, um die MSC-Zellen und ihre Differenzierungsfähigkeit zu charakterisieren. Beginnen Sie mit Zellen, die auf drei mal 10 hoch vier Zellen pro Milliliter verdünnt wurden. In unvollständigem Kulmedium in 100-Millimeter-Dishs erfolgt eine serielle Verdünnung mit zwei mal 10 hoch vier, drei mal 10 hoch vier, 1,5 mal 10 hoch vier und 0,75 mal 10 hoch vier Zellen pro Dish in 10 Milliliter Medium, jeweils im Dreifachansatz.Danach die Platten nach 10 Tagen Kultur in den Inkubator stellen, das Medium abgießen und die Zellen mit PBS spülen. Anschließend fixieren, indem 100 % Methanol für fünf Minuten bei Raumtemperatur hinzugefügt wird. Nach fünf Minuten das Methanol abgießen.Dann zur Detektion der Koloniebildung 0,4 % Gewicht pro Volumen GZA, verdünnt im Verhältnis 1 zu 20 mit ionisiertem Wasser, hinzufügen und 10 bis 15 Minuten inkubieren. Anschließend die Färbung abgießen und mit ionisiertem Wasser spülen. Die Proben lufttrocknen lassen und die Anzahl der Kolonien mit mehr als 25 Zellen pro Kolonie mithilfe eines invertierten Mikroskops oder einer Visualisierung quantifizieren.Die Kolonien sind groß und bestehen aus einigen hundert Zellen, wie hier gezeigt, und weisen ein mesenchymales Phänotyp auf. Die MSCs wurden wie in diesem Video dargestellt isoliert und in 96-Well-Platten zur simulierten Vermehrung ausplattiert. Anschließend wurden die arrestierten, mit CFSE markierten antigenpräsentierenden Zellen den Lungen-MSCs hinzugefügt.Die Proliferation isolierter MSCs wurde anschließend als Abnahme der mittleren Fluoreszenzintensität von CFSE im Vergleich zum Hintergrund gemessen, wobei der Hintergrund allein CFSE-markierte T-Zellen darstellte, wie in dieser Abbildung gezeigt, in Abwesenheit von Lungen-SZ und in Gegenwart von antigenpräsentierenden Zellen. A PC mit und ohne Ovoalbumin CD40-positive effektorische T-Zellen zeigen eine Abnahme der CFSE-Intensität, was eine Proliferation anzeigt, hervorgehoben durch rote Kreise. Die CFSE-Fluoreszenzintensität der T-Zellmembran nimmt bei jeder Zellteilung ökonomisch ab, d. h. die Hälfte pro Teilung. In Gegenwart von Lungen-M-S-C-A-P-C mit und ohne OVA zeigen CD40-positive beeinflusste T-Zellen keine signifikante Änderung der CFSE-Intensität, was auf einen Mangel an Proliferation nach ihrer Entwicklung hinweist. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der Lungen-Stammzellbiologie den Weg, um die Rolle mesenchymaler Stammzellen bei Lungenerkrankungen wie pulmonaler arterieller Hypertonie und pulmonaler Fibrose zu untersuchen.Wenn die Technik einmal beherrscht ist, kann sie in etwa fünf Stunden nach dieser Anleitung durchgeführt werden. Andere Methoden wie Differenzierungsassays können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, beispielsweise, ob die putativen mesenchymalen Stammzellen der Lunge eine geeignete multiliniale Differenzierung in Knochen-, Fett- und Knorpelgewebe aufweisen.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

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