Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per analisi modifica dinamica Histone nell'espressione genica attivata nelle cellule umane

L'esperimento del chip viene utilizzato per monitorare i cambiamenti dinamici nelle modificazioni istografiche che si verificano durante le alterazioni dell'espressione genica attivate da STAT uno nell'occupazione dei fattori di trascrizione, dei complessi che modificano gli istoni e del macchinario di trascrizione stesso possono essere analizzati in questo modo. Per iniziare il saggio, le cellule vengono indotte con l'interferone gamma ad attivare la segnalazione STAT, il cross-linking delle cellule con la formaldeide e la loro raccolta, procede quindi all'isolamento del nucleo e alla sonicazione, che taglia la cromatina in circa 200-1000 frammenti di coppie di basi. Successivamente, aggiungi un anticorpo che prende di mira la proteina o l'istomodificazione di interesse e quindi precipita gli immunocomplessi.

Gli immunocomplessi vengono lavati, i legami incrociati vengono invertiti e il DNA viene purificato. I cambiamenti nelle modifiche istografiche o nel reclutamento di proteine in aree specifiche di un gene possono essere determinati sulla base dell'analisi PCR quantitativa in tempo reale del DNA immunoprecipitato. Ciao, mi chiamo Lauren Borow del laboratorio della dottoressa Melissa Hendrickson e del Dipartimento di Biologia dell'Università della Virginia.

Oggi vi mostreremo una procedura per l'immunoprecipitazione della cromatina. Utilizziamo questa procedura nel nostro laboratorio per studiare le modificazioni dinamiche dell'istografia che si verificano durante la trascrizione a valle della segnalazione STAT 1. Quindi iniziamo.

Un giorno prima di iniziare questa procedura, coltivare la cellula in modo che sia disponibile un numero sufficiente per le due cellule FTGH utilizzate qui. Preparare una piastra per coltura tissutale da 15 centimetri con una fluidità dell'80% di co per ogni saggio su chip. In ogni esperimento includere un controllo IgG negativo, un controllo anticorpale pan istone positivo e duplicati.

Per iniziare questa procedura, rimuovere il terreno di coltura. Sostituiscilo con 20 millilitri di DMEM integrato con il 10% di siero cosmico di vitello e contenente interferone gamma a cinque nanogrammi per millilitro. Inoltre, sostituire il terreno sulle piastre non indotte con 20 millilitri di C-C-S-D-M-E-M. al 10%.

Successivamente lavorare in una cappa aspirante. Inclinare la piastra di coltura tissutale da 15 centimetri e aggiungere 540 microlitri di una soluzione di formaldeide al 37% a 20 millilitri di terreno. Quindi scuoti il piatto per distribuirlo uniformemente.

Lasciare che la reticolazione percepisca i 10 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere glicina alla concentrazione finale di 125 millimolari per fermare la reazione di reticolazione. Aspirare sotto vuoto il terreno e lavare le cellule una volta con 10 millilitri di PBS ghiacciato utilizzando un raschietto per cellule, raccogliere le cellule in circa sette millilitri di PBS e combinare le cellule che sono state trattate in modo identico da sei piastre da 15 centimetri in un tubo conico da 50 millilitri su ghiaccio.

Infine, centrifugare le cellule raccolte a 1.800 giri/min per cinque minuti a quattro gradi Celsius e aspirare il PBS. Se ti fermi qui, fai uno scatto, congela la tavolozza delle celle e conservala a meno 80 gradi Celsius dopo la reticolazione. Il passo successivo è la preparazione della cromatina.

Inizia aggiungendo un millimolare DTT e inibitori completi della proteasi al tampone di rigonfiamento raffreddato su ghiaccio. Sospendere il pellet da sei piastre, aspirare quattro millilitri del tampone di rigonfiamento e trasferirlo in un tubo conico da 15 millilitri. L'uso di più o meno buffer potrebbe modificare l'efficienza del ballo.

Incubare la sospensione cellulare su ghiaccio per 10 minuti. Al termine dell'incubazione su ghiaccio, trasferire la sospensione in un deprimente pre-raffreddato da 15 millilitri e ballare. 20 colpi con PE A dopo la danza, trasferire le celle in un tubo conico da 15 millilitri su una centrifuga di ghiaccio a 2.500 giri/min per cinque minuti a quattro gradi Celsius e scartare il surnatante lasciando il pellet nucleare.

Aggiungere inibitori completi della proteasi al tampone di sonicazione raffreddato su ghiaccio. Sei piastre producono circa 200 microlitri di pellet nucleare Resus. Sospendere il pellet in 15 volumi di pellet o tre millilitri del tampone di sonicazione.

L'utilizzo di un volume diverso per questa quantità di celle potrebbe modificare l'efficienza della sonicazione. L'efficienza di sonicazione deve essere determinata in anticipo per l'atorator del laboratorio. Qui viene utilizzato un Miss Sonic sonicate 3000 dotato di microchip.

Sonicare la sospensione dei nuclei sul ghiaccio per 10 cicli per 20 secondi di accensione e 40 secondi di spegnimento con un'impostazione di ampiezza di otto. Ciò si traduce in genere in frammenti di cromatina di dimensioni medie da 200 a 1000 paia di basi quando la sonicazione è completa. Trasferire il materiale sonicato in una provetta da centrifuga SS 34 e centrifugare a 13.000 giri/min per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

In un rotore SS 34 per pellettare i detriti della cella, che di solito è una piccola quantità. Trasferire con cura il supinato in un tubo conico da 15 millilitri con ghiaccio. Procedere con il chip per ridurre lo sfondo da eventi di associazione non specifici.

Innanzitutto, pre-eliminare la preparazione della cromatina aggiungendo 360 microlitri di semiolio di perle di DNA di sperma di salmone A o G e agitare per quattro gradi Celsius per almeno 30 minuti. Centrifugare a 1000 giri/min per cinque minuti a quattro gradi Celsius per pellettare le perle di agro. Quindi trasferire la natina supina pre-chiarita in un altro tubo conico da 15 millilitri su ghiaccio.

Successivamente, misurare l'assorbanza di 260 nanometri o le unità A 260 della cromatina. Diluire 10 microlitri di cromatina preclusiva in 190 microlitri di acqua bidistillata. Per il grezzo, combinare 10 microlitri di tampone di sonicazione con 190 microlitri di acqua distillata doppia.

Regolare il volume del campione con il tampone di sonicazione su quattro unità A 260. Conservare 75 microlitri di cromatina pre-chiarita a quattro e due 60 unità come campione di input e conservare a meno 20 gradi Celsius fino al momento di invertire i collegamenti incrociati. Ricorda che questo passaggio è fondamentale per l'analisi dei dati.

Quindi non trascurare di prendere l'aliquota in ingresso, erogare la preparazione di cromatina rimanente in aliquote da un millilitro in micro provette di rifiuto da 1,7 millilitri su ghiaccio. Se ti fermi qui, scatta. Congelare la cromatina preparata su ghiaccio secco e conservarla a meno 80 gradi Celsius.

Tuttavia, poiché la cromatina immagazzinata può degradarsi, è meglio continuare con l'ip. Ora aggiungi gli anticorpi di grado chip ai set di campioni indotti e non indotti. In duplicato.

In genere uno o due microgrammi di anticorpi funzionano bene, ma la quantità deve essere determinata empiricamente in anticipo. Aggiungere due microgrammi di IgG e 15 microlitri di pan istone H tre anticorpi come controlli negativi e positivi ai set di campioni indotti e non indotti. Inoltre, agitare tutte le provette durante la notte a quattro gradi Celsius prima di procedere all'isolamento degli immunocomplessi dopo l'incubazione notturna con gli anticorpi.

Aggiungere 60 microlitri di proteina A del DNA dello sperma di salmone o di liquame di perle di proteina giro a tutte le provette. Razzo a quattro gradi Celsius per almeno 60 minuti. Per legare gli immunocomplessi alle perline.

Pellettare delicatamente i complessi immunologici legati alle perle di agros a 2000 giri/min per tre minuti a quattro gradi Celsius per aspirare il surnatante. Successivamente, eseguire una serie di lavaggi tampone, iniziando con un lavaggio a basso contenuto di sale seguito da un lavaggio ad alto contenuto di sale. Quindi lavaggio con cloruro di litio.

E infine, due lavaggi TE su ciascuno dei tamponi di lavaggio. Aggiungere PMSF appena prima dell'uso, lavare con un millilitro di tampone per 10 minuti con oscillazione a quattro gradi Celsius, micro per tre minuti a 2000 giri/min a quattro gradi Celsius e aspirare il surnatante, mantenendo i campioni freschi su ghiaccio. Dopo aver rimosso il lavaggio finale del tampone del tè, aggiungere 500 microlitri di tampone Lucian appena preparato al vortice di perline per mescolare le perle di aros nel tampone Lucian e scaldare per 30 minuti a 65 gradi Celsius.

Agitando ogni 10 minuti mentre i campioni sono in eluizione, scongelare i campioni in ingresso e aggiungere 500 microlitri di tampone di eluizione a ciascuno di essi. Includere questi esempi in tutti i passaggi futuri. Una volta terminati i campioni, la microfusione di incubazione a 65 gradi Celsius per 30 secondi a 2000 giri/min e trasferire l'EENT in una nuova provetta per micro fuge.

Infine, invertire la reticolazione. Aggiungere cinque molari di cloruro di sodio a una concentrazione finale di 200 millimolari su tutti i campioni e incubatrice a vortice a 65 gradi Celsius per almeno quattro ore fino a tutta la notte. Una volta invertiti i legami incrociati degli immunocomplessi, il DNA legato può essere recuperato quando l'incubazione a 65 gradi Celsius è completa.

Micro fuge campiona per 30 secondi. Per raccogliere la condensa sui coperchi, aggiungere un microlitro di RNA A a ciascuna provetta e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti dopo il trattamento con RNA in ciascuna provetta a 10 microlitri di EDTA 0,5 molare, 40 microlitri di 0,5 molo tris cloruro pH 6,5 e due microlitri di proteinasi K o un totale di 52 microlitri da una miscela master e incubare a 45 gradi Celsius per 60 minuti. Estrarre i campioni con fenolo cloroformio, alcol iso-aile e poi con cloroformio ISO A mio alcol.

Quindi, per precipitare il DNA, aggiungere due microlitri di glicogeno e 0,1 volumi di acetato di sodio a tre molari. pH 5,2 a ciascun campione e vortice, aggiungere 2,5 volumi di vortice di etanolo al 100% e incubare a meno 20 gradi Celsius durante la notte. Recupera i campioni e i micro rifiuti a 13.000 giri/min per 20 minuti a quattro gradi Celsius.

Lavare i pellet di glicogeno DNA con un millilitro di etanolo al 70% e aria. Asciugare il pellet o utilizzare una centrifuga sottovuoto a velocità rapida. Non asciugare eccessivamente il DNA, risospendere i pellet in 200 microlitri di tampone TE e quantificare non più di un microlitro in tempo reale.

La PCR mostrata qui è il risultato di un esperimento su chip che segue la dinamica di H tre K 36 ME tre. Durante l'induzione dell'interferone gamma dell'IRF, un gene H tre K 36 ME 3 anticorpi tre è stato utilizzato per ridurre la cromatina raccolta da due cellule FTGH indotta con interferone gamma per 30 minuti, 1,5 ore e cinque ore con IgG come controllo negativo. In questi punti è stata determinata anche l'occupazione di STAT 1, così come l'occupazione della RNA polimerasi 2.

L'occupazione degli istoni nel locus del gene IRF one è stata determinata per le condizioni indotte e indotte dall'UN utilizzando l'anticorpo pan istone 3, che funge anche da controllo positivo. Il calo intorno a meno cinque paia di basi è dovuto alla deplezione del nucleosoma che si trova nei siti di inizio della trascrizione. Vi abbiamo appena mostrato la procedura per l'immunoprecipitazione della cromatina.

Questo test è utile per osservare le modificazioni della cromatina che si verificano durante la trascrizione genica attivata. Quando si esegue questa procedura, è importante elaborare la procedura di taglio della cromatina con l'ator prima di iniziare un esperimento con il chip. Ricordate anche di prelevare i campioni di input.

Quindi questo è tutto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.