Name: Lapproccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T21:00:00.000+00:00
Duration: 24 min 2 s
Description: Scopri l'approccio ChroP per la proteomica cromatinica locus-specifica, che combina ChIP e spettrometria di massa ad alta risoluzione. Questo metodo permette di analizzare le modificazioni istoniche e le interazioni proteiche.

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Questa ricerca è stato originariamente pubblicato in Mol Proteomica cellulari. Soldi M. Bonaldi T. La Proteomica Indagine della cromatina domini funzionali rivela Nuove sinergie tra distinte Eterocromatina Componenti MCP. 2013; 12: 64-80. © Società Americana per la Biochimica e Biologia Molecolare. Ringraziamo Roberta Noberini (Istituto Italiano di Tecnologia e IEO, Italia) per la lettura critica del manoscritto. Lavoro TB è sostenuto da finanziamenti della Fondazione Armenise-Harvard Career Development Program Giovanni, l&#39;Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro e il Ministero della Salute italiano. Lavoro MS è stato sostenuto da una borsa di studio FIRC.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo recentemente descritto ChroP, una strategia quantitativa per la caratterizzazione su larga scala dei componenti proteici della cromatina. ChroP combina due approcci complementari utilizzati in campo epigenetico, Chip e MS, approfittando loro punti di forza e superando i rispettivi limiti. ChIP accoppiato al sequenziamento profondo (ChIP-Seq) consente la mappatura genoma di modificazioni degli istoni alla risoluzione di alcune nucleosomi 35. Pur vantaggiosa per la loro sensibilità, saggi basati su anti...

Cromatina è un complesso nucleoproteina altamente dinamico che è coinvolto come modello primario per tutti i processi di DNA-mediata. Il nucleosoma è l&#39;unità ripetuta di base della cromatina e costituito da un nucleo octameric proteica contenente due molecole di ciascun istone H2A canonica, H2B, H3 e H4, attorno al quale 147 bp di DNA sono avvolte 1,2. Tutti gli istoni fondamentali sono strutturati come un dominio globulare e flessibile N-terminale &quot;coda&quot; che sporge al di fuori del nucleosoma. Uno dei principali meccanismi di regolazione della struttura della cromatina e la dinamica si basa su covalenti modificazioni post-traduzionali (PTM), che si verificano principalmente sulla N-terminali degli istoni 3,4. Modificazioni degli istoni possono funzionare alterando la struttura superiore ordine cromatina, cambiando contatti tra istoni-DNA o tra nucleosomi, e controllando così l&#39;accessibilità di DNA-binding proteine ​​(meccanismi cis), o agendo come DockInSiti g di proteine ​​regolatrici, sia come unità singole o incorporati in complessi multimerici. Tali proteine ​​regolatrici possono esercitare la loro funzione in modi diversi: modulando direttamente l&#39;espressione genica (pe proteine ​​TAF), o alterando il posizionamento nucleosoma (cioè cromatina rimodellamento complessi) o modificando altri residui istoni (ad esempio proteine ​​con metil-transferasi o acetil- attività transferasi) (meccanismi trans) 5. L&#39;osservazione che distinto PTM modelli cluster alla specifica loci cromatina portato all&#39;elaborazione della ipotesi che diverse modifiche al sito di distinte possono sinergizzare per generare un codice molecolare mediare lo stato funzionale del DNA sottostante. Il &quot;codice dell&#39;istone ipotesi&quot; ha ottenuto grandi consensi negli anni, ma la sua verifica sperimentale è stata frenata da limiti tecnici 6,7. Proteomica basati su spettrometria di massa (MS) è emerso come unpotente strumento per mappare i modelli modificazione degli istoni e caratterizzare-cromatina proteine ​​che legano 8. MS rileva un cambiamento come Δmass specifico tra la massa sperimentale e teorica di un peptide. A livello di singoli istoni, MS fornisce un metodo imparziale e completa per mappare PTM, consentendo l&#39;individuazione di nuove modifiche e il loro concatenamento rivelando tra loro 9-14. Negli ultimi anni, una serie di strategie sono state sviluppate per sezionare la composizione proteomica di cromatina, compresa la caratterizzazione della intatte cromosomi mitotici 15, l&#39;identificazione di solubili Hptm-binding proteins 16-18 e l&#39;isolamento e l&#39;analisi di specifiche regioni della cromatina (ossia telomeri) 19,20. Tuttavia, l&#39;indagine delle sinergie specifico locus tra PTM degli istoni, le varianti, e proteine ​​della cromatina associate è ancora incompleto. Qui, descriviamo un nuovo approccio, denominato ChroP (CHRO matin P roteomics) 21, che abbiamo sviluppato per caratterizzare in modo efficiente i domini di cromatina funzionalmente distinte. Questo approccio si adatta immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), un protocollo ben consolidata utilizzati nella ricerca epigenetica, per l&#39;efficace analisi proteomica basata su MS del campione arricchito. Abbiamo sviluppato due protocolli diversi, a seconda del tipo di cromatina utilizzato come ingresso e la domanda indirizzata da MS; in particolare: 1) circuito integrato di unfixed cromatina nativa digerito con MNase è impiegato per purificare mono-nucleosomi ed a sezionare le hPTMs co-associano (N-ChroP); 2) circuito integrato di cromatina reticolato frammentata mediante sonicazione è usato in combinazione con una strategia basata intergenomica SILAC-caratterizzare tutti co-arricchimento proteine ​​(X-ChroP) vincolante cromatina. Illustriamo qui la combinazione di N-e X-ChroP per l&#39;arricchimento e lo studio eterocromatina, utilizzando H3K9me3 come esca per i passi immunoprecipitazione. L&#39;uso di ChroP può essere estesostudiare sia le regioni distinte su cromatina, o cambiamenti nella composizione della cromatina all&#39;interno della stessa regione durante la transizione a uno stato funzionale diversa, aprendo così la strada a varie applicazioni in epigenetica.

<table><tbody><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>SILAC DMEM</td><td>M-Medical</td><td>FA30E15086</td><td></td></tr><tr><td>Dializzato FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26400-044</td><td></td></tr><tr><td>Lisina 0 (12C6 14N2 L-lisina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>Arginina 0 (12C6 14N4 L-arginina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6969</td><td></td></tr><tr><td>Lisina 8 (13C6 15N2 L-lisina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68041</td><td></td></tr><tr><td>Arginina 10 (13C6 15N4 L-arginina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease Roche</td><td></td><td>10 107 921 001</td><td></td></tr><tr><td>Compresse da cocktail complete di inibitori della proteasi senza EDTA Roche</td><td></td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo per dialisi Spectra/Por 3, 3,5K MWCO, larghezza piatta 18 mm, lunghezza</td> <td>50 piediSpectrumlabs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione PCR QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histone H3 tri-metilato K9-ChIP grado</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>Histone H3 peptide tri-metil K9&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab1773</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads proteina G</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12%&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Bis-Tris Gel&nbsp;</td><td>Kit</td> di colorazione blu colloidale <td>Invitrogen NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>LDS Sample Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Formaldheyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Aceti anidride-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175641-1G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetammide &ge; 99% (HPLC), cristallino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina modificata di grado di sequenziamento, congelata 100 &mu; g (5 &volte; 20 &mu; g)</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Nanospray OD 360&mu; m x ID 75&mu; m, punte ID 8 &mu; m non rivestito Pk 5</td><td>Microcolumn Srl</td><td>FS360-75-8-N-5-C15</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 &micro; m&nbsp; &nbsp; 15% C Dr</td><td>. Maisch GmbH</td><td>r13.aq.</td><td></td></tr><tr><td>Disco di estrazione del carbonio, 47 mm</td><td>Agilent Technologies</td><td>12145040</td><td></td></tr><tr><td>Disco di estrazione del catione</td><td>Agilent Technologies</td><td>66889-U</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;approccio chrop combina chip e spettrometria di massa a sezionare locus-specifiche proteomica paesaggi della cromatina

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Cromatina è un complesso nucleoproteina altamente dinamico fatto di DNA e proteine ​​che controlla vari processi DNA-dipendente. Struttura della cromatina e la funzione in regioni specifiche è regolato dalla arricchimento locale della istone post-traslazionale modifiche (hPTMs) e varianti, proteine ​​della cromatina vincolanti, compresi fattori di trascrizione, e la metilazione del DNA. La caratterizzazione proteomica di composizione cromatina in corrispondenza di zone funzionali distinti è stata finora ostacolata dalla mancanza di protocolli efficienti per arricchire tali domini alla purezza e quantità appropriata per la successiva analisi approfondita da spettrometria di massa (MS). Descriviamo qui una strategia proteomica cromatina di nuova concezione, denominato ChroP (cromatografia matin P roteomics), per cui un immunoprecipitazione della cromatina preparativa è utilizzato per isolare le regioni della cromatina distinte le cui caratteristiche, in termini di hPTMs, varianti e co-associati proteine ​​non istoniche, sono analizzati da MS. Illustriamo luire la creazione di ChroP per l&#39;arricchimento e l&#39;analisi delle regioni heterochromatic trascrizionalmente silenti, caratterizzato dalla presenza di tri-metilazione della lisina 9 su istone H3. I risultati ottenuti dimostrano il potenziale di ChroP in fondo caratterizzare il proteoma eterocromatina e dimostrare come una strategia analitica potente per comprendere come i determinanti proteici distinti di cromatina interagiscono e sinergizzare stabilire configurazioni strutturali e funzionali specifici locus.

Cromatina immunoprecipitazione è una potente tecnica utilizzata per profilare la localizzazione di una proteina o una modificazione degli istoni lungo il genoma. In un equivalente di proteomica, ChIP è seguito da proteomica basati su MS per identificare qualitativamente e quantitativamente le hPTMs, varianti istoniche e proteine ​​della cromatina vincolanti che sono immunoprecipitati con la modifica o la proteina di interesse, utilizzati come &quot;esca&quot;. Nell&#39;approccio N-ChroP, illustrato in Figura 1A,...

Combinando nativa e reticolazione cromatina immunoprecipitazione con alta risoluzione di Spettrometria di Massa, l&#39;approccio ChroP permette di sezionare il composito dell&#39;architettura proteomica delle modificazioni degli istoni, le varianti e le proteine ​​non istoniche Synergizing a domini di cromatina funzionalmente distinte.

L&#39;approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare la composizione proteomica di domini cromatinici funzionalmente distinti, al fine di comprendere come i diversi elementi agiscano in sinergia per determinare lo stato trascrizionale. Ciò viene realizzato innanzitutto preparando nuclei da cellule in coltura e digerendo la cromatina in frammenti di lunghezza ottimale mediante metodi enzimatici o meccanici. Il secondo passaggio consiste nel purificare un dominio funzionale distinto dalla cromatina totale tramite immunoprecipitazione, utilizzando anticorpi bersaglio diretti contro una specifica modificazione post-traduzionale degli istoni o contro una proteina nota per marcare in modo specifico la regione di interesse.Successivamente, le proteine cromatiniche immunopurificate vengono separate mediante elettroforesi SDS-PAGE e digerite direttamente nel gel prima della spettrometria di massa. Il passaggio successivo consiste nell'analisi mediante spettrometria di massa accoppiata a cromatografia liquida su uno strumento ad alta risoluzione. Infine, i dati grezzi della spettrometria di massa vengono analizzati mediante software specifico, seguita da un'ispezione manuale degli spett

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Interaction Analysis cromatina per tag Sequencing paired-End (Chia-PET) è un metodo...

Cromatina Analisi Interazioni con Tag Sequencing appaiati-End (Chia-PET) per la mappatura Interazioni cromatina e comprensione del regolamento Trascrizione

I progressi nella spettrometria di massa hanno permesso l'analisi ad alta velocità di espressione della proteina e la modifica in una miriade di tessuti. In combinazione con frazionamento subcellulare e modelli di malattia, di massa quantitativa spettrometria e bioinformatica può rivelare nuove proprietà nei sistemi biologici. Il metodo qui descritto analizza cromatina proteine ​​associate alla regolazione di malattie cardiache ed è facilmente applicabile ad...

Analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia

L'identificazione di molecole associate a specifiche regioni genomiche di interesse è necessaria per comprendere i meccanismi di regolazione delle funzioni di queste regioni. Questo protocollo descrive le procedure per eseguire l'imunoprecipitazione ingegnerizzata della cromatina mediata da molecole leganti il DNA (enChIP) per l'identificazione di proteine e RNA associati a una specifica regione genomica.

L&#39;isolamento di regioni genomiche specifici e l&#39;identificazione di molecole da Associated enChIP

Qui, descriviamo un protocollo di ChIP-sequenziamento high throughput ottimizzato e pipeline di analisi computazionali per la determinazione dei modelli di stato della cromatina genoma da tessuti tumorali congelati e linee cellulari.

Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore

Si tratta di un metodo per identificare nuove proteine che interagiscono con DNA loci target specifico, basandosi sull'acquisizione di sequenza-specifico della cromatina reticolato per analisi proteomica successive. Alcuna conoscenza pregressa potenziali proteine leganti, né modifiche di cella non sono necessari. Inizialmente sviluppato per il lievito, la tecnologia ora è stata adattata per cellule di mammifero.

Adattamento di ibridazione catturare delle proteine della cromatina associate per proteomica per cellule di mammifero

Cromatina loop gioca un ruolo significativo nella regolazione genica; Tuttavia, non ci sono stati nessun progressi tecnologici che consentono di modifica selettiva e reversibile della cromatina con passanti. Qui descriviamo un potente sistema per ri-organizzazione di cromatina ciclo usando CRISPR-dCas9 (CLOuD9), ha dimostrato di selettivamente e reversibilmente modulare l'espressione genica a mirati loci.

CRISPR-mediata di riorganizzazione della struttura della cromatina Loop

Questo articolo descrive un protocollo ChIP-Seq semiautomatico e microscalato di regioni del DNA associate a una specifica modificazione degli istoni (H3K27ac) utilizzando una piattaforma di gestione dei liquidi ChIP, seguita dalla preparazione della libreria utilizzando la tagmentazione. La procedura comprende la valutazione del controllo ai fini della qualità e della quantità e può essere adottata per altre modificazioni istoniche o fattori di trascrizione.

Una procedura ChIP-Seq semiautomatica per studi epigenetici su larga scala

CUT&amp;RUN e le sue varianti possono essere utilizzati per determinare l'occupazione proteica sulla cromatina. Questo protocollo descrive come determinare la localizzazione delle proteine sulla cromatina utilizzando uliCUT&amp;RUN a singola cellula.

Localizzazione del fattore a cella singola sulla cromatina utilizzando la scissione di input ultra-bassa sotto i bersagli e il rilascio utilizzando la nucleasi

Questo protocollo descrive il metodo Capture Hi-C utilizzato per caratterizzare l'organizzazione 3D di regioni genomiche mirate di dimensioni megabased ad alta risoluzione, compresi i confini dei domini topologicamente associati (TAD) e le interazioni cromatiniche a lungo raggio tra elementi regolatori e altri elementi di sequenza del DNA.

Decifrare l'organizzazione della cromatina 3D ad alta risoluzione tramite Capture Hi-C

Presentiamo un protocollo di colorazione e analisi per la microscopia di localizzazione a singola molecola della cromatina a tre colori (SMLM) che consente la mappatura riproducibile di eucromatina, eterocromatina e RNAP II per l'analisi spaziale. Questo protocollo consente un'efficiente marcatura multicolore in ambienti nucleari densi, inclusi bersagli associati alla cromatina, consentendo una rilevazione simultanea affidabile.

Un protocollo di microscopia a localizzazione di molecole singole multimarcatore per l'indagine della cromatina nell'ambiente nucleare denso

Scopri l'approccio ChroP per la proteomica cromatinica locus-specifica, che combina ChIP e spettrometria di massa ad alta risoluzione. Questo metodo permette di analizzare le modificazioni istoniche e le interazioni proteiche.

L'approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

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