Name: Lapproccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-11T21:00:00.000+00:00
Duration: 24 min 2 s
Description: Scopri l'approccio ChroP per la proteomica cromatinica locus-specifica, che combina ChIP e spettrometria di massa ad alta risoluzione. Questo metodo permette di analizzare le modificazioni istoniche e le interazioni proteiche.

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Questa ricerca è stato originariamente pubblicato in Mol Proteomica cellulari. Soldi M. Bonaldi T. La Proteomica Indagine della cromatina domini funzionali rivela Nuove sinergie tra distinte Eterocromatina Componenti MCP. 2013; 12: 64-80. © Società Americana per la Biochimica e Biologia Molecolare. Ringraziamo Roberta Noberini (Istituto Italiano di Tecnologia e IEO, Italia) per la lettura critica del manoscritto. Lavoro TB è sostenuto da finanziamenti della Fondazione Armenise-Harvard Career Development Program Giovanni, l&#39;Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro e il Ministero della Salute italiano. Lavoro MS è stato sostenuto da una borsa di studio FIRC.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo recentemente descritto ChroP, una strategia quantitativa per la caratterizzazione su larga scala dei componenti proteici della cromatina. ChroP combina due approcci complementari utilizzati in campo epigenetico, Chip e MS, approfittando loro punti di forza e superando i rispettivi limiti. ChIP accoppiato al sequenziamento profondo (ChIP-Seq) consente la mappatura genoma di modificazioni degli istoni alla risoluzione di alcune nucleosomi 35. Pur vantaggiosa per la loro sensibilità, saggi basati su anti...

Cromatina è un complesso nucleoproteina altamente dinamico che è coinvolto come modello primario per tutti i processi di DNA-mediata. Il nucleosoma è l&#39;unità ripetuta di base della cromatina e costituito da un nucleo octameric proteica contenente due molecole di ciascun istone H2A canonica, H2B, H3 e H4, attorno al quale 147 bp di DNA sono avvolte 1,2. Tutti gli istoni fondamentali sono strutturati come un dominio globulare e flessibile N-terminale &quot;coda&quot; che sporge al di fuori del nucleosoma. Uno dei principali meccanismi di regolazione della struttura della cromatina e la dinamica si basa su covalenti modificazioni post-traduzionali (PTM), che si verificano principalmente sulla N-terminali degli istoni 3,4. Modificazioni degli istoni possono funzionare alterando la struttura superiore ordine cromatina, cambiando contatti tra istoni-DNA o tra nucleosomi, e controllando così l&#39;accessibilità di DNA-binding proteine ​​(meccanismi cis), o agendo come DockInSiti g di proteine ​​regolatrici, sia come unità singole o incorporati in complessi multimerici. Tali proteine ​​regolatrici possono esercitare la loro funzione in modi diversi: modulando direttamente l&#39;espressione genica (pe proteine ​​TAF), o alterando il posizionamento nucleosoma (cioè cromatina rimodellamento complessi) o modificando altri residui istoni (ad esempio proteine ​​con metil-transferasi o acetil- attività transferasi) (meccanismi trans) 5. L&#39;osservazione che distinto PTM modelli cluster alla specifica loci cromatina portato all&#39;elaborazione della ipotesi che diverse modifiche al sito di distinte possono sinergizzare per generare un codice molecolare mediare lo stato funzionale del DNA sottostante. Il &quot;codice dell&#39;istone ipotesi&quot; ha ottenuto grandi consensi negli anni, ma la sua verifica sperimentale è stata frenata da limiti tecnici 6,7. Proteomica basati su spettrometria di massa (MS) è emerso come unpotente strumento per mappare i modelli modificazione degli istoni e caratterizzare-cromatina proteine ​​che legano 8. MS rileva un cambiamento come Δmass specifico tra la massa sperimentale e teorica di un peptide. A livello di singoli istoni, MS fornisce un metodo imparziale e completa per mappare PTM, consentendo l&#39;individuazione di nuove modifiche e il loro concatenamento rivelando tra loro 9-14. Negli ultimi anni, una serie di strategie sono state sviluppate per sezionare la composizione proteomica di cromatina, compresa la caratterizzazione della intatte cromosomi mitotici 15, l&#39;identificazione di solubili Hptm-binding proteins 16-18 e l&#39;isolamento e l&#39;analisi di specifiche regioni della cromatina (ossia telomeri) 19,20. Tuttavia, l&#39;indagine delle sinergie specifico locus tra PTM degli istoni, le varianti, e proteine ​​della cromatina associate è ancora incompleto. Qui, descriviamo un nuovo approccio, denominato ChroP (CHRO matin P roteomics) 21, che abbiamo sviluppato per caratterizzare in modo efficiente i domini di cromatina funzionalmente distinte. Questo approccio si adatta immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), un protocollo ben consolidata utilizzati nella ricerca epigenetica, per l&#39;efficace analisi proteomica basata su MS del campione arricchito. Abbiamo sviluppato due protocolli diversi, a seconda del tipo di cromatina utilizzato come ingresso e la domanda indirizzata da MS; in particolare: 1) circuito integrato di unfixed cromatina nativa digerito con MNase è impiegato per purificare mono-nucleosomi ed a sezionare le hPTMs co-associano (N-ChroP); 2) circuito integrato di cromatina reticolato frammentata mediante sonicazione è usato in combinazione con una strategia basata intergenomica SILAC-caratterizzare tutti co-arricchimento proteine ​​(X-ChroP) vincolante cromatina. Illustriamo qui la combinazione di N-e X-ChroP per l&#39;arricchimento e lo studio eterocromatina, utilizzando H3K9me3 come esca per i passi immunoprecipitazione. L&#39;uso di ChroP può essere estesostudiare sia le regioni distinte su cromatina, o cambiamenti nella composizione della cromatina all&#39;interno della stessa regione durante la transizione a uno stato funzionale diversa, aprendo così la strada a varie applicazioni in epigenetica.

<table><tbody><tr><td>DMEM&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE12-614F</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>SILAC DMEM</td><td>M-Medical</td><td>FA30E15086</td><td></td></tr><tr><td>Dializzato FBS</td><td>Invitrogen</td><td>26400-044</td><td></td></tr><tr><td>Lisina 0 (12C6 14N2 L-lisina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8662</td><td></td></tr><tr><td>Arginina 0 (12C6 14N4 L-arginina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6969</td><td></td></tr><tr><td>Lisina 8 (13C6 15N2 L-lisina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>68041</td><td></td></tr><tr><td>Arginina 10 (13C6 15N4 L-arginina)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>608033</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease Roche</td><td></td><td>10 107 921 001</td><td></td></tr><tr><td>Compresse da cocktail complete di inibitori della proteasi senza EDTA Roche</td><td></td><td>04 693 132 001</td><td></td></tr><tr><td>Tubo per dialisi Spectra/Por 3, 3,5K MWCO, larghezza piatta 18 mm, lunghezza</td> <td>50 piediSpectrumlabs</td><td>132720</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione PCR QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histone H3 tri-metilato K9-ChIP grado</td><td>Abcam</td><td>ab8898</td><td></td></tr><tr><td>Histone H3 peptide tri-metil K9&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab1773</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads proteina G</td><td>Invitrogen</td><td>100.04D</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12%&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Bis-Tris Gel&nbsp;</td><td>Kit</td> di colorazione blu colloidale <td>Invitrogen NP0335BOX</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>LC6025</td><td></td></tr><tr><td>LDS Sample Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>Formaldheyde</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Aceti anidride-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>175641-1G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94318-50ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetammide &ge; 99% (HPLC), cristallino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6125</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina modificata di grado di sequenziamento, congelata 100 &mu; g (5 &volte; 20 &mu; g)</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>Nanospray OD 360&mu; m x ID 75&mu; m, punte ID 8 &mu; m non rivestito Pk 5</td><td>Microcolumn Srl</td><td>FS360-75-8-N-5-C15</td><td></td></tr><tr><td>ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 &micro; m&nbsp; &nbsp; 15% C Dr</td><td>. Maisch GmbH</td><td>r13.aq.</td><td></td></tr><tr><td>Disco di estrazione del carbonio, 47 mm</td><td>Agilent Technologies</td><td>12145040</td><td></td></tr><tr><td>Disco di estrazione del catione</td><td>Agilent Technologies</td><td>66889-U</td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;approccio chrop combina chip e spettrometria di massa a sezionare locus-specifiche proteomica paesaggi della cromatina

The ChroP Approach Combines ChIP and Mass Spectrometry to Dissect Locus-specific Proteomic Landscapes of Chromatin

Cromatina è un complesso nucleoproteina altamente dinamico fatto di DNA e proteine ​​che controlla vari processi DNA-dipendente. Struttura della cromatina e la funzione in regioni specifiche è regolato dalla arricchimento locale della istone post-traslazionale modifiche (hPTMs) e varianti, proteine ​​della cromatina vincolanti, compresi fattori di trascrizione, e la metilazione del DNA. La caratterizzazione proteomica di composizione cromatina in corrispondenza di zone funzionali distinti è stata finora ostacolata dalla mancanza di protocolli efficienti per arricchire tali domini alla purezza e quantità appropriata per la successiva analisi approfondita da spettrometria di massa (MS). Descriviamo qui una strategia proteomica cromatina di nuova concezione, denominato ChroP (cromatografia matin P roteomics), per cui un immunoprecipitazione della cromatina preparativa è utilizzato per isolare le regioni della cromatina distinte le cui caratteristiche, in termini di hPTMs, varianti e co-associati proteine ​​non istoniche, sono analizzati da MS. Illustriamo luire la creazione di ChroP per l&#39;arricchimento e l&#39;analisi delle regioni heterochromatic trascrizionalmente silenti, caratterizzato dalla presenza di tri-metilazione della lisina 9 su istone H3. I risultati ottenuti dimostrano il potenziale di ChroP in fondo caratterizzare il proteoma eterocromatina e dimostrare come una strategia analitica potente per comprendere come i determinanti proteici distinti di cromatina interagiscono e sinergizzare stabilire configurazioni strutturali e funzionali specifici locus.

Cromatina immunoprecipitazione è una potente tecnica utilizzata per profilare la localizzazione di una proteina o una modificazione degli istoni lungo il genoma. In un equivalente di proteomica, ChIP è seguito da proteomica basati su MS per identificare qualitativamente e quantitativamente le hPTMs, varianti istoniche e proteine ​​della cromatina vincolanti che sono immunoprecipitati con la modifica o la proteina di interesse, utilizzati come &quot;esca&quot;. Nell&#39;approccio N-ChroP, illustrato in Figura 1A,...

Combinando nativa e reticolazione cromatina immunoprecipitazione con alta risoluzione di Spettrometria di Massa, l&#39;approccio ChroP permette di sezionare il composito dell&#39;architettura proteomica delle modificazioni degli istoni, le varianti e le proteine ​​non istoniche Synergizing a domini di cromatina funzionalmente distinte.

L&#39;approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

Chromatin is a highly dynamic nucleoprotein complex made of DNA and proteins that controls various DNA-dependent processes. Chromatin structure and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare la composizione proteomica di domini cromatinici funzionalmente distinti, al fine di comprendere come i diversi elementi agiscano in sinergia per determinare lo stato trascrizionale. Ciò viene realizzato innanzitutto preparando nuclei da cellule in coltura e digerendo la cromatina in frammenti di lunghezza ottimale mediante metodi enzimatici o meccanici. Il secondo passaggio consiste nel purificare un dominio funzionale distinto dalla cromatina totale tramite immunoprecipitazione, utilizzando anticorpi bersaglio diretti contro una specifica modificazione post-traduzionale degli istoni o contro una proteina nota per marcare in modo specifico la regione di interesse.Successivamente, le proteine cromatiniche immunopurificate vengono separate mediante elettroforesi SDS-PAGE e digerite direttamente nel gel prima della spettrometria di massa. Il passaggio successivo consiste nell'analisi mediante spettrometria di massa accoppiata a cromatografia liquida su uno strumento ad alta risoluzione. Infine, i dati grezzi della spettrometria di massa vengono analizzati mediante software specifico, seguita da un'ispezione manuale degli spettri per identificare e quantificare le modifiche istoniche e le proteine co-enriched, basandosi rispettivamente sul calcolo dell'abbondanza relativa del materiale immunoprecipitato rispetto al campione di input o sul rapporto SLAC e su esperimenti di competizione utilizzando peptide solubile come competitor dell'analita. Mediante CROP, è possibile ottenere informazioni sulle interazioni tra i modelli di modifiche istoniche e le loro variazioni, nonché sulle regioni cromatiniche specifiche e sulle interazioni nucleari reclutate di conseguenza, che agiscono tutte in modo coordinato.Per definire un profilo cromatinico specifico con effetto regolatorio sull'espressione genica, il principale vantaggio di crop rispetto ai metodi esistenti basati sullo screening in vitro di interazioni solubili o modificazioni istoniche, come ad esempio il saggio pull-down, consiste nella possibilità di studiare la composizione cromatinica di specifici loci in condizioni più native e meno artificiali, utilizzando peptide istonici o modelli di cromatina recostituiti. L'applicazione di crop può inoltre essere estesa ad altri sistemi modello o a studi dipendenti dal tempo.Ad esempio, possiamo utilizzare una coltura in una linea cellulare che risponde a determinate perturbazioni inducendo una risposta trascrizionale globale. A illustrare questa procedura sarà Monica Sodi, ricercatrice postdottorato nel mio laboratorio. I nuclei per la procedura con il chip N vengono preparati da campioni non marcati.Le cellule He A S3 utilizzano da uno a due volte 10 alla ottava cellule per esperimento. Per raccogliere le cellule, preparare quattro aliquote di cinque volte 10 alla settima cellule in provette da 50 millilitri e centrifugare a 340 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Lavare le cellule con PBS ghiacciato, scartare il soprannatante e risospendere.Sospendere ogni pellet cellulare in otto millilitri di tampone di lisi e trasferire in provette da 15 millilitri. Incubare per 10 minuti a quattro gradi Celsius su una ruota rotante. Successivamente, versare con attenzione ogni lisato cellulare su un cuscino di saccarosio e centrifugare in un rotore a braccio oscillante a 3.270 ×g per 20 minuti a quattro gradi Celsius per separare i nuclei dal citoplasma.Scartare i sovranatanti e lavare i pellet nucleari due volte nel ghiaccio. Utilizzare PBS freddo al secondo lavaggio. Raccogliere i nuclei in un unico tubo da 50 millilitri dopo aver scartato il sovranatante del secondo lavaggio.Risospendere il pellet nucleare in un millilitro di tampone di digestione. Dividere ogni campione in due aliquote da 500 microlitri e mantenere sul ghiaccio. Aggiungere a ciascuna aliquota cinque microlitri di MNA, corrispondenti a una concentrazione finale di 0,005 unità di enzima per microlitro di nuclei.Mescolare delicatamente e incubare a 37 gradi Celsius per 60 minuti. Aggiungere EDTA ad una concentrazione di un millimolare per arrestare la reazione e mantenere sul ghiaccio. Pellettizzare i nuclei digeriti mediante centrifugazione a 7.800 ×g a quattro gradi Celsius per 10 minuti.Trasferire i soprannatanti in due provette e conservare a quattro gradi Celsius. Questa è la frazione S1, che contiene la prima frazione solubile di cromatina costituita da mononucleosomi. Sospendere accuratamente i pellet in un millilitro di tampone di dialisi ed eseguire la dialisi per tutta la notte a quattro gradi Celsius in tre litri di tampone di dialisi, con agitazione delicata costante. Il giorno seguente, raccogliere il materiale dializzato e centrifugare a 7.800 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Trasferire il super natin in un nuovo tubo einor. Questa è la frazione S due, che migra in base ai nucleosomi a seconda del grado di digestione di M a. Conservare a quattro gradi Celsius prima dell'immunoprecipitazione.Verificare la qualità e l'efficienza della digestione di MN a mediante elettroforesi su gel agarosio e ispezione visiva della scala dei nucleosomi come mostrato in questo esempio: la frazione S1 è fortemente arricchita in mononucleosomi, mentre la frazione S2 contiene principalmente nucleosomi per l'immunoprecipitazione della cromatina. Aggiungere innanzitutto un volume di buffer di diluizione per ChIP alla frazione S1. Successivamente, aggiungere l'anticorpo specifico per la modificazione post-traduzionale degli istoni o per la proteina di interesse e incubare tutta la notte su un ruotatore a quattro gradi Celsius; procedere il giorno seguente.Isolare la cromatina utilizzando perline magnetiche accoppiate a proteina G. Aggiungere 100 microlitri di perline bloccate al campione di cromatina S uno e incubare su ruota rotante a quattro gradi Celsius per tre ore. Dopo tre ore.Centrifugare a 340 ×g per un minuto. Posizionare le provette eppendorf su un portaprovette magnetico per far sedimentare le perle. Conservare il soprannatante, ovvero il flusso passante contenente il nucleosoma non legato.Aggiungere tampone di lavaggio alle perle e incubare per cinque minuti a quattro gradi Celsius su un ruotatore prima della centrifugazione. Lavare le perle in questo modo un totale di quattro volte con concentrazioni crescenti di sale. Effettuare due lavaggi a 75 millimolare di cloruro di sodio, seguiti da un lavaggio a 125 millimolare e da un altro a 175 millimolare di cloruro di sodio per l'eluizione.Il cromatina precipitato con amino. Incubare le perle in 30 microlitri di buffer campione LDS integrato con 50 millimoli di dihi. Tre etolo per cinque minuti a 70 gradi Celsius.Le proteine coinvolte vengono successivamente separate mediante elettroforesi SDS-PAGE; per iniziare questa procedura, incrociare le cellule con formaldeide. Aggiungere formaldeide allo 0,75% alle cellule marcate con SLAC. Mescolare brevemente e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.Puntare il formaldeide aggiungendo glicina 125 millimolare e incubando per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, dividere le cellule in due o quattro aliquote di circa cinque volte 10 alla sette cellule per aliquota. Sciacquare le cellule tre volte con PBS freddo di ghiaccio dopo l'ultimo lavaggio.Eliminare i soprannatanti e conservare i pellet; risospendere ciascun pellet cellulare in 10 millilitri di buffer di lisi. Incubare per 10 minuti a quattro gradi Celsius con rotazione, quindi centrifugare a 430 ×g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Eliminare i soprannatanti e conservare i pellet nucleari.Dopo aver lavato i pellet nucleari con il buffer di lavaggio Resus, sospendere ciascun pellet nucleare in tre millilitri di buffer di incubazione per chip e mantenere sul ghiaccio per frammentare la cromatina mediante sonica in un biorottore refrigerato a 200 watt. Prelievo del 2% della cromatina sonificata e inversione del legame incrociato mediante incubazione a 65 gradi Celsius per un minimo di un'ora nel buffer di incubazione per chip.Questo è il materiale di partenza. Successivamente, il DNA viene estratto utilizzando un kit di purificazione PCR e la frammentazione della cromatina viene valutata mediante elettroforesi su gel agarosio per immunoprecipitare la cromatina cross-linkata. Aggiungere l'anticorpo scelto alla cromatina sonicata marcatata con isotopi leggeri e pesanti.Nel canale leggero, aggiungere un eccesso di piega del peptide solubile oltre al campione di anticorpo, sia leggero che pesante, in tre provette da microcentrifuga ciascuna e incubare tutta la notte a quattro gradi Celsius su una ruota rotante. Il giorno successivo, aggiungere 100 microlitri di perle magnetiche accoppiate a proteina G bloccate a ciascun campione di cromatina e incubare su una ruota rotante per tre ore a quattro gradi Celsius. Centrifugare a 340 volte G per un minuto. Posizionare le provette eppendorf nel supporto magnetico per far sedimentare le perle.Il surnatante è il flusso passante contenente nucleosomi non legati, che viene conservato per controlli successivi. Lavare le perle quattro volte con il buffer di lavaggio a concentrazioni crescenti di sale. Due lavaggi a 150 millimolare di cloruro di sodio seguiti da due lavaggi a 300 millimolare di cloruro di sodio.Incubare le perle per 25 minuti a 95 gradi Celsius e 30 microlitri di tampone di caricamento SDS-PAGE per eluire e de-crosslinkare le proteine immunoprecipitate. Infine, raccogliere in un unico campione gli EIT ed separare le proteine mediante SDS-PAGE prima della spettrometria di massa.Le istoni arricchiti dal NIP vengono digeriti per iniziare questa procedura. Vengono prelevate le fette di gel corrispondenti alle bande degli istoni core sulla gelatina acrilamide BIS CITRIS 4-12% colorata con kumasi colloide, quindi si procede alla decolorazione alternando acetonitrile al 50% in acqua distillata deionizzata con acetonitrile al 100% per ridurre le dimensioni del gel; una volta completamente decolorate, le porzioni di gel vanno essiccate in un centrifugo sotto vuoto.Aggiungere l'anidride acetica D sei, da uno a nove volumi per volume, in un litro di bicarbonato di ammonio e tre microlitri di acetato di sodio come catalizzatore ai frammenti di gel. Incubare per tre ore a 37 gradi Celsius con agitazione vigorosa. Ridurre il volume dei frammenti di gel in acetonitrile al 100% e quindi disidratarli per circa cinque minuti in un centrifugo sotto vuoto; successivamente, reidratare i frammenti di gel con acqua ghiacciata.Soluzione di tripsina a 100 nanogrammi per microlitro in bicarbonato di ammonio 50 millimolare, incubata tutta la notte a 37 gradi Celsius. La combinazione di modificazione chimica delle lisine mediante anidride acetica deuterata e digestione con tripsina genera un profilo di digestione in gel simile a quello di tipo RC; raccogliere i peptidi digeriti solubili in un nuovo tubo Eppendorf e lasciare essiccare i peptidi per circa un'ora. Riportare in sospensione i peptidi liofilizzati in acido acetico 0,5% e acido trifluoroacetico 0,1%, quindi desalare e concentrare i peptidi mediante cromatografia in fase inversa su colonna C18 a sandwich di carbonio e cromatografia a scambio ionico su microcolonne fatte a mano.Caricare il 50% dei peptidi sulla punta della fase C18 a sandwich di carbonio e il 50% sulla punta della fase SCX. Eluire i peptidi dalle punte SCX utilizzando 5% di idrossido di ammonio, 30% di metanolo e dalle punte C18 utilizzando 80% di acetonitrile, 0,5% di acido acetico. Infine, liofilizzare i peptidi eluiti e risospendere in acido formico 0,1% nell'approccio nativo di immunoprecipitazione della cromatina e taglio. La cromatina viene digerita con MNA come primo passaggio per purificare un dominio funzionale distinto dalla cromatina bulk.Il pannello a sinistra mostra un test MNA su piccola scala in cui il DNA viene risolto su un gel all'1% di agarosio dopo la digestione della cromatina con MNA a intervalli di tempo diversi. A destra è mostrata una digestione MNA su larga scala. Il DNA viene risolto su un gel all'1% di agarosio dopo 60 minuti di digestione della cromatina con MNA e dopo la separazione della frazione S1 contenente mononucleosomi dalla frazione S2 contenente polinucleosomi.Il cromatina digerito e arricchito in mononucleosomi viene incubato con un anticorpo che riconosce una specifica modificazione post-traduzionale delle istone. Ad esempio, la trimetilazione della lisina nove sull'istone H tre (K9me3), un marcatore del cromatina silente. Le proteine immunopurificate, insieme al campione iniziale di cromatina, vengono quindi separate mediante elettroforesi SDS-PAGE e la colorazione con Coomassie colloide rivela le istoni core H3, H4, H2A e H2B intorno e al di sotto della banda dei 17 chilodalton, con H3 e H2B che migrano insieme. Il confronto tra la quantità di trimetilazione della lisina nove su H3 presente nel flusso passante e nel campione iniziale indica che circa il 50% della regione di interesse è stato immunopurificato, escludendo il rischio di un bias dovuto all'arricchimento di una sottopopolazione minore di cromatina.Questo istogramma rappresenta la media più o meno SEM ottenuta da tre esperimenti indipendenti per ciascuna modificazione. La spettrometria di massa MS viene quindi impiegata per caratterizzare le modificazioni post-traduzionali associate ai nucleosomi arricchiti. Tutte le modificazioni post-traduzionali delle istoni vengono verificate mediante ispezione manuale degli spettri ms ms corrispondenti in questi spettri Ms m Ms rappresentativi ottenuti mediante frammentazione CID. Le serie di ioni B e Y permettono di definire la sequenza del peptide H tre nove da 17 a 17 e la localizzazione della trimetilazione sul residuo di lisina nove. La quantificazione senza etichetta viene effettuata costruendo innanzitutto il cromatogramma degli ioni estratti o XIC per ciascun peptide modificato in base al valore massa/carica e calcolando l'area sotto la curva o a UC per ciascun picco.Successivamente, l'abbondanza relativa dei diversi gradi di metilazione della lisina nove nel peptide H three nine to 17 viene stimata dividendo l'AUC di ciascun peptide modificato per la somma delle aree corrispondenti a tutte le forme osservate non modificate e modificate di quel peptide. In terzo luogo, l'arricchimento relativo di ciascuna modificazione nel materiale immunoprecipitato è espresso come rapporto log₂ tra l'abbondanza relativa di ciascuna metilazione nel peptide immunoprecipitato e il campione di input. L'analisi del peptide H three nine to 17 mostra l'arricchimento delle forme dimetilata (D) e trimetilata (TRIMM) della lisina nove, con la corrispondente riduzione delle forme non modificate e monometilata.Con questi risultati come controllo positivo per la specificità dell'anticorpo, è possibile valutare l'associazione o la deplezione di tutte le altre modifiche sia a livello intramolecolare sullo stesso H3 che a livello intermolecolare su altre istoni arricchiti in coen all'interno dello stesso nucleosoma. Questa mappa termica rappresentativa riassume l'arricchimento di tutte le PTM di H associate a cos identificate sull'istone H3, H4 e H2A. Ogni riga corrisponde a una diversa modificazione e ND indica le modificazioni non rilevate per lo screening di tutte le proteine. L'associazione co-presente nell'eterocromatina mediante chip di cromatina cross-linkata e frammentata per sonificazione viene utilizzata in combinazione con la marcatura isotopica stabile mediante aminoacidi nella coltura cellulare o lac.Prima di tutto, l'efficienza della marcatura viene valutata calcolando l'incorporazione della lisina pesante e dell'arginina pesante nelle proteine. Per una quantificazione proteica accurata, è richiesta un'incorporazione superiore al 95% per entrambi gli amminoacidi pesanti; come osservato in questo caso, la mediana delle distribuzioni di densità peptidica per lisina e arginina è pari a 0,974 e 0,964 rispettivamente. In secondo luogo, è necessario ottimizzare il rapporto tra peptide solubile e anticorpo.Questa figura mostra uno spettro di massa ingrandito al corrispondente valore di rapporto massa/carica della lisina trimetilata in posizione nove con carica doppia positiva, K9me3, nel peptide H3 9-17, sia per le forme leggere che pesanti nel campione in ingresso e nel campione immunoprecipitato con OCTR. Mentre nel campione in ingresso le intensità dei peptidi pesanti e leggeri sono vicine a uno, nel chip SLAC diretto l'intensità del peptide leggero è molto inferiore rispetto a quella del corrispondente pesante, indicando così un'efficace competizione.Un risultato rappresentativo di una corsia SDS-PAGE di cromatina marcata con isotopi leggeri (L) e pesanti (H) utilizzata come input e del materiale immunoprecipitato (ChIP) è mostrato qui. La corsia corrispondente al materiale ChIP è stata suddivisa in 10 frazioni, mentre solo due frazioni dell'input sono state analizzate. Per l'analisi del test di incorporazione, gli esperimenti di competizione SLAC sono generalmente eseguiti in duplicato, in formati detti diretto e inverso, in cui la competizione con il peptide solubile in eccesso viene scambiata dai campioni di cromatina pesante (H) a quelli leggeri (L).Questo spettro completo rappresentativo mostra la coppia SLAC corrispondente a peptidi delle proteine HP uno e macro due A, con un rapporto tra proteina pesante e leggera maggiore di uno. Nell'esperimento diretto, questo rapporto è speculare a quello minore di uno nell'esperimento inverso replicato, dimostrando l'arricchimento specifico di queste proteine nei complessi di eterocromatina; le proteine la cui intensità nelle forme pesante e leggera è simile sia negli esperimenti diretti che in quelli inversi producono un rapporto costante prossimo a uno e vengono classificate come rumore di fondo. L'intersezione degli esperimenti ChIP-X diretti e inversi consente l'identificazione di 635 proteine presenti in entrambi gli esperimenti e quantificate con almeno due valori di rapporto.Il grafico logaritmico in base due dei loro rapporti tra pesante e leggero rappresenta il cosiddetto cromosoma etero. Le linee rosse tratteggiate in questo grafico a dispersione rappresentano il 40% e il 30% superiore dei rapporti proteici. Come indicato, gli interattori autentici della trimetilazione della lisina nove sono chiaramente identificati come le proteine presenti nel 40% superiore delle distribuzioni dei rapporti proteici.Qui, le distribuzioni dei rapporti proteici provenienti dagli esperimenti di crop X diretti e inversi di input sono mostrate rispettivamente in nero, blu e arancione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione su come preparare la cromatina per E e il crop finale per elaborare le proteine mono-precipitate prima dell'analisi mediante spettrometria di massa, su come identificare e quantificare le modifiche degli istoni negli spettri di massa e su come definire una specifica interazione in base ai loro rapporti proteici.

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Analisi quantitativa di proteomi cromatina nella malattia

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L&#39;isolamento di regioni genomiche specifici e l&#39;identificazione di molecole da Associated enChIP

Qui, descriviamo un protocollo di ChIP-sequenziamento high throughput ottimizzato e pipeline di analisi computazionali per la determinazione dei modelli di stato della cromatina genoma da tessuti tumorali congelati e linee cellulari.

Una piattaforma integrata per la mappatura di genoma degli Stati di cromatina usando High-throughput ChIP-sequencing nei tessuti del tumore

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Adattamento di ibridazione catturare delle proteine della cromatina associate per proteomica per cellule di mammifero

Descriviamo un protocollo passo-passo per la cromatina tandem immunoprecipitazione sequenziamento (tChIP-Seq) che permette l'analisi di modifica dell'istone di genoma di cellula-tipo-specifico.

TChIP-Seq: Cellula-tipo-specifico Epigenome profilatura

CUT&amp;RUN e le sue varianti possono essere utilizzati per determinare l'occupazione proteica sulla cromatina. Questo protocollo descrive come determinare la localizzazione delle proteine sulla cromatina utilizzando uliCUT&amp;RUN a singola cellula.

Localizzazione del fattore a cella singola sulla cromatina utilizzando la scissione di input ultra-bassa sotto i bersagli e il rilascio utilizzando la nucleasi

Questo protocollo descrive il metodo Capture Hi-C utilizzato per caratterizzare l'organizzazione 3D di regioni genomiche mirate di dimensioni megabased ad alta risoluzione, compresi i confini dei domini topologicamente associati (TAD) e le interazioni cromatiniche a lungo raggio tra elementi regolatori e altri elementi di sequenza del DNA.

Decifrare l'organizzazione della cromatina 3D ad alta risoluzione tramite Capture Hi-C

L'espressione genica è regolata dalle interazioni dei promotori genici con gli elementi regolatori distali. Qui, descriviamo come basso input Capture Hi-C (liCHi-C) consenta l'identificazione di queste interazioni in tipi di cellule rare, che in precedenza non erano misurabili.

Un flusso di lavoro integrato per studiare l'architettura del genoma spazio-temporale centrata sul promotore in popolazioni cellulari scarse

Presentiamo un protocollo di colorazione e analisi per la microscopia di localizzazione a singola molecola della cromatina a tre colori (SMLM) che consente la mappatura riproducibile di eucromatina, eterocromatina e RNAP II per l'analisi spaziale. Questo protocollo consente un'efficiente marcatura multicolore in ambienti nucleari densi, inclusi bersagli associati alla cromatina, consentendo una rilevazione simultanea affidabile.

Un protocollo di microscopia a localizzazione di molecole singole multimarcatore per l'indagine della cromatina nell'ambiente nucleare denso

Scopri l'approccio ChroP per la proteomica cromatinica locus-specifica, che combina ChIP e spettrometria di massa ad alta risoluzione. Questo metodo permette di analizzare le modificazioni istoniche e le interazioni proteiche.

L'approccio ChroP Combina ChIP e Spettrometria di Massa a sezionare Locus-specifiche proteomica Paesaggi della cromatina

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