Name: Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: Lernen Sie die chronische In-vivo-Bildgebung des visuellen Kortex bei Mäusen mit ausgedünntem Schädel zur Untersuchung dendritischer Spinen-Dynamik und kortikaler Plastizität.

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Diese Arbeit wurde von Burroughs Wellcome Career Award in der Biomedical Sciences (AKM) unterstützt, die Whitehall Foundation Research Grant (AKM), Sloan Foundation Fellowship (AKM), NIH EY019277 (AKM) und eine NEI finanziert Vision Training Grant, EY013319 ( EAK).

<ol><li> Zur Visualisierung Neuronen im intakten Gehirn über Zwei-Photonen-Mikroskopie, ein Präparat, wo Nervenzellen mit fluoreszierenden Markern versehen werden wird. In den Experimenten stellte hier benutzen wir die GFP-M transgenen Maus Linie, die Schicht Etiketten 5 Pyramidenzellen 1. Layer 5 Pyramidenzellen Projekt dendritischen Prozesse in oberflächlichen Schichten, so dass die Visualisierung von Dendriten und dendritischen Dornen bis zu einer Tiefe von 300 um unter dem Niveau der Pia. Ein alternativer Ansatz besteht darin, Label-Zellen unter Verwendung von viralen Markern (siehe Lowery et al., Eingereicht JOVE). </li><li> Sterilisieren der Arbeitsbereich mit 70% Ethanol und Autoklav-Tools für die aseptische Chirurgie. Decken die Oberfläche mit klarem Dressing. </li><li> Anesthetize Mäuse mit einem Fentanyl-Cocktail (Fentanyl 0,05 mg / kg; Midazolam 5 mg / kg; metatomadin 0,5 mg / kg) um ein Viertel Dosis Avertin (0,0075 mg / ml) mit IACUC genehmigten Verfahren folgten. Vorbehandeln Mäuse mit dem Analgetikum Buprenorphin (0,5 mg / kg) subkutan (SQ) verabreicht. Überwachen Sie den Grad der Narkose Ebene, die durch Tests Reaktion auf tail / toe kneifen. </li><li> Behalten Tier bei 37,5 ° C mit Heizdecke mit angeschlossenem Rektalthermometer. </li><li> Bewerben Augensalbe die Augen, die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern. Hood Augen mit kleinen Blatt Papier die Augen von der Lichtquelle zu schützen während der Operation. </li><li> Mit einer Schere entfernen Haare von der Rückseite des Kopfes (hinter den Ohren) auf die Augen. </li><li> Reinigen Sie die Spitze der Kopf des Tieres mit sequentieller Anwendung von 70% Ethanol, gefolgt von betadine schrubben und betadine Lösung. </li><li> Machen Sie einen L-Schnitt Schnitt hinter den Ohren und entlang der rechten oder linken Seite der Mittellinie (je nachdem, welcher Hemisphäre abgebildet wird), um die Augen. Falten Sie die Haut über und weg von der Operation vor Ort. Entfernen Sie nicht Haut, da die Haut nach dem Imaging-Sitzung vernäht werden. </li><li> Mit feinen Pinzette vorsichtig die Haut nach oben und weg von Ihrem Bereich des Interesses. </li><li> Vorsichtig abkratzen der Knochenhaut aus dem exponierten Bereich des Schädels mit sauberen Pinzette oder mikrochirurgischen Klinge. Mit Wattestäbchen, eine kleine Menge von 10% Eisen-III-Chlorid auf den Schädel vollständig trocknen, das Periost Membran und sicherzustellen, dass sie vollständig entfernt worden ist. Es ist wichtig, dass der Schädel völlig trocken, um die ordnungsgemäße Einhaltung der Leim zu gewährleisten (siehe 11). Mit einer Pinzette oder mikrochirurgischen Klinge sanft weg kratzen getrocknet Periost Membran. </li><li> Tragen Sie eine dünne Schicht von Sekundenkleber um die Imaging-Fenster des Edelstahl Kopfplatte (siehe Abbildung 1) und bringt die Platte auf den Schädel. </li><li> Mit dem hölzernen Ende eines Baumwoll-Tupfer-Stick, Leim, um Nähte innen der Imaging-Fenster; achten Sie darauf, alle Lücken zwischen den Imaging-Plate und Krümmung des Schädels zu füllen. </li><li> Geben Sie einen Tropfen Leim Beschleuniger in das Fenster. Schnell abwischen überschüssigen Leim-Beschleuniger mit einem Wattestäbchen oder kim wischen. Der Kleber muss vollständig vor dem Bohren verfestigt werden. </li><li> Beginnen Sie den Schädel in der Imaging-Fenster mit einem zahnärztlichen Bohrer mit 0,7 mm Edelstahl Grat angebracht dünn. Alternate Bohren mit gelegentlichem Auftragen von 0,9% steriler Kochsalzlösung zu vermeiden, erzeugen zu viel Hitze auf dem Schädel. </li><li> Thin einem 4x4 mm Fenster auf den Schädel mit kleinen Schlägen auf den Schädel Oberfläche mit dem zahnärztlichen Bohrer. Testen Sie die Schlankheit des Schädels mit stumpfen Ende einer Pinzette. Der Schädel Oberfläche wird leicht Gedankenstrich mit sanftem Druck. Die optimale Schädel Dicke für die Bildgebung ist zwischen 10 und 30 um. </li><li> Wenn der Schädel dünn ist und das Fenster von allen Verunreinigungen gereinigt, statt Kochsalzlösung auf dem Schädel. Fotografieren Sie die Imaging-Fenster mit einer digitalen Kamera, montiert auf eine Binokular. Fotografie und die Nutzung des Gehirns Gefäßsystem wird bei der Ortung der Lage, die Imaging-Plate für die anschließende Bildgebung Sitzungen statt zu helfen. </li><li> Transport des Tieres auf die 2-Photonen-rig. Das Tier sollte auf der Heizdecke (mit rektalen Sonde) während der gesamten Imaging-Sitzung bleiben. Hinweis: Während unter Sedierung, das Tier Körperkerntemperatur wird stark schwanken in der Abwesenheit einer Heizeinheit was in kortikalen Schäden oder sogar Tod. </li><li> Ein Zwei-Photonen-Mikroskop mit einem Mai Tai Laser, ein 10W Solid-State-Pumpe für maximale Leistung und ein modifiziertes Olympus FluoView konfokalen Einheit verwendet wird. Das System ist für tiefe Tissue Imaging optimiert und externen Detektoren sind so nah an das Ziel installiert wie möglich, um eine maximale Detektion von Fluoreszenz aus dem Gehirn ermöglichen. Eine Olympus LUMPlan fl / IR 20X/0.95NA Objektiv verwendet wird. 0,9% iger Kochsalzlösung wird während der Bildgebung für die objektive Untertauchen verwendet. </li><li> Mit diesem Mikroskop und niedrige digitaler Zoom (x1) identifizieren eine Fläche, die hell markierten Neuronen. </li><li> Mit einer digitalen Kamera angebracht, um das Mikroskop-Okular, nehmen Sie ein Foto von den Imaging-Bereich. Alternativ skizzieren das Blut Gefäßsystem Muster. Dies ist notwendig, um wiederwiederum die gleichen bildgebenden Lage zu einem späteren Zeitpunkt. </li><li> Besorgen Sie sich ein geringer Vergrößerung Stack (x20 Ziel, 512x512 Pixel, 5 um Schritt) durch das gesamte sichtbare Ausmaß des Gehirns (in der Regel Spanning ~ 200 pm) zeigt das Ausmaß der dendritischen Verzweigung. Hinweis: Diese geringe Vergrößerung Bild wird verwendet, um den Imaging-Bereich bei späteren Zeitpunkt zu lokalisieren, da beide Blutgefäße und Dendriten ihrer Struktur in jungen und erwachsenen Tieren zu erhalten. </li><li> Mit Bildbearbeitungs-Software (FluoView, v. 5.0, FV300), erhöhen die digitale Vergrößerung 8-fach. Passen Sie den X-, Y-Koordinaten (pan-Koordinaten), wenn notwendig und sammeln eine hohe Vergrößerung Stapel, die detaillierte dendritische Morphologie mit den Standorten und die Struktur der dendritischen Dornen zeigen. Nehmen Sie detaillierte Hinweise jedem Stapel Sammlung, dh pan-Koordinaten, den Bereich der Sammlung, die z-Schritt-Größe und die Anzahl der Schritte in Ihrem Stack. Diese Notizen werden genommen, wenn sie auf diese Dendriten oder Axonen zu einem späteren Zeitpunkt sein. </li><li> Nach Bildgebung, entfernen Sie die Kopfplatte durch vorsichtiges Trennplatte aus Kopfoberfläche. Mit einer Pinzette entfernen Sie alle Klebereste übrigen am Schädel und wischen Kopfoberfläche mit 0,9% steriler Kochsalzlösung. Suture die Haut über den Schädel zusammen mit Nr. 6 Nähfaden. Wischen Sie mit 70% Ethanol. Um Schmerzen zu lindern während der postoperativen Erholung, verwalten 0,1 mg / kg Buprenorphin analgetisch, SQ. </li><li> Tier in den Käfig sauber unter einer Wärmelampe, bis sie aufwacht und ist mobil. Zurück Tier ursprünglichen Käfig. </li><li> Um reimage Tier zu einem späteren Zeitpunkt (unsere Imaging Zeitpunkten kann irgendwo zwischen 2 Tagen und mehreren Monaten auseinander), zu entfernen Stiche oder öffnen Sie die Haut an Kopf mit aseptischen Verfahren wie oben. Verwenden Sie das digitale Bild des Gehirns Gefäßsystem (aufgenommen bei der ersten OP-Termin), um den ursprünglichen Imaging-Standort zu lokalisieren. Wiederanzubringen Edelstahl Kopfplatte (Schritte 10-12). Verwenden Sie einen mikrochirurgischen Klinge sanft dünne entfernt alle Knochen, der möglicherweise zwischen Bildgebung Zeitpunkten wieder gewachsen sind. Wenn nötig, dünn mit Dentalbohrers. Klare Imaging-Fenster von Schmutz und einen Tropfen 0,9% steriler Kochsalzlösung. </li><li> Carry Tier zu Zwei-Photonen-Mikroskop und suchen ursprünglichen Imaging-Bereich. Verwenden Sie die digitale Fotografie im ersten abbildenden Sitzung um Hilfe genommen. </li><li> Öffnen Sie die FluoView Programm und öffnen Sie die ursprüngliche geringer Vergrößerung Bild. Bringen Sie eine Transparenz Blatt auf dem Computer-Bildschirm und skizzieren die wichtigsten Blutgefäße Muster mit einer Transparenz Stift. </li><li> Öffnen Sie das Live-Bild und richten Sie die Blut-Gefäßsystem an die skizzierten Muster auf der Folie aus. </li><li> Um reimage die 8x in Strukturen vergrößert haben, öffnen Sie die gewünschte gesammelten Stapel aus der vorherigen Abbildung Sitzung. Skizzieren Sie die Struktur (dh axonale, dendritische, Gliazellen) auf eine transparente Folie, angebracht auf den Bildschirm. </li><li> Zoom in 8x aus dem Live-Bild und stellen Sie die Pfanne Koordinaten auf den ersten Tag Aufnahmeparameter. Je nach Genauigkeit der Ausrichtung der geringer Vergrößerung Lage, kann es notwendig sein, um auch den Winkel des Bildes leicht. Sobald die gewünschte Struktur gefunden wird, passen die Struktur Ihrer skizziert hoher Vergrößerung Muster. Sammeln Sie die z-Stapel mit den gleichen Schritt Größe und Anzahl der Z-Stapel-Bildern für die spätere Analyse. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 29 und 30, bis alle die hohe Vergrößerung Bilder wieder abgeholt werden. </li><li> Bei der Abbildung abgeschlossen ist, wiederholen Sie die Schritte 22-24. Re-imaging kann wiederholt werden, bis zu 2 separate Zeitpunkten. </li><li> Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her durch das Vivarium und Division of Laboratory Animal Medicine der University of Rochester School of Medicine and Dentistry Satz durchgeführt, in voller Akkreditierung durch die Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care, International (AAALAC) und sind in Übereinstimmung mit den staatlichen Gesetzen, Bundesgesetz und NIH-Politik. </li></ol> Repräsentative Ergebnisse In GFP-M zum Ausdruck Mäuse, kann eine Teilmenge der Schicht 5 Pyramidenzellen und der entsprechenden dendritischen Prozesse einfach visualisieren mittels 2-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (2PLSM) 1. Hier zeigte eine ausgedünnte Schädel Vorbereitung, in der die Schädel über die gewünschte Bildgebung Lage auf ~ 10-30 um ausgedünnt ist. Korrekt ausgeführt, erlaubt unser Protokoll uns klar zu visualisieren kortikalen Dendriten und Dornen in der intakten visuellen Kortex für akute oder chronische Analyse (Abbildung 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Benutzerdefinierte Kopf-und Bodenplatte. (A) Draufsicht custom made ​​Kopf und Grundplatte für ausgedünnte Schädel-Operation der Herstellung verwendet. (B) Seitenansicht von maßgeschneiderten Kopf-und Bodenplatte. (C, D) Detaillierte schematische und das Image der Kopfplatte. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> in vivo in der Sehrinde einer transgenen GFP-M-Maus mit zwei-Photonen-Mikroskopie abgebildet. Das Bild ist eine Projektion des einzelnen Bildes erhalten alle 5 um von der pia eine Endteufe von 175 um. Die boxed-Bereich in A repräsentiert den vergrößerten Bereich in (B) und (C) am Tag abgebildet 0 (D0) und vier Tage später (D4). (D, E) Höhere Vergrößerung von dendritischen Zweig boxed in B und C zeigen stabile Stacheln (weißer Pfeil Köpfe), verloren / Zurückziehen Stacheln (rote Pfeilspitzen) und neue Stacheln (grüne Pfeilspitzen). Maßstabsbalken = A. 200 um, B, C. 20 mu m, D, E. 5 um.

<ol><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
</ol>

Chronische Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ist ein zunehmend beliebtes Verfahren, um morphologische Veränderungen während der Plastizität 2-5 ausgelöst studieren. Hier zeigen wir eine ausgedünnte Schädel Vorbereitung auf die identifizierten dendritischen Dornen im intakten Gehirn der Maus auf verschiedenen bildgebenden Tagen folgen. In diesem Protokoll wird der Schädel intakt gelassen, wodurch minimale Schäden an der Rinde und was zu einem sehr niedrigen Niveau von Neuroinflammation die Funktion ...

<table><tbody><tr><td>Fentanylzitrat</td><td></td><td>In Haus</td><td></td><td>Fentanyl-Cocktail: Anästhetika-Cocktail&lt;br/&gt;IP-Dosis: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Endkonzentration des Cocktails: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Medetomidinhydrochlorid</td><td></td><td>In Haus</td><td></td><td>Fentanyl-Cocktail: Anästhetika-Cocktail&lt;br/&gt;IP-Dosis: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Endkonzentration des Cocktails: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>Midazolam HCl</td><td></td><td>In Haus</td><td></td><td>Fentanyl-Cocktail: Anästhetika-Cocktail&lt;br/&gt;IP-Dosis: 0,0125 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Endkonzentration des Cocktails: 0,05 mg/kg</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribrom&amp;#8211;Ethanol </td><td></td><td></td><td></td><td>Avertin-Cocktail: Anästhetikum;&lt;br/&gt;IP-Dosis: 0,0075 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Endkonzentration des Cocktails: 1 %</td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol (Endkonzentration: 0,775 %)</td><td></td><td></td><td></td><td>Avertin-Cocktail: Anästhetikum;&lt;br/&gt;IP-Dosis: 0,0075 ml/g&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;Endkonzentration der Cocktails: 0,775 %</td></tr><tr><td>TC-1000 Temperaturregulierungssystem für Mäuse</td><td></td><td>CWE, Inc.</td><td>TC-1000 Maus</td><td>Körpertemperaturregulation</td></tr><tr><td>Toberadex</td><td></td><td>In Hausproduktion</td><td></td><td>Augensalbe</td></tr><tr><td>10 % Eisen(III)-chlorid</td><td></td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td>Präparation am dünnen Schädel</td></tr><tr><td>Mikrochirurgisches Messer</td><td></td><td>Sable Industries</td><td>S-6400</td><td>Präparation am dünnen Schädel</td></tr><tr><td>Cyanoacrylat 404,401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 46551</td><td>Präparation am dünnen Schädel</td></tr><tr><td>Cyanoacrylat 401</td><td></td><td>Loctite</td><td>P/N 40140</td><td>Präparation am dünnen Schädel</td></tr><tr><td>Zip Kicker Klebeschleuniger</td><td></td><td>Pacer Technology</td><td>PT-29</td><td>Präparation am dünnen Schädel</td></tr><tr><td>Mikrobohrer-Stahlfräser, 0,7 mm Spitzen­durchmesser</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td>Präparation am dünnen Schädel</td></tr><tr><td>Microtorque-Steuerbox und Tech2000-Handstück</td><td></td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000 EIN/AUS</td><td>Dünnschädelpräparation</td></tr><tr><td>#6-0 (0,7 metrisch) Seidennaht</td><td></td><td>Ethicon Inc.</td><td>K8894H</td><td>Taper C-1</td></tr><tr><td>Augenverbandzange, 10 cm, Spitzenbreite 0,5 mm, gebogen</td><td>Chirurgische Instrumente</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>Extrafeine Bonn-Scheren, 8,5 cm, gerade Spitze, Schneidkante 13 mm</td><td>Chirurgische Instrumente</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Standard-Pinzette, gerade, 2,5 mm × 1,35 mm Spitze, 12 cm</td><td>Chirurgische Instrumente</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr></tbody></table>

chronische imaging of mouse visual cortex mit einem ausgedünnten schädel vorbereitung

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In-vivo-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (2PLSM) ermöglicht die Untersuchung von lebenden Zellen und neuronalen Prozesse im intakten Gehirn. Die hier vorgestellte Technik ermöglicht die Abbildung des gleichen Bereich des Gehirns zu verschiedenen Zeitpunkten (chronische Imaging) mit mikroskopischer Auflösung ermöglicht die Verfolgung von dendritischen Dornen, die die kleinen Strukturen, die die Mehrheit der postsynaptischen exzitatorischen Seiten im ZNS darstellen. Die Fähigkeit, klar zu lösen feinen kortikalen Strukturen über mehrere Zeitpunkte hat viele Vorteile, insbesondere bei der Untersuchung der Plastizität des Gehirns, in denen morphologische Veränderungen an den Synapsen und Schaltung Umbau erklären helfen, zugrunde liegenden Mechanismen können. In diesem Video-und Zusatzmaterial, zeigen wir ein Protokoll für chronischen in vivo-Bildgebung des intakten Gehirn mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung. Die ausgedünnten Schädel Präparat ist ein minimal-invasiven Ansatz, der mögliche Schäden an der Dura und / oder Cortex vermeidet, wodurch die Entstehung einer entzündlichen Reaktion. Wenn dieses Protokoll korrekt durchgeführt wird, ist es möglich, deutlich Überwachung von Änderungen in dendritischen Dorn Eigenschaften im intakten Gehirn über einen längeren Zeitraum.

In diesem Video-und ergänzendes Material zeigen wir ein Protokoll für die chronische<em&gt; In vivo</em&gt; Abbildung des intakten Gehirn mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung.

Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Die In-vivo-Bildgebung mittels Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie (2PLSM) ermöglicht die Untersuchung lebender Zellen und neuronaler Prozesse im intakten Gehirn. Die ...

Dendritische Dornfortsätze sind membranöse Ausstülpungen aus dem Dendriten eines Neurons, die synaptische Eingaben empfangen. Eine Verlängerung, Verkleinerung, das Auftreten oder Verschwinden von Dornfortsätzen tritt als Reaktion auf Veränderungen der neuronalen Netzwerkfunktion auf, die sich aus bestimmten Mustern neuronaler Aktivität ergeben. Dieses Phänomen ist als kortikale Plastizität bekannt, um morphologische Veränderungen an dendritischen Dornfortsätzen zu beobachten.Bei lebenden Tieren wird eine Bildgebungsplatte am Schädel einer Maus befestigt. Ein Bereich des Schädels wird chirurgisch ausgedünnt und Aufnahmen mit niedriger und hoher Vergr&ouml;&szlig;erung werden angefertigt. Dieselben Bereiche werden zu sp&auml;teren Zeitpunkten erneut abgebildet.Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass die Morphologie dendritischer Dornen mittels einer dünnen Schädelpräparation zu mehreren Zeitpunkten klar visualisiert werden kann. Außerdem zeigt sich, dass die Dornmorphologie hochplastisch ist und strukturelle Veränderungen sowie das Auftreten und Verschwinden dendritischer Dornen aufweist. Hallo, ich bin Emily Kelly im Labor von Anaya Maka am Department für Neurobiologie und Anatomie der Universität von Rochester.Heute zeigen wir Ihnen die Vorgehensweise für die chronische Bildgebung der Maus-Vial-Rinde nach einer als Präparation bezeichneten Methode. In unserem Labor verwenden wir dieses Verfahren, um den Umsatz dendritischer Dornen zu untersuchen. Beginnen wir also.Beginnen Sie das Verfahren mit der Sterilisation der Instrumente für eine aseptische Operation. Anschließend sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol und bedecken die Operationsfläche mit sauberem Verbandsmaterial. Überwachen Sie die Anästhesietiefe bei einer mit einem Fentanyl-Cocktail anästhesierten Maus, indem Sie die Reaktion auf einen Zehenquetschtest überprüfen; die hier gezeigte Maus ist eine A-G-F-P-M-transgene Maus, in der GFP exprimiert wird.In der Schicht fünf parametale Zellen, die dendritische Fortsätze in die oberflächlichen Schichten projizieren. Um eine Körpertemperatur von 37,5 Grad Celsius aufrechtzuerhalten, stelle das Tier auf eine Heizdecke und überwache es mit einem angeschlossenen Rektalthermometer. Anschließend trage mit einer Schere Augensalbe auf die Augen auf, um Austrocknung zu verhindern.Entfernen Sie die Haare am Hinterkopf der Maus von hinter den Ohren bis zu den Augen. Reinigen Sie dann die Kopfoberseite des Tieres mit einer Applikation von 70 %igem Ethanol, gefolgt von einer Betadine-Behandlung mit Tupfer und Betadine-Lösung. Führen Sie einen LCU-Schnitt hinter den Ohren und entlang der rechten oder linken Seite der Mittellinie bis zu den Augen durch, je nachdem, welches Hemisphäre abgebildet werden soll, und klappen Sie die Haut über die Operationsstelle weg.Entfernen Sie die Haut nicht, da sie später mit feinen Pinzetten genäht wird. Ziehen Sie die Haut vorsichtig nach oben und weg von der interessierenden Region. Verwenden Sie saubere Pinzetten, um das Periost vorsichtig von dem freigelegten Bereich des Schädels abzukratzen.Tragen Sie eine kleine Menge von 10 % Eisen(III)-chlorid auf den Schädel auf, um die Periostmembran vollständig zu trocknen und sicherzustellen, dass sie vollständig entfernt wurde. Es ist wichtig, dass der Schädel vollständig trocken ist. Um eine ordnungsgemäße Haftung des Klebstoffs zu gewährleisten, kratzen Sie vorsichtig getrocknete Reste der Periostmembran mit einer mikrochirurgischen Klinge ab.Als Nächstes tragen Sie eine dünne Schicht Sano-Acrylkleber um das Bildfenster der Edelstahlhalterungsplatte auf und befestigen die Platte am Schädel. Mit dem Holzende eines Wattestäbchens tragen Sie Kleber auf die Innennähte des Bildfensters auf, wobei Sie sicherstellen, dass alle Spalten zwischen der Bildplatte und der Krümmung des Schädels ausgefüllt sind. Geben Sie einen Tropfen des Kleber-Härtemittels in das Fenster.Danach schnell den Überschuss abwischen. Die Klebstoffbindung vollständig trocknen lassen. Mit einem Zahnarztbohrer, der mit einer 0,7-Millimeter-Stahlfräse ausgestattet ist, beginnen Sie, den Schädel im Bildgebungsfenster auszudünnen.Wechseln Sie das Bohren mit gelegentlicher Anwendung von 0,9 % steriler Kochsalzlösung ab, um übermäßige Wärmeentwicklung am Schädel zu vermeiden. Dünner ein vier mal vier Millimeter großes Fenster am Schädel durch kleine Striche über die Schädeloberfläche. Verwenden Sie den Zahnbohrer. Prüfen Sie die Dicke des Schädels mit einer stumpfen Pinzette. Die Schädeloberfläche wird sich bei leichtem Druck leicht eindellen.Die optimale Schädeldicke für die Bildgebung liegt zwischen 10 und 30 Mikrometern. Nachdem der Schädel ausgedünnt wurde, säubern Sie das Fenster vollständig von Rückständen und geben Sie physiologische Kochsalzlösung auf den Schädel. Fotografieren Sie das Bildgebungs-Fenster mit einer an ein Stereomikroskop montierten Digitalkamera.Die Gehirngefäße auf diesem Foto helfen dabei, die Position für die Platzierung der Bildgebungsplatte bei nachfolgenden Bildgebungssitzungen zu bestimmen. Transportieren Sie das Tier zum Zwei-Photonen-System. Das Tier sollte weiterhin auf der Heizdecke liegen, und die Körpertemperatur sollte während der gesamten Bildgebungssitzung kontinuierlich überwacht werden.Ein Zwei-Photonen-Mikroskop mit einem Mi-Tai-Laser. Es wird eine 10-Watt-Festkörperlaserpumpe für maximale Leistung und eine modifizierte Olympus-Flow-View-Konfokaleinheit verwendet. Das System ist für die Bildgebung tiefer Gewebeschichten optimiert, und externe Detektoren sind so nah wie möglich am Objektiv installiert, um eine maximale Detektion der Fluoreszenz aus dem Gehirn zu ermöglichen; geben Sie einen Tropfen Salzlösung auf das Bildgebungs-Fenster, indem Sie eine niedrige digitale Vergrößerung verwenden.Identifizieren Sie mithilfe einer am Mikroskop befestigten Digitalkamera einen Bereich mit stark gefärbten Neuronen. Ips, machen Sie eine Aufnahme des Abbildungsbereichs. Dies ist erforderlich, um zu einem späteren Zeitpunkt zur gleichen Abbildungsposition zurückzukehren.Erhalten Sie einen Low-Magnification-Stack über die gesamte sichtbare Ausdehnung des Gehirns, der das Ausmaß der dendritischen Verzweigung zeigt. Dieser wird verwendet, um den Bildgebungsarea zu späteren Zeitpunkten zu lokalisieren, sowohl anhand der Blutgefäße als auch der Dendriten. Bewahren Sie deren Struktur bei jungen und erwachsenen Tieren mithilfe von Bildgebungssoftware auf.Erhöhen Sie die digitale Vergrößerung achtfach, passen Sie gegebenenfalls die XY-Koordinaten an und erfassen Sie einen Stapel mit hoher Vergrößerung, der eine detaillierte dendritische Morphologie einschließlich der Lage und Struktur dendritischer Dornen zeigt. Machen Sie detaillierte Notizen zu jeder Stapelerfassung, einschließlich Pan-Koordinaten, Erfassungsbereich, Z-Schrittgröße und Anzahl der Schritte im Stapel. Diese Notizen werden verwendet, wenn zu einem späteren Zeitpunkt zu diesem Dendrit oder Axon zurückgekehrt wird.Nach der Bildgebung entfernen Sie die Kopfplatte, indem Sie sie vorsichtig von der Schädeloberfläche lösen. Verwenden Sie dazu Pinzette. Entfernen Sie eventuell verbliebene Klebereste und wischen Sie den Schädel mit 0,9 % steriler Kochsalzlösung ab.Nähen Sie die Haut über dem Schädel mit Sechser-Nahtfaden zusammen. Wischen Sie den Bereich nach dem Bildgebungsverfahren mit 70 %igem Ethanol ab. Stellen Sie das Tier in einen sauberen Käfig unter eine Wärmelampe, bis es aufwacht und beweglich ist.Bringen Sie das Tier dann in seinen ursprünglichen Käfig zurück, um es zu einem späteren Zeitpunkt – zwischen zwei Tagen und mehreren Monaten – erneut abzubilden. Entfernen Sie die Nähte und öffnen Sie die Haut am Kopf erneut. Nutzen Sie unter aseptischen Bedingungen das digitale Bild der Hirngefäße, das während der ersten Operation aufgenommen wurde, um die ursprüngliche Bildgebungslage zu lokalisieren. Befestigen Sie dann die Kopfplatte erneut wie zuvor. Verwenden Sie eine mikrochirurgische Klinge, um gegebenenfalls vorsichtig Knochen abzutragen, der sich zwischen den Bildgebungszeitpunkten möglicherweise wieder gebildet hat. Dünne mit einem Zahnbohrer ab, reinigen Sie das Bildgebungs-Fenster von Ablagerungen und geben Sie einen Tropfen 0,9 %iger steriler Kochsalzlösung hinzu. Bringen Sie das Tier zu einem Zwei-Photonen-Mikroskop und lokalisieren Sie den ursprünglichen Bildgebungsbereich mithilfe des digitalen fluoreszierenden Bildes, das während der vorherigen Sitzung aufgenommen wurde.Starten Sie das Durchflussansicht-Programm. Öffnen Sie das ursprüngliche Bild mit niedriger Vergrößerung, befestigen Sie ein Transparentpapier an dem Computerbildschirm und skizzieren Sie das Hauptmuster der Blutgefäße mit einem Stift für Transparentfolien. Öffnen Sie anschließend das Live-Bild und richten Sie die Blutgefäße erneut an dem auf dem Transparentfilm skizzierten Muster aus.Entfernen Sie die Transparentfolie, um die acht mal vergrößerten Strukturen erneut abzubilden. Öffnen Sie den gewünschten aufgenommenen Stack aus der vorherigen Bildgebungssitzung. Zeichnen Sie die Struktur auf eine am Bildschirm befestigte Transparentfolie.Vergrößern Sie das Live-Bild um das Achtfache und richten Sie das Bild an der Transparenz aus. Abhängig von der Genauigkeit der Ausrichtung der Position bei niedriger Vergrößerung kann es notwendig sein, den Winkel des Bildes leicht anzupassen. Stellen Sie die Pan-Koordinaten auf die Bildaufnahmeparameter des ersten Tages ein, einschließlich Schrittgröße und Anzahl der aufzunehmenden Bilder. Die Wiederholung der Zack-Aufnahme kann zweimal durchgeführt werden. Die Anzahl der Öffnungen der Kopfhaut sollte begrenzt werden, um die Integrität des Schädels nicht zu beeinträchtigen, was andernfalls zu einer schlechten Bildauflösung bei GFP-Mäusen führen würde.Ein Teilbereich von parametakortikalen Zellen der Schicht fünf und die entsprechenden dendritischen Prozesse wurde mittels in-vivo-Zwei-Photonen-Laser-Scanning-Mikroskopie sichtbar gemacht; hier sind GFP-markierte dendritische Fortsätze des visuellen Kortex dargestellt. Diese Aufnahme ist eine Projektion einzelner Bilder, die im Abstand von jeweils fünf Mikrometern von der Pia bis zu einer endgültigen Tiefe von 175 Mikrometern aufgenommen wurden. Der markierte Bereich ist hier am Tag null in höherer Vergrößerung dargestellt und erneut am Tag vier; hier erfolgt ein Vergleich der hochvergrößerten Aufnahmen eines dendritischen Astes vom Tag null und Tag vier.Diese Bilder zeigen stabile Dornfortsätze, die durch weiße Pfeilspitzen gekennzeichnet sind, verlorene zurückziehende Dornfortsätze, die durch rote Pfeilspitzen markiert sind, sowie neue Dornfortsätze, die durch grüne Pfeilspitzen angezeigt werden. Wir haben Ihnen soeben gezeigt, wie man eine chronische Zweiphotonen-Bildgebung in der visuellen Rinde der Maus unter Verwendung einer dünnen Schädelpräparation durchführt. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, besondere Vorsicht während des Ausdünnens walten zu lassen, um Schäden am Schädel und der darunterliegenden Dura zu vermeiden, da dies zu einer schlechten Bildauflösung führen würde, und detaillierte Notizen anzufertigen.Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Dieses Video-und Protokoll zu demonstrieren, wie man ein Glas überdachten kranialen Fenster in Nagetieren zu implantieren. Diese Zubereitungen können bei chronischen in vivo Zwei-Photonen-Imaging des Neokortex über Zeitskalen von Monaten verwendet werden. Es kann auch für andere Arten der Bildgebung, darunter optische Eigensicherheit Signal Bildgebung verwendet werden.

Ein Kraniotomie Chirurgie Verfahren für chronische Brain Imaging

Wir beschreiben ein Verfahren zur Visualisierung wiederholt murine Mikroglia und zirkulierenden...

Ein Thin-Schädel Fenster-Technik für chronische Zwei-Photonen- In-vivo- Imaging von Murine Mikrogliazellen in Modelle der Neuroinflammation

Wir stellen eine Methode, um ein bildgebendes Fenster in der Maus, die Schädel Millimeter überspannt und ist seit Monaten ohne Entzündung des Gehirns stabil zu bilden. Diese Methode wird auch für longitudinale Studien des Blutflusses, Zelluläre Dynamik und Zell / vaskuläre Struktur mit zwei-Photonen-Mikroskopie geeignet.

Eine polierte und verstärkte ausgedünnten Schädel Fenster für Langzeit-Imaging im Gehirn der Maus

Durch die Kombination aus poliertem und verstärkte Dünnschicht-Schädel (Ports) cranial Fenster und Glioblastom (GBM) Zellinjektion können wir beobachten, Gliom Initiierung und Wachstum aus injiziert GBM Zellen in das Gehirn eines lebenden Maus Längsrichtung.

Imaging Gliom Initiation<em&gt; In Vivo</em&gt; Durch eine Poliert und Reinforced Thin-skull Cranial Fenster

Wir stellen eine Methode zur Schaffung eines ausgedünnten Schädel kortikale Fenster (TSCW) in einem Mausmodell...

Verdünnt-skull Kortikale Fenster-Technik für<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Coherence Tomography Imaging

Zeitraffer-Bildgebung am lebenden Tier liefert wertvolle Informationen über die strukturelle Reorganisation im intakten Gehirn. Hier stellen wir ein verdünntes Schädelpräparat vor, das die transkranielle Bildgebung von fluoreszenzmarkierten synaptischen Strukturen in der lebenden Mausrinde mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Akute Hirn-Trauma ist eine schwere Verletzung, die keine angemessene Behandlung bis heute hat. Multiphotonen-Mikroskopie ermöglicht Studium in Längsrichtung den Prozess der akuten Hirntrauma Entwicklung und Untersuchung therapeutische Strategien bei Nagern. Zwei Modelle des akuten Hirn-Trauma untersucht mit in vivo Zwei-Photonen-Imaging von Gehirn werden in diesem Protokoll demonstriert.

Akute Brain Trauma in Mäusen Gefolgt durch Längs Zwei-Photonen-Imaging

Mit Längs Zwei-Photonen - Mikroskopie Dieses Manuskript beschreibt ein Verfahren , um den Umbau des cerebrovasculature während Amyloid - Plaque - Akkumulation in vivo zu verfolgen. Ein ausgedünnten Schädel Vorbereitung ermöglicht die Visualisierung von Fluoreszenzfarbstoffen, das Fortschreiten von zerebrovaskulären Schädigung in einem Mausmodell der Alzheimer-Krankheit zu bewerten.

in Längsrichtung<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging des Cerebrovasculature: Bedeutung für ZNS-Erkrankungen

Dieses Protokoll beschreibt eine chronische Cranial Window Implantationstechnik, die für die Längsbildgebung von neurogliovaskulären Strukturen, Wechselwirkungen und Funktion unter gesunden und kranken Bedingungen verwendet werden kann. Es dient als ergänzende Alternative zum transkraniellen Bildgebungsansatz, der zwar oft bevorzugt wird, aber einige kritische Einschränkungen besitzt.

Präzise Gehirnkartierung zur Durchführung von Repetitiven In-Vivo-Bildgebungen der Neuro-Immun-Dynamik bei Mäusen

Hier wird ein Protokoll zur Implantation eines chronischen Schädelfensters für die Längsbildgebung von Gehirnzellen in wachen, kopfgefesselten Mäusen vorgestellt.

Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen Mäusen

Lernen Sie die chronische In-vivo-Bildgebung des visuellen Kortex bei Mäusen mit ausgedünntem Schädel zur Untersuchung dendritischer Spinen-Dynamik und kortikaler Plastizität.

Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

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