Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

Dendritische Stacheln sind Membranvorsprünge aus dem Dendriten eines Neurons, die synaptischen Input erhalten. Das Verlängern, Schrumpfen oder Verschwinden von Stacheln tritt als Reaktion auf Veränderungen in der Funktion des neuronalen Netzwerks auf, die sich aus spezifischen Mustern der neuronalen Aktivität ergeben. Dieses Phänomen ist als kortikale Plastizität bekannt, um morphologische Veränderungen in dendritischen Dornen zu beobachten.

Bei lebenden Tieren wird eine Speicherfolie auf den Schädel einer Maus geklebt. Ein Bereich des Schädels wird operativ ausgedünnt und es sind Bilder mit niedriger und hoher Vergrößerung erforderlich. Die Bereiche werden dann zu einem späteren Zeitpunkt neu abgebildet.

Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass die Morphologie der dendritischen Wirbelsäule mit einer dünnen Schädelpräparation zu mehreren Zeitpunkten deutlich sichtbar gemacht werden kann. Und diese Morphologie der Wirbelsäule ist sehr plastisch und zeigt Veränderungen in der Struktur sowie das Auftreten und Verschwinden von dendritischen Stacheln. Hallo, ich bin Emily Kelly im Labor von Anaya Maka in der Abteilung für Neurobiologie und Anatomie an der University of Rochester.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur chronischen Bildgebung des Kortex des Mausfläschchens nach einer Flossen, die als Präparation bezeichnet wird. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um den Umsatz der dendritischen Wirbelsäule zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Beginnen Sie den Eingriff, indem Sie die Werkzeuge für die aseptische Chirurgie sterilisieren. Sterilisieren Sie dann den Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol und bedecken Sie die Operationsfläche mit sauberem Verband. Überwachen Sie die Anästhesietiefe in einer mit Fentanyl-Cocktail anästhesierten Maus, indem Sie ihre Reaktion auf ein Zehenklemmen testen. Die hier gezeigte Maus ist eine A-G-F-P-M-transgene Maus, in der GFP exprimiert wird.

In Schicht fünf Parametallzellen, die dendritische Prozesse in oberflächliche Schichten projizieren. Um eine Körpertemperatur von 37,5 Grad Celsius zu halten, legen Sie das Tier auf eine Heizdecke und überwachen Sie es mit einem angebrachten Rektalthermometer. Tragen Sie dann mit einer Schere eine Augensalbe auf die Augen auf, um ein Austrocknen zu verhindern.

Entfernen Sie die Haare am Hinterkopf der Maus von hinter den Ohren bis zu den Augen. Reinigen Sie dann die Oberseite des Kopfes des Tieres mit einer Anwendung von 70%igem Ethanol, gefolgt von Betadin-Peeling und Betadin-Lösung. Machen Sie einen LCU-Schnitt hinter den Ohren und nach oben entlang der rechten oder linken Seite der Mittellinie, je nachdem, welche Hemisphäre für die Augen abgebildet wird, falten Sie die Haut über und weg von der Operationsstelle.

Entfernen Sie die Haut nicht, da sie später mit einer feinen Pinzette vernäht wird. Ziehen Sie die Haut vorsichtig nach oben und weg vom interessierenden Bereich. Kratzen Sie mit einer sauberen Pinzette vorsichtig das Periost von der freiliegenden Stelle des Schädels ab.

Tragen Sie eine kleine Menge 10%iges Chlorid auf den Schädel auf, um die Knochenhautmembran vollständig zu trocknen und sicherzustellen, dass sie vollständig entfernt wurde. Wichtig ist, dass der Schädel vollständig trocken ist. Um eine korrekte Haftung des Klebers zu gewährleisten, kratzen Sie die getrocknete Knochenhautmembran vorsichtig mit einer mikrochirurgischen Klinge ab.

Tragen Sie anschließend eine dünne Schicht Sano-Acrylkleber um das Bildgebungsfenster der Edelstahl-Kopfplatte auf und befestigen Sie die Platte am Schädel. Tragen Sie mit dem hölzernen Ende eines Wattestäbchens Kleber auf die Innennähte des Bildfensters auf und achten Sie darauf, alle Lücken zwischen der Speicherfolie und der Krümmung des Schädels zu füllen. Geben Sie einen Tropfen des Leimbeschleunigers in das Fenster.

Wischen Sie dann schnell den Überschuss weg. Lasse den Kleber trocknen, sobald der Kleber vollständig getrocknet ist. Beginnen Sie mit einem Zahnbohrer, der mit einem 0,7 Millimeter dicken Fräser aus Edelstahl befestigt ist, den Schädel im Bildgebungsfenster zu verdünnen.

Abwechselndes Bohren mit gelegentlicher Anwendung von 0,9% steriler Kochsalzlösung. Um zu vermeiden, dass zu viel Hitze auf dem Schädel entsteht. Dünnen Sie ein vier mal vier Millimeter großes Fenster auf dem Schädel mit kleinen Strichen über die Schädeloberfläche aus.

Mit dem Zahnbohrer. Testen Sie die Dünnheit des Schädels mit einer Zange mit stumpfen Enden. Die Schädeloberfläche wird mit leichtem Druck leicht eingedrückt.

Die optimale Schädeldicke für die Bildgebung liegt zwischen 10 und 30 Mikrometern. Sobald der Schädel ausgedünnt ist, reinigen Sie das Fenster von allen Trümmern und geben Sie Kochsalzlösung auf den Schädel. Fotografieren Sie das Bildfenster mit einer Digitalkamera, die an einem Präparierfernrohr montiert ist.

Das Hirngefäßsystem auf diesem Foto hilft bei der Lokalisierung der Position für die Platzierung der Speicherfolie für nachfolgende Bildgebungssitzungen. Transportieren Sie das Tier zum Zwei-Photonen-Rig. Das Tier sollte auf der Heizdecke verbleiben und die Körpertemperatur sollte während der gesamten Bildgebungssitzung kontinuierlich überwacht werden.

Ein Zwei-Photonen-Mikroskop mit einem Mi Tai Laser. Zum Einsatz kommen eine 10 Watt Solid State Pumpe für maximale Leistung und eine modifizierte Olympus Flow View Konfokaleinheit. Das System ist für die Bildgebung von tiefem Gewebe optimiert und externe Detektoren werden so nah wie möglich am Objektiv installiert, um eine maximale Detektion der Fluoreszenz aus dem Gehirn zu ermöglichen. Fügen Sie dem Bildgebungsfenster mit niedrigem Digitalzoom einen Tropfen Kochsalzlösung hinzu.

Identifizieren Sie einen Bereich mit hell markierten Neuronen mit einer Digitalkamera, die am Mikroskop befestigt ist. Ips, machen Sie ein Foto des Bildgebungsbereichs. Dies ist notwendig, um zu einem späteren Zeitpunkt zum gleichen Bildgebungsort zurückzukehren.

Erhalten Sie einen Stapel mit geringer Vergrößerung über die gesamte sichtbare Ausdehnung des Gehirns, der das Ausmaß der dendritischen Verzweigung zeigt. Dies wird verwendet, um den Bildgebungsbereich zu späteren Zeitpunkten sowohl als Blutgefäße als auch als Dendriten zu lokalisieren. Bewahren Sie ihre Struktur bei jungen und erwachsenen Tieren mit Hilfe von Bildgebungssoftware.

Erhöhen Sie die digitale Vergrößerung um das Achtfache, passen Sie bei Bedarf die XY-Koordinaten an und sammeln Sie einen Stapel mit hoher Vergrößerung, der eine detaillierte dendritische Morphologie einschließlich der Lage und Struktur der dendritischen Stacheln zeigt. Machen Sie sich detaillierte Notizen zu jeder Stack-Sammlung, einschließlich Pan-Koordinaten, dem Bereich der Sammlung, der Z-Schrittgröße und der Anzahl der Schritte im Stack. Diese Notizen werden verwendet, wenn Sie zu einem späteren Zeitpunkt zu diesem Dendri oder Axon zurückkehren.

Entfernen Sie nach der Bildgebung die Kopfplatte, indem Sie sie vorsichtig von der Schädeloberfläche trennen. Mit einer Pinzette. Entfernen Sie alle Kleberreste und wischen Sie den Schädel mit 0,9% steriler Kochsalzlösung ab.

Nähen Sie die Haut über dem Schädel mit dem Nahtfaden Nummer sechs zusammen. Wischen Sie den Bereich nach dem bildgebenden Verfahren mit 70% Ethanol ab. Setzen Sie das Tier in einen sauberen Käfig unter einer Wärmelampe, bis es aufwacht und mobil ist.

Bringen Sie dann das Tier in seinen ursprünglichen Käfig zurück, um das Tier zu einem späteren Zeitpunkt zwischen zwei Tagen und vielen Monaten später erneut abzubilden, entfernen Sie die Fäden und öffnen Sie die Haut am Kopf wieder. Verwenden Sie mit aseptischen Methoden das digitale Bild des Hirngefäßsystems, das während der ersten Operation aufgenommen wurde, um die ursprüngliche Bildgebungsstelle zu lokalisieren. Befestigen Sie dann die Kopfplatte wieder wie zuvor.

Verwenden Sie bei Bedarf eine mikrochirurgische Klinge, um Knochen, die zwischen den Bildgebungszeitpunkten nachgewachsen sein könnten, vorsichtig auszudünnen. Mit einem Zahnbohrer verdünnen, das Bildgebungsfenster von Schmutz befreien und einen Tropfen 0,9 % sterile Kochsalzlösung auftragen. Tragen Sie das Tier zu einem Zwei-Photonen-Mikroskop und lokalisieren Sie den ursprünglichen Bildgebungsbereich anhand des digitalen Fluoreszenzbildes, das während der vorherigen Sitzung aufgenommen wurde.

Starten Sie das Flow-View-Programm. Öffnen Sie das Originalbild mit geringer Vergrößerung, kleben Sie ein Durchlichtblatt auf den Computerbildschirm und skizzieren Sie mit einem Transparentstift das Muster der wichtigsten Blutgefäße. Öffnen Sie anschließend das Live-Bild und richten Sie das Blutgefäßsystem wieder auf das skizzierte Muster auf der Durchlichtfolie aus.

Entfernen Sie die Transparenz, um die acht fach vergrößerten Strukturen neu abzubilden. Öffnen Sie den gewünschten gesammelten Stack aus der vorherigen Imaging-Sitzung. Skizzieren Sie die Struktur auf einer Durchlichtfolie, die auf dem Computerbildschirm angebracht ist.

Vergrößern Sie das Live-Bild achtfach und richten Sie das Bild an der Transparenz aus. Abhängig von der Genauigkeit der Ausrichtung des Ortes mit geringer Vergrößerung kann es erforderlich sein, auch den Winkel des Bildes leicht anzupassen und die Schwenkkoordinaten auf die Bildgebungsparameter des ersten Tages einzustellen, einschließlich Schrittgröße und Anzahl der gesammelten Bilder, die der Zack Re-Imaging kann zweimal durchgeführt werden. Die Häufigkeit, mit der die Kopfhaut geöffnet wird, sollte begrenzt werden, um eine Störung der Integrität des Schädels zu vermeiden, was bei GFPM-exprimierenden Mäusen zu einer schlechten Bildauflösung führt.

Eine Teilmenge der Parametallzellen der Schicht fünf und die entsprechenden dendritischen Prozesse wurden mit Hilfe der in vivo Zwei-Photonen-Laserscanning-Mikroskopie visualisiert, wobei GFP-markierte Dendriten des visuellen Kortex gezeigt werden. Dieses Bild ist die Projektion eines einzelnen Bildes, das alle fünf Mikrometer von der PIA bis zu einer endgültigen Tiefe von 175 Mikrometern aufgenommen wird. Die eingerahmte Region wird hier am Tag Null mit höherer Vergrößerung gezeigt, und hier erneut am vierten Tag mit höherer Vergrößerung eines dendritischen Astbildes vom Tag Null und vom vierten Tag im Vergleich.

Diese Bilder zeigen stabile Stacheln, die durch die weißen Pfeilspitzen gekennzeichnet sind, verlorene einziehende Stacheln, die durch rote Pfeilspitzen markiert sind, und neue Stacheln, die durch die grüne Pfeilspitze gekennzeichnet sind. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie eine chronische Zwei-Photonen-Bildgebung im visuellen Kortex der Maus mit einem dünnen Schädelpräparat durchführen können. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, während des Ausdünnungsprozesses besondere Sorgfalt walten zu lassen, um Schäden am Schädel und der darunter liegenden Dura zu vermeiden, da dies zu einer schlechten Bildauflösung führt, und detaillierte Notizen zu machen.

Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.