Experimentelle Metastasierung und CTL adoptiven Transfer Immuntherapie Maus-Modell

Eine experimentelle Lungenmetastasen und CTL Immuntherapie Mausmodell für die Analyse von Tumorzellen-T-Zell-Interaktion

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wirksamkeit der tumorspezifischen T-Zell-Adoptionstransfer-Immuntherapie in vivo zu untersuchen. Dies geschieht zunächst durch die Transplantation von Tumorzellen über laterale Schwanzveneninjektion an die Mäuse, um Lungenmetastasen zu etablieren. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, die tumortragenden Mäuse mit tumorspezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten-CTLs zu behandeln.

Der letzte Schritt besteht darin, Tusche als Mittel zur Visualisierung und Quantifizierung von Tumorknötchen zu verwenden. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die die CIE verschiedener Behandlungen durch Messung der Tumorgröße und Quantifizierung der Anzahl der Tumorknoten zeigen. Hallo, mein Name ist Mary Zimmerman und ich bin Mitglied im Labor von Dr. Kevin Lu am Medical College of Georgia.

Hallo, mein Name ist Shelene Hu, ich studiere im zweiten Jahr und arbeite auch im Labor von Dr. Lou. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen Methoden wie Überlebenskurven besteht darin, dass dieses Verfahren sowohl qualitativ als auch quantitativ ist. Die Implikation der Techniken kann sich auf die Krebstherapie erstrecken, da sie die adoptive Immuntherapie mit T-Zellen bei menschlichen Krebspatienten nachahmt.

Fangen wir also an: Am Tag vor der Tumorzellinjektion wird ein T 75 Kolben mit bis zu einem mal 10 auf den siebten ausgesät. CMS vier Met-Zellen in 10 Millilitern RPMI-Medium mit 10 % Serum. Um schnell wachsende Tumorzellen zu erhalten, inkubieren sie am Tag der Injektion über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Entfernen Sie das Medium und spülen Sie die Zellen einmal mit PBS, dann ernten Sie die Tumorzellen mit 0,05 % Trypsin-EDTA bei 37 Grad Celsius für fünf Minuten. Stoppen Sie die Reaktion mit 10 Millilitern RPMI-Medium mit 10 % Serum. Übertragen Sie die Zellen in ein konisches Röhrchen.

Schleudern Sie die Zellen drei Minuten lang bei 1300 U/min in einer val legend RT Zentrifuge. Bei Raumtemperatur das Snat entfernen, die Zellen in 10 Millilitern frischem XHB Ss zum Waschen resuspendieren. Dann wieder nach unten drehen und auf die gleiche Weise wieder aufhängen.

Zählen Sie die Tumorzellen auf einem Hämo. Zytometer. Verdünnen Sie die Zellen in HBSS so, dass die für jede Injektion benötigten Zellen resuspendiert werden. In einem Gesamtvolumen von 100 Mikrolitern erwärmen sie die sechs bis acht Wochen alten B-SEA-Mäuse in einem Becherglas, in warmes Wasser getaucht.

Um die Schwanzvene zu erweitern, legen Sie die Maus in einen Schwanzvenenhalter auf der Bank. Verwenden Sie eine Mikrospritze, um 100 Mikroliter Tumorzellen in die laterale Schwanzvene zu injizieren. Verwenden Sie eine septische Technik, um eine Infektion nach der Injektion zu vermeiden.

Üben Sie leichten Druck auf die Injektionsstelle aus, bis die Blutung aufgehört hat. Setzen Sie die Maus wieder in den Käfig ein und lassen Sie den Tumor bis zum gewünschten Stadium wachsen. Pipettieren Sie am Tag des Transfers nach oben und unten, um die vorbereiteten gereinigten zytotoxischen T-Lymphozyten oder CTLs zu resuspendieren.

Wie im Text beschrieben, übertragen Sie alle Zellen von einer Platte in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen, wobei das Volumen nicht mehr als zwei Drittel des Röhrchens überschreiten darf. Führen Sie eine sterile Pasteur-Pipette in das konische Röhrchen ein und schichten Sie die Lymphozytentrennung. Medium oder LSM unter den Zellen, bis sich das Gesamtvolumen 14 Millilitern nähert.

Achten Sie darauf, die Schichten nicht zu stören. Zentrifugieren Sie eine Drehzahl von 2000 U/min für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Verwenden Sie die Bremse nicht, um den Rotor nach dem Schleudern zu verlangsamen, sondern übertragen Sie die CTLs auf ein neues konisches 15-Milliliter-Rohr.

Fügen Sie HBSS zu einem Volumen von etwa 10 Millilitern hinzu. Zum Waschen. Zählen Sie die Zellen, drehen Sie sich fünf Minuten lang bei 1300 U/min herunter und resuspendieren Sie ein HBSS bei Raumtemperatur auf die erforderliche Zelldichte für die Injektion

Das Gesamtvolumen pro Injektion sollte bei 100 Mikrolitern gehalten werden. Verwenden Sie die gleiche Schwanzinjektionstechnik wie zuvor in diesem Video zu sehen. Um die CTLs in tumortragende Mäuse zu injizieren, bringen Sie die Maus zurück in den Käfig und lassen Sie die CTLs mit dem Tumor interagieren.

Mäuse werden in der Regel 14 bis 21 Tage nach der CTL-Behandlung für die Analyse getötet. Um Lungenmetastasen sichtbar zu machen, legen Sie eine geopferte Maus auf den Rücken auf eine Styroporplatte. Stecken Sie die Beine fest, um einen ungehinderten Zugang zur Luftröhre zu gewährleisten.

Besprühen Sie die Bauchseite mit 70% Ethanol, beginnend mit dem Mittelbauch. Schneide mit einer Schere entlang der Mittellinie durch den Brustkorb und nach oben zu den Speicheldrüsen. Legen Sie die Luftröhre frei.

Verwenden Sie eine Pinzette, um das Gewebe zu entfernen, das die Luftröhre umgibt. Fädeln Sie eine 200-Mikroliter-Pipettenspitze unter die Luftröhre und halten Sie die Spitze mit einer Hand fest. Hebe die Luftröhre sanft nach oben und vom Körper weg.

Drehen Sie die Plattform um 180 Grad. Verwenden Sie eine 50-Milliliter-Spritze, um Tusche über die Luftröhre in die Lunge zu injizieren. Blase die Lunge vollständig mit Tinte auf, bis du einen starken Widerstand spürst.

Schneide die Luftröhre mit einer Schere durch. Schieben Sie eine Pinzette unter die Lunge und heben Sie sie aus der Maus. Spülen Sie die Lunge kurz in einem Ein-Liter-Becherglas Wasser in einem chemischen Abzug.

Die Lunge wird in eine Glasgalle mit fünf Millilitern FTI-Lösung gegeben. Das Tumorgewebe tritt als weiße Knötchen auf der schwarzen Lunge aus. Nach einigen Minuten können die Tumore nun gezählt werden und auf unbestimmte Zeit in FTI-Lösung beginnen. Hier.

Lungen von Mäusen, die mit Mammakarzinom transfiziert wurden. Die Zelllinie vier T eins zeigt weiße Flecken, die auf Tumore hinweisen. Mäuse, die mit einer IRF 8-dominanten negativen Immunität gegen K 79 E transfiziert wurden, zeigen ein erhöhtes metastasierendes Potenzial von Tumorzellen.

Diese Bilder zeigen eine histologische Analyse der Wirksamkeit der CTL-Immuntherapie mit adoptivem Transfer. Tumortragende Mäuse, denen Kochsalzlösung injiziert wurde, zeigten sechs Tage später mehrere Tumore, die durch Pfeile angezeigt wurden. Mäuse, denen tumorspezifische T-Zellen injiziert wurden, zeigten dagegen im gleichen Experiment eine Reduktion von Tumoren.

Die Tuschebehandlung bietet eine einfachere Möglichkeit, die Wirksamkeit des CTL-Adoptionstransfers zu messen. Hier unterscheiden sich die weißen Tumorknoten an tumortragenden Lungen deutlich von Lungen, die erfolgreich einem CTL-Adoptionstransfer unterzogen wurden, und die Zählung der Knoten ermöglicht eine Quantifizierung, die mit der Histologie nicht möglich ist. Während Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Mäuse aufzuwärmen, um eine einfachere und genauere Schwanzveneninjektion zu ermöglichen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Wirksamkeit der Behandlung durch dieses einfache Verfahren zur Quantifizierung der Tumorgröße und -anzahl beurteilen können. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.