Name: Axoplasma Isolation von Rat Ischiasnerv (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-24T17:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Lernen Sie die Isolierung von Axoplasma aus dem Nervus ischiadicus der Ratte. Diese Methode nutzt hypotone Inkubation und Zentrifugation, um reines axonales Zytoplasma für biochemische Analysen zu gewinnen.

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Dieses Protokoll ermöglicht Axoplasma Isolation mit der Minimierung der Glia-und Gefäßgewebe Kontamination. Die Methode liefert etwa 70-100 ug Gesamt Axoplasma Protein pro 8-10 Wochen alte Wistar-Ratte. 1. Dissect Ischiasnerven <ol><li> Euthanize zwei Ratten durch CO 2-Inhalation durch Genickbruch folgte. Bestätigen Tod durch Palpation wegen fehlender Herzschlag vor Beginn der Dissektion. </li><li> Swab der Präparation mit 70% Ethanol. </li><li> Schneiden Sie die Haut, separate Muskeln und isolieren Ischiasnerv mit einer Schere und Pinzette vorsichtig ohne Beschädigung der Blutgefäße. Dissect sowohl Ischiasnerv (ca. 1,5 cm) von jedem Tier und sammeln Sie alle vier Nerven in einer Eppendorf mit 500 ul PBS von 0,2 + Inhibitoren, auf Eis gehalten. </li><li> Übertragen Sie die Nerven Segmente Plastikschalen mit mindestens 2 mL PBS von 0,2 + Protease-Inhibitoren. </li><li> Entfernen Sie das Epineurium von den Nerven mit feinen Pinzetten unter dem Binokular Umfang. Trennen Sie die Faszikel sehr sorgfältig, bis sie bedeckt werden und beginnen, auf der Oberfläche der Lösung schwimmen. Dieser Schritt sollte geübt werden, bis sie schnell und präzise durchgeführt werden können (nicht an mehr als 10 Minuten pro Nerv) werden. </li></ol> 2. Inkubation, Waschen und Elution <ol><li> Übertragung getrennt Faszikeln in ein frisches Eppendorf-Röhrchen mit 500 ul PBS 0.2X mit Protease-Inhibitoren für die Inkubation für 2 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Wash mindestens 3-mal mit 1 mL des gleichen Puffers durch die Übertragung der Faszikel von Eppendorf-Röhrchen zu Eppendorf-Röhrchen und Schütteln für 5 min nach dem Transfer. </li><li> So entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit legte die Faszikel in eine neue, leere Eppendorf-Röhrchen und übertragen dann die Faszikel, um eine neue Eppendorf-Röhrchen mit 300 ul PBS 1X mit Protease-Inhibitor für die Inkubation für 20-30 min bei RT. </li><li> Zentrifuge 10 min bei 10.000 xg bei 4 ° C. </li><li> Nehmen Sie den Überstand und messen Proteinkonzentration. Dies ist Ihr Axoplasma Vorbereitung. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2087/2087fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Western-Blot-Vergleich Axoplasma durch die manuelle Squeeze-Methode mit Axoplasma Proben isoliert, wie in diesem Protokoll isoliert dargestellt. Beachten Sie die reduzierte Mengen an Albumin und GFAP, was Blut Protein-und Gliazellen Verunreinigungen beziehungsweise. Im Gegensatz dazu ist axonalen Tubulin b3 in dieser Zubereitung angereichert, was auf eine hohe axonale Proteine.

<ol><li>Hanz, S., Perlson, E., Willis, D., Zheng, J. Q., Massarwa, R., Huerta, J. J., Koltzenburg, M., Kohler, M., van-Minnen, J., Twiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasmic+importins+enable+retrograde+injury+signaling+in+lesioned+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Axoplasmic importins enable retrograde injury signaling in lesioned nerve.</a> Neuron. 40, 1095-1104 (2003).</li>
<li>Michaelevski, I., Medzihradszky, K. F., Lynn, A., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+transport+proteomics+reveals+mobilization+of+translation+machinery+to+the+lesion+site+in+injured+sciatic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Axonal transport proteomics reveals mobilization of translation machinery to the lesion site in injured sciatic nerve.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (5), 976-987 (2010).</li>
<li>Rishal, I., Michaelevski, I., Rozenbaum, M., Shinder, V., Medzihradszky, K. F., Burlingame, A. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axoplasm+isolation+from+peripheral+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Axoplasm isolation from peripheral nerve.</a> Dev Neurobiol. 70, 126-133 (2010).</li>
<li>Twiss, J. L., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomes+in+axons--scrounging+from+the+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Ribosomes in axons--scrounging from the neighbors.</a> Trends Cell Biol. 19, 236-243 (2009).</li>
</ol>

Biochemische und Proteom-Analysen haben bestätigt, dass dieses Verfahren Serum und Gliazellen Verschmutzungsgrad 3 reduziert wie zuvor beschriebenen Verfahren zur Isolierung Axoplasma durch mechanische Squeeze 1 verglichen. Wir haben diese Axoplasma Isolation Protokoll verwendet, um Dynein-basierte retrograde Signalisierung nach Ischiasnerv Verletzung 2 zu erforschen, und erwarten, dass es Nutzen in der Erforschung von vielen anderen Prozessen in der Erwachsenenbildung peripheren Nerven,...

<ul><li> Männliche Wistar-Ratten (8-10 Wochen alt) </li><li> PBS von 0,2 und PBS 1X Lösungen mit Protease-Inhibitoren (Rosche) 2 Tabletten pro 50 ml </li><li> Eppendorfs für 1,5 ml </li><li> Sterilisiert Plastikschalen 35 mm </li><li> Dissecting Tools wie: Schere und feinen Pinzette </li><li> Fernglas und Tischleuchte </li></ul> Antibodies Maus anti-GFAP Klon GA-5 wurde von Sigma (G6171). Kaninchen-anti-Albumin wurde aus Cedarlane (CLAG5140). Maus anti-Tubulin β3 und Kaninchen-Anti-Gerk wurden von Sigma (T2200 und M5670 jeweils).

axoplasma isolation von rat ischiasnerv

Axoplasm Isolation from Rat Sciatic Nerve

Isolierung von reinem axonalen Zytoplasma (Axoplasma) von peripheren Nerven ist entscheidend für biochemische Untersuchungen von vielen biologischen Prozessen. In diesem Artikel zeigen wir, und beschreiben Sie ein Protokoll für Axoplasma Isolierung von adulten Ratten Ischiasnerv auf den folgenden Schritten: (1) Zerlegung der Nervenfaszikel und Trennung von Bindegewebe, (2) Inkubation von kurzen Segmenten Nervenfaszikel in hypotonischen Medium Myelin Freigabe und lysieren nicht axonalen Strukturen, und (3) Extraktion der verbleibenden Axon-angereichertem Material. Proteomik und biochemische Charakterisierung dieser Zubereitung hat einen hohen Grad der Anreicherung für axonale Komponenten bestätigt.

Wir zeigen, ein Protokoll für Axoplasma Isolierung von adulten Ratten Ischiasnerv auf Dissektion Nervenfaszikel und Inkubation in hypotonischen Medium Myelin Freigabe und lysieren nicht axonaler Strukturen, die durch Extraktion der restlichen Axon-angereichertem Material gefolgt basiert.

Axoplasma Isolation von Rat Ischiasnerv

Die Isolierung von reinem axonalem Zytoplasma (Axoplasma) aus peripheren Nerven ist entscheidend für biochemische Untersuchungen zahlreicher biologischer Prozesse. In diesem Artikel ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen reinen axonalen Zytoplasma- oder Ektoplasmaanteil aus einem peripheren Nerv zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der Nervus ischiadicus präpariert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Bindegewebe vom Nerv zu entfernen und die Sles zu isolieren.Der dritte Schritt des Verfahrens ist die Inkubation kurzer Nervenfasern in hypotonem Medium. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Inkubation in isotoner Lösung, Zentrifugation und Opsm Milian. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels Western-Blot-Analyse einen hohen Grad der Anreicherung axonaler Bestandteile zeigen.Hallo, mein Name ist I, Elle And I may Rosenbaum. Wir stammen aus dem Labor von Professor Mike F Labor, Abteilung für Biochemie, am Institute of Science. Heute werden wir eine neue Technik der Oxy-Opat-Mesylierung vorstellen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der manuellen Quetsch-OIS des peripheren Nervs besteht darin, dass dieses Verfahren die Kontamination durch Serum und Glia reduziert und so die axonalen Inhalte erreicht. Wir haben diese neue Technik für die opPLA-Methylierung

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Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Aufgrund der Einfachheit des chirurgischen Eingriffs und der robusten Verhaltensauffälligkeiten, ist eine chronische Verengung der Ischiasnerv eines der herausragenden Tiermodellen des neuropathischen Schmerzes. Innerhalb von 24 Stunden nach der Operation wird Schmerzen Überempfindlichkeit gegründet und kann quantitativ gemessen werden mit Hilfe eines von Frey Aesthesiometer (mechanische Prüfung) und plantar Analgesie Meter (Thermal-Test).

Chronische Verengung des Ischiasnerv und Schmerzen Überempfindlichkeit Testing in Ratten

Dieses Video zeigt die Isolierung und Kultivierung von Schwann-Zellen aus den Spinalwurzeln der Maus. Isolierte Zellen werden dann in speziellen Medien kultiviert. Schwann-Zellen werden über differentiellen Verdau und Adhärenz isoliert. Anschließend werden sie zur Befestigung und Proliferation auf mit extrazellulärer Matrix beschichtete Deckgläser übertragen.

Isolierung von Schwann-Zellen aus spinalen Wurzeln der Maus

Dieses Video zeigt eine Methode zur Isolierung von Schwann-Zellen aus Ischias-Nervenfasern von Mäusen.

Magnetische Trennung von Schwann-Zellen von Ischiasnerven der Maus

Dieses Video zeigt eine Einzelfaseraufzeichnung der C-Faser-Nervenleitung bei Ratten. Eine anästhesierte Ratte wird eingeschnitten, um den Ischiasnerv freizulegen, der die unteren Gliedmaßen sensorisch und motorisch versorgt. Anschließend werden die einzelnen C-Fasern freigelegt. Die elektrische Stimulation erfolgt mit Hilfe von Stimuluselektroden, die in den Fuß implantiert werden, und eine Reaktion wird von einer einzelnen Nervenfaser aufgezeichnet.

In vivo Einzelfaseraufzeichnung von C-Fasern des Ischiasnervs bei Ratten

Hier präsentieren wir eine in vivo Technik für den Gentransfer zu Schwann-Zellen (SCs) im Ischiasnerv der Nagetiere. Diese einfache Technik ist nützlich, um Signalmechanismen zu untersuchen, die an der Entwicklung und Aufrechterhaltung myelinisierender SCs beteiligt sind.

In vivo - Gentransfer auf Schwann - Zellen in der Nagerischiasnerv durch Elektroporation

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die hydraulische Extrusion des Rückenmarks sowie die Identifizierung und Isolierung spezifischer Spinsalwurzelganglien (DRGs) im selben Nagetier. Im Vergleich zu herkömmlichen Methoden zur Isolierung des Rückenmarks ist diese Methode deutlich schneller und reduziert das Risiko von Gewebeschäden.

Hydraulische Extrusion des Rückenmarks und Isolierung von Dorsalwurzelganglien in Nagetiere

Die Singlefaseraufzeichnung ist eine effektive elektrophysiologische Technik, die auf das zentrale und periphere Nervensystem anwendbar ist. Zusammen mit der Vorbereitung der intakten DRG mit dem angeschlossenen Ischiasnerv wird der Mechanismus des Leitungsversagens untersucht. Beide Protokolle verbessern das Verständnis der Beziehung des peripheren Nervensystems mit Schmerzen.

Verwendung von In Vivo Single-Faser-Aufnahme und intakten DorsalWurzel Ganglion mit angeschlossenem Ischiasnerv, um den Mechanismus des Leitungsversagens zu untersuchen

Diese Methode ermöglicht die Aufzeichnung der Kraft von zuckenden und tetanischen Kontraktionen und Aktionspotentialen in drei Arten von Motoreinheiten im ratmedialen Gastrocnemius-Muskel. Die funktionelle Isolierung einer einzelnen Motoreinheit wird durch elektrische Stimulation des Axons induziert.

Funktionelle Isolierung von einzelnen Motoreinheiten von Ratte Medial Gastrocnemius Muskel

Dieses Protokoll beschreibt die Vorbereitung von ganzem Ischiasnervengewebe der Ratte für die elektrophysiologische Stimulation ex vivo und die Aufzeichnung in einem umweltregulierten, durchbluteten Salzbad mit zwei Kompartimenten.

Vorbereitung des Rattenischiasnervs für die Ex-vivo-Neurophysiologie

Im Kokultursystem von dorsalen Wurzelganglien und Schwann-Zellen kann die Myelinisierung des peripheren Nervensystems untersucht werden. Dieses Modell bietet experimentelle Möglichkeiten zur Beobachtung und Quantifizierung der peripheren Myelinisierung und zur Untersuchung der Auswirkungen von Wirkstoffen auf die Myelinscheide.

In vitro Myelinisierung peripherer Axone in einer Kokultur von Dorsalwurzelganglienexplantaten der Ratte und Schwann-Zellen

Lernen Sie die Isolierung von Axoplasma aus dem Nervus ischiadicus der Ratte. Diese Methode nutzt hypotone Inkubation und Zentrifugation, um reines axonales Zytoplasma für biochemische Analysen zu gewinnen.

Axoplasma Isolation von Rat Ischiasnerv

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