Axoplasma Isolation von Rat Ischiasnerv
24. September 2010
Wir zeigen, ein Protokoll für Axoplasma Isolierung von adulten Ratten Ischiasnerv auf Dissektion Nervenfaszikel und Inkubation in hypotonischen Medium Myelin Freigabe und lysieren nicht axonaler Strukturen, die durch Extraktion der restlichen Axon-angereichertem Material gefolgt basiert.
Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, reines axonales Zytoplasma oder Ektoplasma aus dem peripheren Nerv zu isolieren. Dazu wird zunächst der Ischiasnerv präpariert. Der zweite Schritt des Eingriffs besteht darin, das Bindegewebe vom Nerv zu entfernen und die Bindeglieder abzutrennen.
Der dritte Schritt des Verfahrens ist die Inkubation kurzer Nervensegmente in hypotonischem Medium. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Inkubation in isotonischer Lösung, Zentrifugation und Opsm Milian. Letztlich können Ergebnisse erzielt werden, die durch die Western-Blot-Analyse einen hohen Grad an Anreicherung für axonale Komponenten zeigen.
Hallo, mein Name ist ich, Elle und ich darf Rosenbaum. Wir sind aus dem Labor von Professor Mike F Labor Department of Biological Chemistry based Institute of Science. Heute stellen wir eine neue Technik der Oxy Opat Mesylierung vor.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der manuellen Quetschung des OIS des peripheren Nervs. Das heißt, dass dieses Verfahren das Serum reduziert und die Kontamination der Glos den axonalen Inhalt erreicht. Wir haben diese neue Technik für die Methylierung von op PLAs verwendet, um die D-basierte Retro-Signalgebung nach einer Verletzung des Ischiasnervs zu untersuchen.
Also lasst uns loslegen. Legen Sie eine von zwei euthanasierten acht bis zehn Wochen alten Wistar-Ratten auf die Seite auf eine Präpariermatte, um einen direkten Zugang zum distalen Teil des Ischiasnervs zu erhalten. Rasieren Sie die Haut in der Mitte des Oberschenkels und tauschen Sie sie gründlich gegen 70%Ethanol aus.
Schneide mit einer Schere die Haut vom Oberschenkel ab. Schneiden Sie vorsichtig durch das Fett- und Bindegewebe zwischen dem Oberschenkelbizeps und der oberflächlichen Gesäßmuskulatur. Heben Sie mit einer Pinzette den freiliegenden Bereich des Ischiasnervs an und entfernen Sie ihn.
Der entfernte Abschnitt wird etwa 1,5 Zentimeter lang sein. Übertragen Sie den Nerv auf 500 Mikroliter eiskaltes 2X PBS mit Proteaseinhibitoren in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie die Tube auf Eis.
Wiederholen Sie den Präpariervorgang auf der anderen Seite der Ratte und auf beiden Seiten einer zweiten Ratte. Kratzen Sie den Boden einer Petrischale mit einer Pasterpipette ab und füllen Sie sie mit zwei Millilitern Raumtemperatur. Punkt zwei X PB s mit Proteaseinhibitoren.
Übertragen Sie einen einzelnen Nerv auf die Schale unter dem Präpariermikroskop. Verwenden Sie eine feine Pinzette, um das Epi nearium aus dem Nerv zu entfernen, indem Sie es wegziehen und wegwerfen, wobei die Fazilien in der Schale verbleiben. Trennen Sie die Fäkalien vorsichtig voneinander und vom Boden der Schüssel.
Einzelne Fales werden trüb und schwimmen auf der Oberfläche der Lösung. Die abgetrennten Flakes werden sofort in ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 500 Mikrolitern 0,2 x PB s mit Proteaseinhibitoren überführt. Halten Sie die Sles auf Eis.
Trennen und sammeln Sie mit Übung die Sles von den restlichen Ischias in der Tube. Entfernung des Epineuriums und Abtrennung der Schles. Sollte nicht länger als 10 Minuten pro Nerv dauern.
Entfernen Sie das Röhrchen mit dem abgetrennten SLES aus dem Eis. Zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, um nichtaxonale Strukturen von Myelin und Läusen freizusetzen. Waschen Sie die Sles bei jeder Wäsche.
Heben Sie die Sles mit einer Pinzette vorsichtig an und übertragen Sie sie in ein frisches Röhrchen, das einen Milliliter 2X PB s mit Proteaseinhibitoren enthält. Schütteln Sie die Tube auf einer Wippe fünf Minuten lang. Waschen Sie das SLES auf diese Weise dreimal nach dem Waschen.
Übertragen Sie das SLES in ein frisches, leeres Einor-Röhrchen, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und geben Sie es dann in ein Röhrchen mit 300 Mikrolitern eines XPBS mit Proteus-Inhibitoren, inkubieren Sie es 20 bis 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Um den Opsm zu eluieren, stören höhere Salzkonzentrationen weitere Proteomik-Verfahren. Zentrifugieren Sie den Faszikel bei 10.000 Käse für 10 Minuten bei vier Grad Celsius, um das Gewebe und die Zelltrümmer zu pelletieren, und pipettieren Sie den Überstand in ein sauberes Einor-Röhrchen.
Der erhaltene Überstand. Sollte klar sein. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die Proteinkonzentration zu messen.
Es sollte eine Ausbeute von 200 bis 250 Mikrogramm Protein erzielt werden. Lagern Sie das op-Plasmapräparat in Aliquoten bei minus 80 Grad Celsius bis zu sechs Monate. Vermeiden Sie Auftau- und Gefrierzyklen.
Hier ist ein westlicher Block, der Op-Plasma, das durch die manuelle Squeeze-Methode isoliert wurde, mit Opsm-Proben vergleicht, die wie in diesem Protokoll isoliert wurden. Beachten Sie die reduzierten Albumin- und GFAP-Werte, die für Blutprotein- bzw. Gliazellkontaminationen stehen. Im Gegensatz dazu ist axonales Tubulin beta drei in diesem Präparat angereichert, was auf einen hohen Gehalt an axonalen Proteinen hinweist.
Nachdem Sie sich dieses ganze Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Nervus satic seziert und wie man Paco richtig trennt. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.
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Überblick
Dieser Artikel präsentiert ein detailliertes Protokoll zur Isolierung von Axoplasma aus dem Ischiasnerv erwachsener Ratten. Die Methode umfasst die Dissektion von Nervenbündeln und die Inkubation in einem hypotonen Medium, um Myelin effektiv freizusetzen und nicht-axonale Strukturen zu lysieren, was zur Extraktion von axonangereichertem Material führt.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Axonale Forschung
Hintergrund
- Die Isolierung des axonalen Zytoplasmas ist entscheidend für die Untersuchung der neuronalen Funktion.
- Der Ischiasnerv dient als Modell für peripheren Nervenstudien.
- Das Verständnis axonaler Komponenten kann die neurologische Forschung unterstützen.
- Frühere Methoden liefern möglicherweise kein reines axonales Material.
Zweck der Studie
- Zur Entwicklung eines zuverlässigen Protokolls für die Axoplasma-Isolierung.
- Zur Verbesserung der Reinheit des axonalen Zytoplasmas für weitere Analysen.
- Zur Erleichterung der Untersuchung axonaler Komponenten mit biochemischen Techniken.
Verwendete Methoden
- Dissektion des Ischiasnervs zum Zugang zu Nervenbündeln.
- Entfernung des Bindegewebes um den Nerv.
- Inkubation von Nervensegmenten in einem hypotonen Medium.
- Anschließende Zentrifugation und Inkubation in isotonischer Lösung.
Hauptergebnisse
- Das Protokoll isoliert erfolgreich axonales Zytoplasma.
- Die Western-Blot-Analyse bestätigt eine hohe Anreicherung axonaler Komponenten.
- Die Ergebnisse demonstrieren die Wirksamkeit der Methode.
- Potenzielle Anwendungen bei der Untersuchung der axonalen Biologie werden hervorgehoben.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen robusten Ansatz für die Axoplasma-Isolierung.
- Sie kann in verschiedenen Studien im Zusammenhang mit der neuronalen Funktion eingesetzt werden.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der axonalen Struktur und Funktion bei.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Isolation of pure axonal cytoplasm enables mechanistic de-risking in target validation for neurodegenerative disease programs. This protocol supports predictive confidence by reducing biological noise from non-axonal contaminants in peripheral nerve models. It provides a disease-relevant system for studying axonal signaling pathways relevant to neurotherapeutic discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of axonal protein composition to clarify therapeutic hypotheses.
- Operational Value: Reduces glial and serum contamination that obscures target engagement signals.
- Predictive Value: Supports functional target validation through enrichment of axonal components like tubulin beta three.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized axon-enriched lysates suitable for biochemical screening.
- Quantitative Output: Permits spectrophotometric protein concentration measurement for normalization.
- Reproducibility: Consistent yield of 200-250 micrograms supports reliable compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models peripheral nerve injury and retrograde signaling after sciatic nerve trauma.
- Translational Continuity: Bridges discovery to preclinical validation of axonal biology targets.
- Risk-Adjusted Decisions: Facilitates go/no-go decisions based on axonal target modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to preclinical validation of axonal modulators.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by isolating axonal cytoplasm for proteomic profiling.
- Screening: Enables preparation of standardized lysates for compound effect assessment.
- Analytics: Western blot analysis provides quantitative readouts for axonal enrichment.
- Translational Research: Connects to retrograde signaling studies relevant to nerve injury models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for peripheral nerve target de-risking.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through high enrichment of axonal components and reduced contaminant signals.
- Operational Value: Standardized dissection and incubation steps ensure reproducibility across labs.
- Strategic Value: Better target prioritization by minimizing false positives from glial or blood proteins.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted advancement of neurotherapeutic candidates based on clean axonal readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in peripheral nerve dissection and sterile technique.
- Needs centrifuge, spectrophotometer, and protease inhibitor infrastructure.
- Demands standardization of hypotonic incubation timing across operators.
- Adaptation considerations for other nerve types or species beyond rat sciatic nerve.
- Practical limitation: Procedure duration limits high-throughput application without automation.
