Axoplasma Isolation von Rat Ischiasnerv

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen reinen axonalen Zytoplasma- oder Ektoplasmaanteil aus einem peripheren Nerv zu isolieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der Nervus ischiadicus präpariert wird. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, das Bindegewebe vom Nerv zu entfernen und die Sles zu isolieren.

Der dritte Schritt des Verfahrens ist die Inkubation kurzer Nervenfasern in hypotonem Medium. Der letzte Schritt des Verfahrens ist die Inkubation in isotoner Lösung, Zentrifugation und Opsm Milian. Letztendlich können Ergebnisse erzielt werden, die mittels Western-Blot-Analyse einen hohen Grad der Anreicherung axonaler Bestandteile zeigen.

Hallo, mein Name ist I, Elle And I may Rosenbaum. Wir stammen aus dem Labor von Professor Mike F Labor, Abteilung für Biochemie, am Institute of Science. Heute werden wir eine neue Technik der Oxy-Opat-Mesylierung vorstellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der manuellen Quetsch-OIS des peripheren Nervs besteht darin, dass dieses Verfahren die Kontamination durch Serum und Glia reduziert und so die axonalen Inhalte erreicht. Wir haben diese neue Technik für die opPLA-Methylierung verwendet, um die D-basierte retrograde Signalgebung nach einer Verletzung des Nervus ischiadicus zu untersuchen.

Beginnen wir nun. Legen Sie eine von zwei euthanasierten Wistar-Ratten im Alter von acht bis zehn Wochen seitlich auf eine Präparationsunterlage, um einen direkten Zugang zum distalen Teil des Nervus ischiadicus zu erhalten. Rasieren Sie die Haut in der Mitte des Oberschenkels und desinfizieren Sie sie gründlich mit 70 %igem Ethanol.

Verwenden Sie eine Schere, um die Haut vom Oberschenkel abzuschneiden. Schneiden Sie vorsichtig durch das Fett- und Bindegewebe zwischen den Muskeln Musculus biceps femoris und Musculus gluteus superficialis. Heben Sie mit einer Pinzette den freigelegten Bereich des Nervus ischiadicus an und entfernen Sie ihn.

Der entfernte Abschnitt wird etwa 1,5 Zentimeter lang sein. Überführen Sie den Nerv in 500 µL eiskaltes 2X PBS mit Proteaseinhibitoren in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Bewahren Sie das Röhrchen auf Eis auf.

Wiederholen Sie den Dissektionsvorgang auf der anderen Seite der Ratte und auf beiden Seiten einer zweiten Ratte. Kratzen Sie den Boden einer Petrischale mit einer Pasteurpipette an und füllen Sie sie mit zwei Millilitern Raumtemperatur. Punkt zwei X PBs mit Proteaseinhibitoren.

Übertragen Sie einen einzelnen Nerv in die Petrischale unter dem Stereomikroskop. Entfernen Sie mit feinen Pinzetten das Epineurium vom Nerv, indem Sie es abziehen, und entsorgen Sie es, sodass die Faszikel in der Schale verbleiben. Trennen Sie die Faszikel vorsichtig voneinander und vom Boden der Schale.

Einzelne Fäles werden trüb und schwimmen an der Oberfläche der Lösung. Überführen Sie die separierten Fäles unverzüglich in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 500 Mikroliter 0,2 X PB s mit Proteaseinhibitoren enthält. Bewahren Sie die Sles auf Eis auf.

Trennen und sammeln Sie die Sles unter praktischen Übungen vom verbleibenden Ischiasnerv im Gefäß. Die Entfernung des Epineuriums und die Trennung der Sles sollten pro Nerv nicht länger als 10 Minuten dauern.

Entfernen Sie das Röhrchen mit dem getrennten SLES aus dem Eis. Inkubieren Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur, um Myelin und nicht-axonalen Strukturen freizusetzen. Waschen Sie die SLES bei jeder Wäsche.

Heben Sie die SLES vorsichtig mit einer Pinzette an und überführen Sie sie in ein frisches Gefäß, das ein Milliliter 2X PB s mit Proteaseinhibitoren enthält. Schütteln Sie das Gefäß fünf Minuten lang auf einem Rüttler. Waschen Sie die SLES auf diese Weise dreimal nach dem Waschen.

Überführen Sie das SLES in ein frisches, leeres Einor-Gefäß, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und überführen Sie es anschließend in ein Gefäß, das 300 Mikroliter 1× PBS mit Proteaseinhibitoren enthält; inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 20 bis 30 Minuten. Um die Opsm eluieren zu können, stören höhere Salzkonzentrationen weitere Proteomik-Verfahren. Zentrifugieren Sie das Faszikel 10 Minuten bei 10.000 ×g und 4 °C, um das Gewebe und Zelltrümmer zu pelletieren, und pipettieren Sie das Überstand in ein sauberes Einor-Gefäß.

Das erhaltene Überstand sollte klar sein. Verwenden Sie ein Spektrophotometer, um die Proteinkonzentration zu messen.

Eine Ausbeute von 200 bis 250 Mikrogramm Protein sollte erhalten werden. Lagern Sie die op-Plasmidpräparation in Aliquoten bei minus 80 Grad Celsius bis zu sechs Monate lang. Vermeiden Sie Auftau- und Einfrierzyklen.

Hier ist eine Western-Blot-Analyse, die op-Plasmid, das mit der manuellen Quetschmethode isoliert wurde, mit opsm-Proben vergleicht, die wie in diesem Protokoll beschrieben isoliert wurden. Beachten Sie die verringerten Mengen an Albumin und GFAP, die jeweils für Kontaminationen mit Blutproteinen und Gliazellen stehen. Im Gegensatz dazu ist axonales Tubulin-beta-3 in dieser Präparation angereichert, was auf einen hohen Gehalt an axonalen Proteinen hinweist.

Nachdem Sie sich dieses gesamte Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man den Nervus ischiadicus disseziert und wie man Paco ordnungsgemäß trennt. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.