Name: Expression, Waschmittel Solubilisierung und Reinigung von einer Membran Transporter, der MexB Multidrug Resistance Protein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Lernen Sie die Expression, Solubilisierung und Reinigung des Membrantransporters MexB aus Pseudomonas aeruginosa in E. coli. Diese Methode nutzt IMAC und Gelpermeationschromatographie für die Analyse von Multidrug-Resistance-Mechanismen.

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Dieses Projekt wurde durch Zuschüsse zu CJJ von der National Science Foundation und der Gesellschaft für Biomolekulare Wissenschaften unterstützt.

1. Tag 1: MexB von Pseudomonas aeruginosa wird durch pFB101 kodiert. Die MexB Gen wurde aus P. verstärkt aeruginosa genomische DNA und in die NdeI und XhoI Restriktionsschnittstellen des pET30b + Vektor. Das Konstrukt enthält einen C-terminalen Hexa-Histidin-tag. <ol><li> Das Plasmid wird verwendet, um E. verwandeln coli-Stamm C43 (DE3) 12, und die Transformanten auf LB Agar mit 30 ug / mL Kanamycin. </li></ol> 2. Tag 2: Nacht-Kulturen: <ol start="2"><li> Am Abend sind 4 x 3 ml LB-Kulturen mit 30 ug / mL Kanamycin aus der frischen Transformante Kolonien beimpft. Alternativ können die Kulturen aus einem gefrorenen perm geimpft werden. Diese kleinen Kulturen sind auf einer Walze bei 37 ° C über Nacht gewachsen. </li></ol> 3. Tag 3: Growing 6 Liter Cultures: <ol start="3"><li> Am Morgen, verwenden Sie den Nacht-Kulturen auf 150 mL LB mit 30 ug / mL Kanamycin impfen. Die Kultur bei 37 ° C auf einem Schüttler. </li><li> Am Nachmittag, verwenden Sie die kleine Kultur zu 6 x 1L 2xYT Medien mit 30 ug / ml Kanamycin in Fernbach-Kolben zu impfen. (Verwenden Sie 25 ml pro Kultur für eine 1:40-Verdünnung). Wachsen die Kulturen bei 37 ° C bis zum Erreichen einer OD 600 von 0,4-0,6, ca. 1,5 Stunden </li><li> Wenn die Kulturen der richtigen Dichte zu erreichen, induzieren die Proteinexpression durch Zugabe von 0,5 mL 1M IPTG. Legen Sie alle Flaschen zurück in den Shaker geben und sie weiterhin bei 30 ° C über Nacht wachsen. </li></ol> 4. Tag 4: Die Ernte von Zellen und Reinigen des Proteins: <ol start="6"><li> Add-Protease-Inhibitoren, DNAse und Lysozym auf die Pufferlösungen wie folgt: Zu 50 mL der Zelle Resuspensionspuffer, 10 mg DNaseI (0,1 mg / ml Endkonzentration), 1 Complete EDTA-free-Protease-Inhibitor-Tablette und eine Prise von Lysozym . Um 60 ml Membran Resuspensionspuffer, fügen Sie 1 Protease-Inhibitor Tablette. Um weitere 50 ml Membran Resuspensionspuffer, fügen Sie 1 Protease-Inhibitor Tablette. Halten Sie alle drei Lösungen auf Eis. </li><li> Centrifuge die Kulturen 30 min 5.000 Umdrehungen in großen Zentrifuge, um die Zellen zu ernten. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 100 mL Zelle Resuspension Puffer (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 Complete EDTA-free-Protease-Inhibitor Tabletten, 0,1 mg / ml DNase I, Prise Lysozym) </li><li> Pass der Zelle Lösung zweimal durch eine Französisch Druckzelle bei 12.000 psi (762 Überdruck). Sammeln Sie die Zelllysat in eine Flasche auf Eis gehalten kalt. </li><li> Übertragen Sie die Zelllysat auf SS34 Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge, um Zelltrümmer für 30 min entfernt bei 10.000 rpm bei 4 ° C in einem SS-34 Rotor. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand in Ti647.5 Ultrazentrifuge Röhren. Zentrifuge 50 min bei 40.000 rpm bei 4 ° C. Überstand verwerfen. </li><li> Das Pellet, das die Zellmembranen enthält, in ca.. 25 mL der Membran Resuspension Puffer (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% Glycerin, 1 Complete EDTA-free-Protease-Inhibitor-Tablette). </li><li> Übertragen Sie die Membran-Suspension, um eine saubere Zentrifugenröhrchen und Zentrifuge bei 40.000 rpm in einem Ti647.5 Rotor für 50 min bei 4 ° C. </li><li> Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet gewaschen Membran in 25 mL Membran Resuspension Puffer (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% Glycerin, 1 Complete EDTA-free-Protease-Inhibitor-Tablette). </li></ol> 5. TM Protein Solublization: <ol start="15"><li> Um die resuspendierten Membranen (ca. 25 ml), 6 mL 10% DDM (final Detergenskonzentration = 2% DDM) Rock die Mischung bei 4 ° C für 2 Stunden. </li><li> Zentrifugieren Sie die Mischung bei 40.000 rpm für 40 min bei 4 ° C in der Ti647.5 Rotor das lösliche Protein Waschmittel-Komplexe von den unlöslichen Proteinen zu trennen. Speichern Sie die Überstand, der die MexB Protein-Komplexen Reinigungsmittel enthält. </li></ol> 6. IMAC: <ol start="17"><li> Mix der Überstand aus dem High-Speed-Spin mit dem Talon Metall Affinität Perlen äquilibriert in Resuspensionspuffer erhalten. Inkubieren für 1 Stunde auf einer Walze bei 4 ° C. </li><li> Gießen Sie die Gülle in einen Fließbecher Spalte Körper und entsorgen Sie die Durchströmung. </li><li> Die Säule wird mit 20 mL (10 Säulenvolumen) von IMAC Binding und Waschpuffer (50 mM NaP, pH 7, 300 mM NaCl, 5% Glycerin, 0,2% DDM) </li><li> Eluieren des Proteins mit IMAC-Elutionspuffer (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% Glycerin, 250 mM Imidazol, 0,2% DDM). </li><li> Nehmen Sie sich 15 ul Proben der Elutionsfraktionen, Mix mit je 15 ul 2X SDS-Probenpuffer für die Analyse durch Gelelektrophorese. Spin 30sec in einer Mikrozentrifuge. Analysieren Sie die Proben auf einem 10% Polyacrylamid-SDS-Gel, um die Menge und Reinheit des MexB in jeder Fraktion zu schätzen. </li><li> Pool der Fraktionen, die die MexB Protein-Komplexen Waschmittel und konzentrieren sie in einem Spin-Konzentrator bei 4 ° C. Achten Sie darauf, dass das Protein nicht ausfällt bei dieser step. </li></ol> 7. Gelfiltrationssäule: <ol start="23"><li> Pre-Gleichgewicht einer Superose 12 HL 30/10 Säule mit 24 ml Laufpuffer (50 mM NaP, pH 7,0, 300 mM NaCl, 5% Glycerin, 0,2% beta-Octylglucosid), und warten Sie auf eine flache Basislinie. </li><li> Spülen Sie den Akta Systembelastung Schleife mit Laufpuffer. </li><li> Filtern Sie die Protein-Lösung mit einer Spritze Filter vor dem Auftragen auf die Säule. </li><li> Legen Sie bis zu 240 &amp;mgr; l der Proteinlösung auf die Säule, mit einer Proteinkonzentration von bis zu 5 mg / mL. </li><li> Run 1,5 Säulenvolumen (36 ml) Puffer, sammeln 0,25 ml-Fraktionen. 15 ml Elutionsvolumen - Die MexB Protein-Komplexen Waschmittel sollte als ein Peak bei ca. 10 eluieren. </li><li> Take 5 ul Proben der Peak-Fraktionen. Mix jede Probe 1:1 mit 2X SDS-Probenpuffer. Analysieren Sie die Proben auf einem 10% Polyacrylamidgel, um die Menge und Reinheit des MexB in jeder Fraktion Schätzung </li><li> Pool der Fraktionen, die reines MexB. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 1 enthält eine Polyacrylamidgel mit gepoolten Spalte Fraktionen aus der IMAC-Säule und einzelnen Fraktionen aus der Gelfiltrationssäule. Nach der Gelfiltrationssäule das Protein scheint pure durch Coomassie gefärbten Polyacrylamidgel. Abbildung 2 enthält eine Spur von der Gelfiltrationssäule, die die wichtigsten Gipfel des Proteins Reinigungsmittel komplexen eluting aus der Säule. Der durchschnittliche Ertrag von MexB Protein ist etwa 2 mg pro 6 Liter 2xYT Kultur. <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. SDS-PAGE-Gel der Reinigung von MexB PDCs. Lane 1, Molekulargewichtsmarker. 2, IMAC Fraktionen gepoolt. 3-7, Gelfiltrationssäule Fraktionen. <img src="/files/ftp_upload/2134/2134fig2.jpg" alt="Abbildung 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 2"> Abbildung 2. Beispiel Gelfiltration Ergebnisse für MexB Protein Waschmittel-Komplexe (PDC).

<ol><li>Eda, S., Maseda, H., Nakae, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+elegant+means+of+self-protection+in+gram-negative+bacteria+by+recognizing+and+extruding+xenobiotics+from+the+periplasmic+space%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">An elegant means of self-protection in gram-negative bacteria by recognizing and extruding xenobiotics from the periplasmic space.</a> J. Biol. Chem. 278, 2085-2088 (2003).</li>
<li>Li, X. Z., Ma, D., Livermore, D. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+efflux+pump%28s%29+in+intrinsic+resistance+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+active+efflux+as+a+contributing+factor+to+beta-lactam+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Role of efflux pump(s) in intrinsic resistance of Pseudomonas aeruginosa: active efflux as a contributing factor to beta-lactam resistance.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 38, 1742-1752 (1994).</li>
<li>Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+MexA-MexB-OprM+in+antibiotic+efflux+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 39, 1948-1953 (1995).</li>
<li>Masuda, N., Sakagawa, E., Ohya, S., Gotoh, N., Tsujimoto, H., Nishino, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificities+of+MexAB-OprM%2C+MexCD-OprJ%2C+and+MexXY-oprM+efflux+pumps+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Substrate specificities of MexAB-OprM, MexCD-OprJ, and MexXY-oprM efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 44, 3322-3327 (2000).</li>
<li>Okusu, H., Ma, D., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AcrAB+efflux+pump+plays+a+major+role+in+the+antibiotic+resistance+phenotype+of+Escherichia+coli+multiple-antibiotic-resistance+%28Mar%29+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">AcrAB efflux pump plays a major role in the antibiotic resistance phenotype of Escherichia coli multiple-antibiotic-resistance (Mar) mutants.</a> J. Bacteriol. 178, 306-308 (1996).</li>
<li>Srikumar, R., Kon, T., Gotoh, N., Poole, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Pseudomonas+aeruginosa+multidrug+efflux+pumps+MexA-MexB-OprM+and+MexC-MexD-OprJ+in+a+multidrug-sensitive+Escherichia+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Expression of Pseudomonas aeruginosa multidrug efflux pumps MexA-MexB-OprM and MexC-MexD-OprJ in a multidrug-sensitive Escherichia coli strain.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 42, 65-71 (1998).</li>
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<li>Maire, M. le, Champeil, P., Moller, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+membrane+proteins+and+lipids+with+solubilizing+detergents%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Interaction of membrane proteins and lipids with solubilizing detergents.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1508, 86-111 (2000).</li>
<li>Miroux, B., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Over-production+of+proteins+in+Escherichia+coli%3A+mutant+hosts+that+allow+synthesis+of+some+membrane+proteins+and+globular+proteins+at+high+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Over-production of proteins in Escherichia coli: mutant hosts that allow synthesis of some membrane proteins and globular proteins at high levels.</a> J. Mol. Biol. 260, 289-298 (1996).</li>
</ol>

Neben Multidrug-Resistenz, viele lebenswichtige zelluläre Aktivitäten, einschließlich Ionentransport, Zell-Zell-Kommunikation, Vesikeltransport, Wartung der zellulären Struktur und Wirt-Pathogen-Interaktionen beinhalten Proteine, die in die Zellmembran eingebettet sind. Transmembranproteine ​​machen über 30% der bekannten Proteine ​​und sind die Ziele für die Mehrheit der Medikamente heute im Einsatz. Die unsachgemäße Faltung oder Aktivität des Transmembranproteine ​​führen wichtige genetische Krankheiten, darunter Muko...

<table><tbody><tr><td>Puffer für SDS-Proben</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td></td></tr><tr><td>C43(DE3) E. coli-Stamm</td><td>Lucigen</td><td>60345-1</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin-Sulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4378</td><td></td></tr><tr><td>2XYT-Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2466-2</td><td></td></tr><tr><td>LB-Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC61189-5000</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6758</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3226-1</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L7651</td><td></td></tr><tr><td>Complete EDTA-freie Proteaseinhibitor-Tabletten</td><td>Roche Group</td><td>11 873 580 001</td><td></td></tr><tr><td>NaP monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6566</td><td></td></tr><tr><td>NaP dibasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-Dodecyl-&amp;#946;-D-maltopyranosid</td><td>Anatrace</td><td>D310</td><td></td></tr><tr><td>15-ml-Röhrchen</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>See-Saw-Rocker</td><td>Fisher Scientific</td><td>SSL 4</td><td></td></tr><tr><td>Talon-Metallaffinitätsharz</td><td>Clontech Laboratories</td><td>635503</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>10 %-Polyacrylamid-SDS-PAGE-Gele</td><td>Bio-Rad</td><td>161-1454</td><td></td></tr><tr><td>Laufpuffer für Tris/Glycin/SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0732</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidascope prägefärbte Molekulargewichtsmarker</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0324</td><td></td></tr><tr><td>Superose-12-30/10-Säule</td><td>GE Healthcare</td><td>12 10/300 GL</td><td></td></tr><tr><td>Amicon-Zentrifugalkonzentrator</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenfilter</td><td>Fisher Scientific</td><td>SLFG R04 NL</td><td></td></tr><tr><td>Fernbach-Kolben</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-552-39</td><td></td></tr><tr><td>Schüttler für Fernbach-Kolben</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Akta-System</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Großskalenzentrifuge J6 mit JLA-8.1000-Rotor</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1-l-Zentrifugenflaschen</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>969329</td><td></td></tr><tr><td>RC-5-Zentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SS34-Rotor mit festem Winkel und Röhrchen</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall-Bodenmodell-Ultrazentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>T647.5-Rotor und Röhrchen mit Verschlüssen</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>08322</td><td></td></tr><tr><td>French-Druckzelle</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>FA-032</td><td></td></tr></tbody></table>

expression, waschmittel solubilisierung und reinigung von einer membran transporter, der mexb multidrug resistance protein

Expression, Detergent Solubilization, and Purification of a Membrane Transporter, the MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug Resistenz (MDR), die Fähigkeit einer Krebszelle oder Erreger eine Resistenz gegen ein breites Spektrum von strukturell und funktionell unabhängigen Anti-Krebs-Medikamente oder Antibiotika, ist eine aktuelle ernstes Problem im öffentlichen Gesundheitswesen. Das Multidrug-Resistenz ist vor allem auf Energie-abhängigen Efflux-Pumpen. Die Pumpen vertreiben Anti-Krebs-Medikamente oder Antibiotika in den externen Datenträger, senken ihre intrazelluläre Konzentration unterhalb einer toxischen Schwelle. Wir untersuchen Multidrug-Resistenz in Pseudomonas aeruginosa, eine opportunistische bakterielle Erreger, die Infektionen verursachen bei Patienten mit vielen Arten von Verletzungen oder Krankheit, z. B. Verbrennungen oder zystische Fibrose, und auch bei immungeschwächten Krebs, Dialyse und Transplantation Patienten. Die wichtigsten MDR Effluxpumpen in P. aeruginosa sind dreigliedrige Komplexe aus einer inneren Membran Proton-Medikament Antiporters (RND), eine äußere Membran-Kanal (OMF) und eine periplasmatische Linker Protein (MFP) 1-8 zusammen. Die RND-und OMF-Proteine ​​sind Transmembranproteine. Transmembranproteine ​​machen mehr als 30% aller Proteine ​​und sind 65% der aktuellen Wirkstoff-Targets. Die hydrophoben Transmembrandomänen machen die Proteine ​​unlöslich in wässrigen Puffern. Bevor ein Transmembranprotein gereinigt werden kann, ist es notwendig, Puffer-Bedingungen mit einem milden Reinigungsmittel, dass das Protein als ein Protein Waschmittel-Komplex (PDC) 9-11 gelöst werden können zu finden. In diesem Beispiel verwenden wir eine RND Protein, das P. aeruginosa MexB Transmembran-Transporter, um zu zeigen, wie man eine rekombinante Form eines Transmembran-Protein exprimieren, lösen sie mit Hilfe von Detergenzien und dann reinigen das Protein Waschmittel-Komplexen. Diese Methode kann die Expression, Reinigung und Solubilisierung von vielen anderen rekombinant exprimierten Membranproteinen angewandt werden. Das Protein Waschmittel-Komplexe können später für biochemische oder biophysikalische Charakterisierung einschließlich X-ray Kristallstrukturbestimmung oder Vernetzung Studien verwendet werden.

In diesem Protokoll zeigen wir den Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung von rekombinant exprimierten Membranprotein, MexB, wie ein lösliches Protein Waschmittel komplex. MexB ist ein Multidrug-Resistenz-Membran-Transporter aus der opportunistische bakterielle Erreger Pseudomonas aeruginosa.

Expression, Waschmittel Solubilisierung und Reinigung von einer Membran Transporter, der MexB Multidrug Resistance Protein

Multidrug-Resistenz (MDR), die Fähigkeit einer Krebszelle oder eines Pathogens, gegenüber einer Vielzahl strukturell und funktionell nicht verwandter ...

Um das Membranprotein Mex B zu reinigen, wird Mex B zunächst in E. coli mittels rekombinanter DNA-Methoden exprimiert. Anschließend werden die Membranen isoliert und die Membranproteine mit einem milden Detergens solubilisiert. Das solubilisierte Membranprotein wird über eine iMac-Reinigung und anschließend über eine Gelfiltrationschromatographie weitergereinigt.Der Reinigungsgrad des Proteins wird mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt. Obwohl dieses Verfahren Einblicke in multiresistente transmembrane Transporter ermöglichen kann, ist es ebenfalls auf andere Membranproteine anwendbar. Die heute demonstrierten Verfahren werden von einem Doktoranden aus meinem Labor durchgeführt. Für dieses Verfahren wird MexB aus Pseudomonas aeruginosa in den Expressionsvektor PET-30b(+) kloniert, sodass MexB mit einem C-terminalen Hexahistidin-Tag exprimiert wird. Beginnen Sie am Abend damit, vier Kulturen mit je drei Milliliter LB-Medium, das mit Kanamycin versetzt ist, mit frischen Transformanten zu beimpfen oder verwenden Sie eine gefrorene Stammlösung, und kultivieren Sie die Ansätze über Nacht bei 37 Grad Celsius auf einem Rollapparat. Am nächsten Morgen.Verwenden Sie die Übern

expression-detergent-solubilization-purification-membrane-transporter

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Wir stellen ein Protokoll für die in vitro Untersuchung der Effluxpumpen von Pseudomonas aeruginosa. Dieses Protokoll ermöglicht die Erzeugung eines robusten, reversibel und abstimmbare Protonengradienten in der Liposomenmembran und daher sollte anpassungsfähig an jede Membranprotein vom protomotive Kraft erregt werden.

In-vitro-Untersuchung der MexAB Effluxpumpe Von Pseudomonas aeruginosa

Weg zur Rationalisierung der Screening für die Expression des rekombinanten Membranproteine ​​in Escherichia coli, basierend auf Fusions grün fluoreszierendes Protein dargestellt.

Green Fluorescent Protein-basierte Screening Expression von Membranproteinen in<em&gt; Escherichia coli</em

Proteoliposomen werden verwendet, um gereinigte Kanäle und Transporter zu untersuchen, die in einer gut definierten biochemischen Umgebung rekonstituiert werden. Ein experimentelles Verfahren zur Messung des durch diese Proteine vermittelten Ausflusses wird veranschaulicht. Die Schritte zur Präparation von Proteoliposomen, zur Durchführung der Aufzeichnungen und zur Analyse der Daten zur quantitativen Bestimmung der funktionellen Eigenschaften des rekonstituierten Proteins werden beschrieben.

Ein Proteoliposom Basierte Efflux-Assay auf Einzelmoleküleigenschaften von Cl Bestimmen<sup&gt; -</sup&gt; Kanäle und Transporter

Das vorgestellte Protokoll beschreibt die Analyse des Membranprotein-vermittelten Transports auf Einzeltransporterebene unter Verwendung von porenübergreifenden, lösungsmittelfreien Lipiddoppelschichten. Dies wird durch die Herstellung von in großen Mengen hergestellten Nanoporen-Array-Chips in Kombination mit einer hochparallelen Datenerfassung und -analyse erreicht, die die zukünftige Etablierung von Membranprotein-Effektor-Screenings ermöglicht.

Membrantransportprozesse durch eine hochparallele Nanopore Chip-System bei Einzel Protein Resolution Analysierte

Hier präsentieren wir zwei ultraschnelle Protokolle zur Rekonstitution von Membranproteinen in Fusogenic Proteoliposomes und Verschmelzung von solchen Proteoliposomes mit Ziel Lipid Bilayer für Waschmittel-freie Lieferung dieser Membran Proteine in der postfusion Bilayer. Die Kombination dieser Ansätze ermöglicht schnelle und leichtführig Montage von komplexen Mehrkomponenten Membransystemen.

Waschmittel-freie ultraschnelle Rekonstitution von Membranproteinen in Lipid Bilayer mit Fusogenic ergänzende Rechnung Proteoliposomes.

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um auszudrücken, solubilisieren und mehrere eukaryotischen Borat-Transporter mit Homologie zur SLC4 Transporter Familie mit Hefe zu reinigen. Wir beschreiben auch einen chemische Vernetzung Assay zur Beurteilung der gereinigten Homomeric Proteine für Multimeric Montage. Diese Protokolle können für andere anspruchsvolle Membranproteine angepasst werden.

Ausdruck, Solubilisierung und Reinigung der eukaryotischen Borat-Transporter

Wir beschreiben ein Verfahren zur Charakterisierung von protonengetriebenen Membrantransportern in Membranvesikelpräparaten, die durch heterologe Expression in E. coli und Lyse von Zellen mit einer französischen Presse hergestellt werden.

Charakterisierung von Membrantransportern durch heterologen Ausdruck in E. coli und Herstellung von Membranvesikeln

Dieser Artikel stellt ein kleines Plasmamembranisolationsprotokoll zur Charakterisierung des Candida albicans ABC (ATP-bindende Kassette) Proteins Cdr1 vor, das in Saccharomyces cerevisiae überexprimiert wird. Ein proteasespaltender C-terminaler mGFPHis-Doppel-Tag mit einem 16-Rückstands-Linker zwischen Cdr1 und dem Tag wurde entwickelt, um die Reinigung und das Reinigungsmittel-Screening von Cdr1 zu erleichtern.

Plasmamembranpräparation im kleinen Maßstab zur Analyse von Candida albicans Cdr1-mGFPHis

Strukturelle und biochemische Untersuchungen menschlicher Membrantransporter erfordern Milligrammmengen an stabilem, intaktem und homogenem Protein. Hier beschreiben wir skalierbare Methoden zum Screening, zur Expression und zur Reinigung humaner Transporter gelöster Substanzen unter Verwendung von Codon-optimierten Genen.

Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen

Dieses Protokoll beschreibt eine verbesserte SERCA-Aufreinigungsmethode, bei der das Disaccharid Trehalose in den letzten Zentrifugationsschritt einbezogen wird. Dieses Kohlenhydrat stabilisiert Proteine unter rauen Bedingungen. Das gereinigte SERCA war katalytisch aktiv und wies eine hohe Reinheit auf, wodurch es sich für strukturelle und funktionelle Studien eignete.

Aufreinigung des Sarko-endoplasmatischen Retikulums Ca2+-ATPase aus dem Kaninchenmuskel

Lernen Sie die Expression, Solubilisierung und Reinigung des Membrantransporters MexB aus Pseudomonas aeruginosa in E. coli. Diese Methode nutzt IMAC und Gelpermeationschromatographie für die Analyse von Multidrug-Resistance-Mechanismen.

Expression, Waschmittel Solubilisierung und Reinigung von einer Membran Transporter, der MexB Multidrug Resistance Protein

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