Expression, Waschmittel Solubilisierung und Reinigung von einer Membran Transporter, der MexB Multidrug Resistance Protein

Um das Membranprotein Mex B zu reinigen, wird Mex B zunächst mit Hilfe rekombinanter DNA-Methoden in E-coli exprimiert. Dann werden die Membranen isoliert und die Membranproteine mit einem milden Detergens solubilisiert. Das solubilisierte Membranprotein wird durch iMac aufgereinigt und das Protein wird durch Gelfiltrationschromatographie weiter gereinigt.

Der Reinigungsgrad des Proteins wird mit Hilfe der Elektrophorese des SDS-Polyacrylamid-Gels bestimmt. Obwohl dieses Verfahren Einblicke in Transmembrantransporter mit Multiresistenz geben kann, kann es auch auf andere Membranproteine angewendet werden, was zeigt, dass die Verfahren heute von einem Doktoranden aus meinem Labor gebildet werden. Für dieses Verfahren wird Mex B aus Pseudomonas Aosa in den PET 30 B plus-Expressionsvektor subkloniert, so dass Mex B mit einem C-terminalen HEXA-Histamin-Tag exprimiert wird. Beginnen Sie am Abend mit der Inokulation von vier drei Milliliter schweren Dosenmycinkulturen mit frischen Transformanten oder verwenden Sie eine gefrorene Brühe, züchten Sie die Kulturen auf einer Walze bei 37 Grad Celsius über Nacht am Morgen.

Verwenden Sie die Übernachtkulturen, um 150 Milliliter LB mit 30 Mikrogramm pro Milliliter zu impfen. Kann Mycin die Kultur bei 37 Grad Celsius am Nachmittag auf einem Shaker züchten? Verwenden Sie die kleine Kultur, um sechs mal einen Liter zwei XYT-Medien mit 30 Mikrogramm pro Milliliter zu impfen.

Kann Mycin in Farnflaschen zurückhalten? Verwenden Sie 25 Milliliter pro Kultur für eine Verdünnung von eins bis 40. Züchten Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius, bis sie eine optische Dichte erreichen.

600 von 0,4 bis 0,6, ca. 1,5 Stunden. Wenn die Kulturen die richtige Dichte erreicht haben, induzieren Sie die Proteinexpression, indem Sie 0,5 Milliliter eines Molaren hinzufügen. IPTG. Lege alle Kolben wieder in den Shaker und züchte sie über Nacht bei 30 Grad Celsius weiter, bis am nächsten Morgen die Bakterien geerntet sind.

Nehmen Sie die Kulturen aus dem Shaker und kühlen Sie sie. Um die Zellen dann zu ernten, übertragen Sie die Kulturen in Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 5.000 Umdrehungen pro Minute in einer großen Zentrifuge, während die Zellen zentrifugieren. Ergänzen Sie 100 Milliliter Zellsuspensionspuffer mit DNAs, Proteaseinhibitoren und Lysozym.

Ergänzen Sie auch zwei Aliquots von Membran-Reanimationssuspensionspuffer mit Proteaseinhibitoren, wie in dieser Tabelle gezeigt. Halten Sie alle drei Lösungen auf Eis, wenn die Zentrifugation abgeschlossen ist. Resus geben Sie die Zellpellets in 100 Millilitern Zell-Reus-Suspensionspuffer aus.

Extrahieren Sie als Nächstes die Zellen. Die Zellensuspension wird in die französische Druckzelle geladen und die Zelle auf die französische Presse gelegt. Der Druck wird ausgeübt, bis er 12.000 Pfund pro Quadratzoll erreicht.

Das Ventil wird ein sehr kleines Stück geöffnet, so dass die kaputten Zellen herausrieseln. Es ist wichtig, das Ventil nicht zu stark zu öffnen und die Zellen herausspritzen zu lassen, da sie mit zu wenig Druck freigesetzt und nicht effizient gebrochen werden. Sammeln Sie das Zelllysat in einer Flasche, die auf Eis kalt gehalten wird.

Führen Sie die Zelllösung erneut mit 12.000 Pfund pro Quadratzoll durch eine französische Druckzelle. Übertragen Sie das Zelllysat auf SS 34-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie, um Zellreste bei 10.000 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten bei vier Grad Celsius in einem SS 34-Rotor zu entfernen. Als nächstes folgt das geklärte Lysat.

Wird zur Vorbereitung der Membranfraktion verwendet. Übertragen Sie das Supinat vorsichtig in ti. 6 4, 7 0,5 ultra Zentrifugenröhrchen, zentrifugieren in einem TI 6 4 7 0,5 Rotor bei 40.000 Umdrehungen pro Minute für 50 Minuten bei vier Grad Celsius.

Verwerfe das Supinat. Verwenden Sie eine Pipette, um das Pellet, das die Zellmembranen in etwa 25 Millilitern Membran-Resus-Suspensionspuffer enthält, vorsichtig zu resuspendieren, übertragen Sie die Membransuspension in ein sauberes Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie in einem TI I 6 4 7 0,5-Rotor von 40.000 Umdrehungen pro Minute für 50 Minuten bei vier Grad Celsius und resuspendieren Sie die gewaschene Membranpalette in 25 Millilitern Membran-Resus-Suspensionspuffer. Als nächstes lösen Sie die Membranproteine bei etwa 25 Millilitern an die resuspendierten Membranen.

Fügen Sie sechs Milliliter 10 % DDM hinzu, so dass die endgültige Waschmittelkonzentration 2 % DDM beträgt, und rocken Sie das Gemisch zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius nach der zweistündigen Inkubation in Gegenwart von DDM-Zentrifuge, das Gemisch bei 40.000 Umdrehungen pro Minute für 40 Minuten bei vier Grad Celsius im Rotor TI I 6 4 7 0,5. Um das lösliche Protein zu trennen, werden Detergens-Komplexe von den unlöslichen Proteinen getrennt. Bewahren Sie die Rückenlage auf, die die Mex B-Protein-Detergenz-Komplexe enthält, um sie in der Reinigung zu verwenden: Mischen Sie die Rückenlage-Naft, die die Mex B-Protein-Detergenz-Komplexe enthält, mit zwei Millilitern der Lon-Metall-Affinitätskügelchen, die in Resus-Suspensionspuffer äquilibriert wurden, inkubieren Sie eine Stunde lang auf einer Walze bei vier Grad Celsius, nachdem Sie die Proteine an das Harz gebunden haben.

Gießen Sie die Gülle in einen Körper einer Schwerkraft-Durchflusssäule und entsorgen Sie den Durchfluss. Waschen Sie die Säule mit 20 Millilitern oder 10 Säulenvolumen iMac Bindung und Waschpuffer, wenn die Reinigung der Säule abgeschlossen ist. Eluieren Sie die gebundenen Proteine mit 10 Millilitern iMac-Elutionspuffer.

Entnehmen Sie 10 Mikroliter Proben jeder Elutionsfraktion. Mit 10 Mikrolitern zweifacher SDS-Probe mischen, puffern und auf einem 10%igen Polyacrylamid analysieren. SDS-Gel.

Schätzen Sie die Menge und Reinheit von Mex B in jeder Fraktion. Ziehen Sie die Fraktionen, die die Mex B-Protein-Detergens-Komplexe enthalten, und konzentrieren Sie sie in einem Schleuderkonzentrator bei vier Grad Celsius. Achten Sie darauf, dass das Protein in diesem Schritt nicht ausfällt.

Verwenden Sie mehrere kurze Drehungen und achten Sie auf Niederschlag. Nach jedem Schleudern fahren Sie dann mit der Reinigung der gepoolten Fraktionen mit einer Gelfiltrationssäule fort. Äquilibrieren Sie eine Super Rose 12 HL 30 über 10 Spalten mit 24 Millilitern Laufpuffer und warten Sie auf eine flache Basislinie.

Spülen Sie anschließend die Ladeschleife des Actor-Systems mit dem laufenden Puffer. Bevor Sie das Protein auf die Säule auftragen, filtrieren Sie die Proteinlösung mit einem Spritzenfilter. Laden Sie dann bis zu 240 Mikroliter der Proteinlösung mit einem Protein von bis zu fünf Milligramm pro Milliliter auf die Säule.

Lassen Sie 1,5 Spaltenvolumen Puffer laufen und sammeln Sie 0,25 Milliliterfraktionen. Die XB-Protein-Detergens-Komplexe eluieren als Peak bei etwa 10 bis 15 Millilitern Elutionsvolumen. Entnehmen Sie fünf Mikroliter Proben der Peakfraktionen.

Mischen Sie jede Probe eins zu eins mit dem zweifachen SDS-Probenpuffer. Analysieren Sie die Proben auf einem 10%igen Polyacrylamid-Gel, um die Menge und Reinheit von MeMex B in jeder Fraktion zu schätzen, und ziehen Sie die Fraktionen, die reines ME B enthalten. Dieses Polyacrylamid-Gel wurde mit gezogenen Fraktionen aus der iMac-Säule und einzelnen Fraktionen aus der Gelfiltrationssäule beladen. Nach der Gelfiltrationssäule erscheint das Protein rein auf dem Kumasi-gefärbten Polyacrylamid-Gel.

Eine Spur aus der Gelfiltrationssäule zeigt den Hauptpeak des Proteindetergenzkomplexes, der aus der Säule eluiert. Die durchschnittliche Ausbeute an mxb-Protein beträgt etwa zwei Milligramm pro sechs Liter von zwei XYT-Kulturen. Einmal gemeistert, kann dieses Verfahren in acht Stunden durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Membranprotein exprimiert, auflöst und aufreinigt.