Expression, Waschmittel Solubilisierung und Reinigung von einer Membran Transporter, der MexB Multidrug Resistance Protein

Um das Membranprotein Mex B zu reinigen, wird Mex B zunächst in E. coli mittels rekombinanter DNA-Methoden exprimiert. Anschließend werden die Membranen isoliert und die Membranproteine mit einem milden Detergens solubilisiert. Das solubilisierte Membranprotein wird über eine iMac-Reinigung und anschließend über eine Gelfiltrationschromatographie weitergereinigt.

Der Reinigungsgrad des Proteins wird mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt. Obwohl dieses Verfahren Einblicke in multiresistente transmembrane Transporter ermöglichen kann, ist es ebenfalls auf andere Membranproteine anwendbar. Die heute demonstrierten Verfahren werden von einem Doktoranden aus meinem Labor durchgeführt. Für dieses Verfahren wird MexB aus Pseudomonas aeruginosa in den Expressionsvektor PET-30b(+) kloniert, sodass MexB mit einem C-terminalen Hexahistidin-Tag exprimiert wird. Beginnen Sie am Abend damit, vier Kulturen mit je drei Milliliter LB-Medium, das mit Kanamycin versetzt ist, mit frischen Transformanten zu beimpfen oder verwenden Sie eine gefrorene Stammlösung, und kultivieren Sie die Ansätze über Nacht bei 37 Grad Celsius auf einem Rollapparat. Am nächsten Morgen.

Verwenden Sie die Übernachtkulturen, um 150 Milliliter LB, das 30 Mikrogramm pro Milliliter enthält, zu beimpfen. Kann Mycin die Kultur nachmittags bei 37 Grad Celsius im Schüttelinkubator kultivieren? Verwenden Sie die kleine Kultur, um sechsmal je ein Liter zwei XYT-Medien, die 30 Mikrogramm pro Milliliter enthalten, zu beimpfen.

Kann Mycin in Fernbach-Flaschen verwendet werden? Verwenden Sie 25 Milliliter pro Kultur für eine 1:40-Verdünnung. Kultivieren Sie die Kulturen bei 37 Grad Celsius, bis sie eine optische Dichte erreichen.

600 von 0,4 bis 0,6, etwa 1,5 Stunden. Wenn die Kulturen die richtige Dichte erreicht haben, induzieren Sie die Proteingexpression durch Zugabe von 0,5 Milliliter einmolarer IPTG. Stellen Sie alle Kolben zurück in den Schüttler und kultivieren Sie sie über Nacht bei 30 Grad Celsius, bis die Bakterien am folgenden Morgen geerntet werden.

Holen Sie die Kulturen aus dem Schüttler und kühlen Sie sie ab. Überführen Sie anschließend die Kulturen zur Gewinnung der Zellen in Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius mit 5.000 Umdrehungen pro Minute in einer Großzentrifuge, während die Zellen zentrifugiert werden. Geben Sie 100 Milliliter Zellresuspendierpuffer mit DNAse-Protease-Inhibitoren und Lysozym hinzu.

Versetzen Sie außerdem zwei Aliquote des Membran-Resus-Suspensionspuffers mit Proteaseinhibitoren, wie in dieser Tabelle dargestellt. Bewahren Sie alle drei Lösungen nach der Zentrifugation auf Eis auf. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 100 Milliliter Zell-Resus-Suspensionspuffer.

Als Nächstes werden die Zellen extrahiert. Die Zellsuspension wird in die Druckkammer der French-Druckzelle gegeben, und die Kammer wird in die French-Presse eingesetzt. Der Druck wird erhöht, bis er 12.000 Pfund pro Quadratzoll erreicht.

Das Ventil wird nur sehr wenig geöffnet, sodass die zerbrochenen Zellen langsam auslaufen. Es ist wichtig, das Ventil nicht zu weit zu öffnen und die Zellen herausschießen zu lassen, da sie dann mit zu geringem Druck freigesetzt werden und nicht effizient zerlegt werden. Sammeln Sie das Zelllysat in einer Flasche, die auf Eis gekühlt gehalten wird.

Führen Sie die Zellsuspension erneut durch eine French-Druckzelle bei 12.000 Pfund pro Quadratzoll. Überführen Sie das Zelllysat in SS-34-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie zur Entfernung von Zelltrümmern bei 10.000 Umdrehungen pro Minute für 30 Minuten bei vier Grad Celsius im SS-34-Rotor. Als Nächstes folgt das geklärte Lysat.

Wird zur Herstellung der Membranfraktion verwendet. Überführen Sie das Überstand sorgfältig in TI-6-47-0,5-Ultrazentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie im TI-6-47-0,5-Rotor bei 40.000 Umdrehungen pro Minute für 50 Minuten bei vier Grad Celsius.

Entfernen Sie den Überstand. Suspendieren Sie das Pellet, das die Zellmembranen enthält, vorsichtig mit einer Pipette in etwa 25 Milliliter Membran-Resus-Suspensionspuffer, überführen Sie die Membransuspension in ein sauberes Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie erneut mit 40.000 Umdrehungen pro Minute für 50 Minuten bei vier Grad Celsius in einem TI-647.05-Rotor. Suspendieren Sie die gewaschene Membranfraktion erneut in 25 Milliliter Membran-Resus-Suspensionspuffer. Anschließend lösen Sie die Membranproteine in den resuspendierten Membranen unter Verwendung von etwa 25 Milliliter auf.

Geben Sie sechs Milliliter 10 % DDM hinzu, sodass die endgültige Tensidkonzentration 2 % DDM beträgt. Schwenken Sie die Mischung zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius. Nach der zweistündigen Inkubation in Gegenwart von DDM zentrifugieren Sie die Mischung bei 40.000 Umdrehungen pro Minute für 40 Minuten bei vier Grad Celsius im TI I 6 4 7 0,5-Rotor, um lösliche Proteintensid-Komplexe von unlöslichen Proteinen zu trennen. Heben Sie das Überstandsupernatant, das die MexB-Proteintensid-Komplexe enthält, für die Reinigung auf. Mischen Sie das Überstandsupernatant, das die MexB-Proteintensid-Komplexe enthält, mit zwei Millilitern an lon-Metallaffinitätskügelchen, die in Resus-Suspensionspuffer equilibriert wurden, und inkubieren Sie eine Stunde lang auf einem Rollapparat bei vier Grad Celsius, nachdem die Proteine an das Harz gebunden wurden.

Geben Sie die Suspension in einen Säulenkörper für den Schwerkraftdurchlauf und verwerfen Sie den Durchlauf. Waschen Sie die Säule mit 20 Milliliter oder 10 Säulenvolumina iMac-Bindungs- und Waschpuffer, sobald das Waschen der Säule abgeschlossen ist. Eluieren Sie die gebundenen Proteine mit 10 Milliliter iMac-Elutionspuffer.

Entnehmen Sie 10 µL-Proben jeder Elutionsfraktion. Mischen Sie sie mit 10 µL zweifach konzentrierter SDS-Probelösungspuffer und analysieren Sie die Proben auf einem 10 %igen Polyacrylamid-SDS-Gel.

Schätzen Sie die Menge und Reinheit von Mex B in jeder Fraktion. Sammeln Sie die Fraktionen, die die Detergenz-Komplexe des Mex-B-Proteins enthalten, und konzentrieren Sie sie mithilfe eines Spin-Konzentrators bei vier Grad Celsius. Achten Sie darauf, dass das Protein in diesem Schritt nicht ausfällt.

Verwenden Sie mehrere kurze Zentrifugationsschritte und achten Sie auf Ausfällung. Nach jeder Zentrifugation fahren Sie mit der Reinigung der gepoolten Fraktionen mittels einer Gelfiltrationssäule fort. Äquilibrieren Sie eine Super Rose 12 HL 30/10-Säule vorab mit 24 Milliliter Laufpuffer und warten Sie, bis eine flache Basislinie erreicht ist.

Als Nächstes spülen Sie die Ladeschleife des Aktorsystems mit Laufpuffer. Bevor Sie das Protein auf die Säule auftragen, filtrieren Sie die Proteiniösung mit einem Spritzenvorsatzfilter. Anschließend laden Sie bis zu 240 Mikroliter der Proteiniösung auf die Säule, wobei die Proteinkonzentration bis zu fünf Milligramm pro Milliliter betragen darf.

Führen Sie 1,5 Säulenvolumina Puffer durch und sammeln Sie Fraktionen zu je 0,25 Milliliter. Die XB-Protein-Detergens-Komplexe eluieren als Peak bei etwa 10 bis 15 Milliliter Elutionsvolumen. Entnehmen Sie 5-Mikroliter-Proben der Peak-Fraktionen.

Die Proben jeweils im Verhältnis 1:1 mit zweifachem SDS-Probenpuffer mischen. Die Proben auf einem 10 %igen Polyacrylamidgel analysieren, um die Menge und Reinheit von me Mex B in jeder Fraktion abzuschätzen, die Fraktionen mit reinem ME B sammeln. Auf diesem Polyacrylamidgel wurden die gesammelten Fraktionen aus der iMac-Säule sowie Einzelfraktionen aus der Gelfiltrationssäule aufgetragen. Nach der Gelfiltrationssäule erscheint das Protein auf dem kumasisch-gefärbten Polyacrylamidgel als rein.

Ein Chromatogramm der Gelfiltrationssäule zeigt den Hauptpeak des Protein-Detergens-Komplexes, der aus der Säule eluiert wird. Die durchschnittliche Ausbeute des Mxb-Proteins beträgt ungefähr zwei Milligramm pro sechs Liter zweifacher XYT-Kultur. Wenn man das Verfahren einmal beherrscht, kann es bei korrekter Durchführung innerhalb von acht Stunden durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Membranprotein exprimiert, solubilisiert und reinigt.