Visualisierung der DNA-Replikation in den Wirbeltier-Modellsystem DT40 mit der DNA Fiber-Technik

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die DNA-Replikation auf der Ebene einzelner Moleküle sichtbar zu machen. Beginnen Sie mit dem Einbau von halogenierten Nukleotidanaloga in neu synthetisierte DNA. In lebenden Zellen werden die Zellen mit markierter DNA unter dem Mikroskop aufgespürt.

Der Objektträger legt dann die Zellen und streckt die DNA auf den Objektträger. Die anschließende Immunfärbung von DNA-Fasern und die Analyse der Fluoreszenzmikroskopiebilder können die Dynamik der globalen Replikationsgabel aufklären, um eine quantitative Analyse von Parametern zu ermöglichen, die das gesamte Replikationsprogramm beeinflussen. In den letzten Jahren wurden verschiedene Versionen der DNA-Faser-Fluor-Techniken entwickelt, um die Bewegung der einzelnen Replikationsgabel innerhalb lebender Zellen sichtbar zu machen.

Dieses In-vivo-Experiment an DT 40-Zellen, das Sie gerade miterleben werden, kann innerhalb eines Tages durchgeführt werden und erfordert nur allgemeine Laborausrüstung und ein Fluoreszenzmikroskop, das das Verfahren demonstriert, von Dr. Rebecca Schwab, einer Postdoktorandin für mein Labor. Um DT 40-Zellen in vivo zu markieren, beginnen Sie mit einer exponentiell wachsenden Kultur. Geben Sie IDU-Markierung zu einer Endkonzentration von 25 Mikromolaren und mischen Sie die Zellsuspension.

Inkubieren Sie die Zellen 20 Minuten lang bei 38 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid. Fügen Sie als Nächstes das CLDU-Etikett bis zu einer Endkonzentration von 250 Mikromolaren hinzu. Mischen und inkubieren Sie die Zellsuspension.

Waschen Sie nun die DT 40 Zellen mit eiskaltem PBS reus. Suspendieren Sie die Zellpellets in kaltem PBS und halten Sie die markierten Zellen auf Eis. Geben Sie zwei Mikroliter der Zellsuspension auf ein Ende des Objektträgers und trocknen Sie es an der Luft, bis das Volumen des Tropfens stark reduziert, aber nicht vollständig trocken ist.

Geben Sie nun sieben Mikroliter Faserlyselösung auf die Zellsuspension und mischen Sie die Lösungen vorsichtig unter Rühren mit einer Pipettenspitze, inkubieren Sie sie zwei Minuten lang. Neigen Sie als Nächstes die Objektträger um 15 Grad, damit sich die Fasern entlang der Folie ausbreiten können. Sobald die Faserlösung den Boden des Objektträgers erreicht hat, lege sie horizontal an die Luft.

An dieser Stelle sollte eine dünne, undurchsichtige Linie entlang der Folie sichtbar sein. Markieren Sie den Anfang der gedehnten Fasern mit einem Bleistift. Tauchen Sie die Objektträger zunächst 10 Minuten lang in drei bis eins Methanol in Essigsäure.

Waschen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser und tauchen Sie sie dann 80 Minuten lang in 2,5 molare Salzsäure. Wasche die Objektträger dreimal fünf Minuten lang in PBS. Sammeln Sie überschüssiges PBS auf einem Papiertuch.

Richten Sie dann die Folien horizontal aus. Pipettieren Sie nun 5%BSA in PBS auf jeden Objektträger und legen Sie ein Deckglas für 20 Minuten inkubieren. Schieben Sie den Abdeckschieber vorsichtig auf dem Glasschieber nach unten.

Entfernen Sie das überschüssige BSA mit einem Papiertuch. Pipettieren Sie dann 50 Mikroliter der Anti-BRDU-Primärantikörperlösung. Auf jede Folie.

Decken Sie ein Wild mit einem Deckglas ab und inkubieren Sie es zwei Stunden lang in einer befeuchteten Kammer. Nachdem Sie die Deckgläser entfernt haben, waschen Sie die Objektträger dreimal fünf Minuten lang in PBS. Tragen Sie 50 Mikroliter der Sekundärantikörperlösung auf, positionieren Sie die Abdeckfolien und schützen Sie die Objektträger ebenfalls vor Licht.

Dann eine Stunde lang inkubieren. Entfernen Sie die Deckgläser und waschen Sie die Objektträger dreimal fünf Minuten lang in PBS. Geben Sie abschließend einen Tropfen Vector Shield Montagemedium auf jede Folie.

Drücken Sie vorsichtig auf einen Deckslip und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit um ihn herum. Versiegeln Sie die Deckgläser mit einem Papiertuch mit transparentem Nagellack und trocknen Sie sie an der Luft. Lagern Sie die Objektträger bei minus 20 Grad Celsius.

Geben Sie einen Tropfen Immersionsöl auf einen Objektträger in der Nähe der Bleistiftmarkierung und beginnen Sie, die Fasern zu lokalisieren. Entfernen Sie sich vom Hauptbündel, um Bereiche zu finden, in denen die Fasern klar voneinander getrennt sind. In einem typischen Experiment wählen Sie Bilder nur mit einem Farbkanal aus, um Verzerrungen zu vermeiden.

Machen Sie dann ca. 10 Fotos von jeder Probe. Bewegen Sie sich entlang des Objektträgers, um die verschiedenen Bilder aufzunehmen, da ein Bereich eines Objektträgers möglicherweise keine repräsentativen Faserlängen oder Replikationsstrukturen bietet. Importieren Sie Bilder in ein Bildanalyseprogramm.

Messen Sie die Längen der 100 Faserbahnen und/oder zählen Sie 150 bis 200 verschiedene Replikationsstrukturen. Die Double-Labeling-Fiber-Technik ermöglicht es, zwischen verschiedenen Replikationsstrukturen zu unterscheiden. Neu replizierte DNA kann als Linien von Antikörper-markierten Nukleotidanaloga visualisiert werden.

Hier wird eine sich fortsetzende Dehnungsgabel als benachbarte rote und grüne Signale dargestellt. Neue Initiationsereignisse können unterteilt werden in Ursprünge, die ausgelöst wurden, während die Zellen mit der ersten Markierung inkubiert wurden, und Ursprünge, die während der Inkubation mit der zweiten Markierung ausgelöst wurden. Ersteres besteht aus benachbarten grünen, rot-grünen Signalen und letzteres aus einer grünen Linie. Nur.

Beendigungsereignisse werden als angrenzend rot grün angezeigt. Rote Signale eingestreut. Ursprünge bestehen aus aufeinanderfolgenden Ursprüngen und Beendigungssignalen.

Je nach Versuchsdesign können blockierte oder kollabierte Gabeln entweder als reines rotes Signal oder als rote Linie definiert werden, gefolgt von einem kurzen grünen Trakt. In diesem Experiment haben die Wildtyp-Zellen DT 40 eine durchschnittliche Gabelgeschwindigkeit von 0,4 Mikrometern pro Minute. Mit 63 % laufenden Gabeln, 10 % Ursprüngen, 16 % blockierten Gabeln, 8 % Anschlüssen und 3 % eingestreuten Fasern.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Dynamik der Replikationsgabel in DT 40-Zellen visualisieren und analysieren können. Damit erhalten Sie ein unverzichtbares Werkzeug zur Untersuchung von Defekten in der DNA-Replikation.