Visualisierung der DNA-Replikation in den Wirbeltier-Modellsystem DT40 mit der DNA Fiber-Technik

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die DNA-Replikation auf Ebene einzelner Moleküle sichtbar zu machen. Beginnen Sie damit, halogenierte Nukleotid-Analoga in die neu synthetisierte DNA einzubauen. Markieren Sie in lebenden Zellen die Zellen mit markierter DNA und platzieren Sie sie auf einem Mikroskop.

Die Zellen werden dann auf dem Objektträger aufgetragen und das DNA wird auf dem Mikroskopobjektträger ausgestreckt. Anschließende immunhistochemische Färbung der DNA-Fasern und Analyse der fluoreszenzmikroskopischen Bilder können die globalen Replikationsgabel-Dynamiken sichtbar machen, um eine quantitative Analyse von Parametern zu ermöglichen, die das gesamte Replikationsprogramm beeinflussen. In den letzten Jahren wurden verschiedene Versionen der DNA-Faser-Fluor-Techniken entwickelt, um die Bewegung einzelner Replikationsgabeln in lebenden Zellen sichtbar zu machen.

Dieses In-vivo-Experiment an DT 40-Zellen, das Sie gleich beobachten werden, kann innerhalb eines Tages durchgeführt werden und erfordert nur allgemeine Laborausrüstung sowie ein Fluoreszenzmikroskop. Die Durchführung der Methode wird Dr. Rebecca Schwab, eine Postdoktorandin in meinem Labor, demonstrieren. Um DT 40-Zellen in vivo zu markieren, beginnen Sie mit einer exponentiell wachsenden Kultur. Geben Sie die IDU-Markierung zu einer Endkonzentration von 25 µM hinzu und mischen Sie die Zellsuspension.

Die Zellen 20 Minuten bei 38 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid gut inkubieren. Anschließend die CLDU-Markierung zu einer Endkonzentration von 250 Mikromolar hinzufügen. Mischen und die Zellsuspension inkubieren.

Waschen Sie die DT 40-Zellen nun mit eiskalter PBS erneut. Suspendieren Sie die Zellpellets in kalter PBS und bewahren Sie die markierten Zellen auf Eis auf. Geben Sie zwei Mikroliter der Zellsuspension auf ein Ende der Objektträger auf und lassen Sie sie an der Luft trocknen, bis das Volumen des Tropfens stark reduziert, aber nicht vollständig trocken ist.

Fügen Sie nun sieben Mikroliter Faserlyselösung auf die Zellsuspension hinzu und mischen Sie die Lösungen vorsichtig durch Verrühren mit einer Pipettenspitze; anschließend zwei Minuten inkubieren. Danach kippen Sie die Objektträger um 15 Grad, damit sich die Fasern entlang des Objektträgers ausbreiten können. Sobald die Faserlösung das untere Ende des Objektträgers erreicht hat, legen Sie diesen horizontal zur Lufttrocknung ab.

Zu diesem Zeitpunkt sollte ein dünner, undurchsichtiger Strich entlang des Objektträgers sichtbar sein. Markieren Sie den Anfang der gedehnten Fasern mit einem Bleistift. Tauchen Sie die Objektträger zunächst für 10 Minuten in ein Gemisch aus Methanol und Essigsäure im Verhältnis 3:1.

Spülen Sie die Objektträger mit destilliertem Wasser, anschließend tauchen Sie sie 80 Minuten lang in 2,5 molarer Salzsäure ein. Waschen Sie die Objektträger dreimal fünf Minuten lang in PBS ab. Entfernen Sie überschüssiges PBS mit einem Papiertuch.

Dann orientieren Sie die Objektträger horizontal. Geben Sie nun 5 % BSA in PBS auf jeden Objektträger und setzen Sie ein Deckglas auf, das 20 Minuten inkubiert wird. Bewegen Sie das Deckglas vorsichtig entlang des Objektträgers nach unten.

Entfernen Sie das überschüssige BSA mit einem Papiertuch. Geben Sie dann 50 Mikroliter der primären Anti-BRDU-Antikörperlösung auf jede Probe.

Bedecken Sie eine Probe mit einem Deckglas und inkubieren Sie sie zwei Stunden lang in einer befeuchteten Kammer. Nach dem Entfernen der Deckgläser waschen Sie die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS. Geben Sie 50 Mikroliter der sekundären Antikörperlösung auf die Probe, setzen Sie die Deckgläser auf und schützen Sie die Objektträger zudem vor Licht.

Anschließend eine Stunde inkubieren. Die Deckgläser entfernen und die Objektträger dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS waschen. Zum Schluss einen Tropfen Vector Shield-Mounting-Medium auf jeden Objektträger geben.

Drücken Sie vorsichtig auf ein Deckglas und entfernen Sie die überschüssige Flüssigkeit darum herum. Versiegeln Sie die Deckgläser mit durchsichtigem Nagellack und lassen Sie sie an der Luft trocknen. Lagern Sie die Objektträger bei minus 20 Grad Celsius.

Bringen Sie einen Tropfen Immersionsöl nahe der Bleistiftmarkierung auf einen Objektträger auf und beginnen Sie, die Fasern zu lokalisieren. Bewegen Sie sich weg vom Hauptbündel, um Bereiche zu finden, in denen die Fasern deutlich voneinander getrennt sind. Wählen Sie in einem typischen Experiment Bilder ausschließlich unter Verwendung eines Farbkanals aus, um eine Verzerrung zu vermeiden.

Nehmen Sie anschließend etwa 10 Aufnahmen von jeder Probe auf. Bewegen Sie sich entlang des Objektträgers, um die verschiedenen Bilder aufzunehmen, da ein einzelner Bereich eines Objektträgers möglicherweise keine repräsentativen Faserlängen oder Replikationsstrukturen liefert. Importieren Sie die Bilder in ein Bildanalyseprogramm.

Messen Sie die Längen der 100 Fasertrakte und/oder zählen Sie 150 bis 200 verschiedene Replikationsstrukturen. Die doppelt markierte Fasertechnik ermöglicht es, verschiedene Replikationsstrukturen zu unterscheiden. Neu replizierte DNA kann als Linien aus Antikörper-markierten Nukleotid-Analoga sichtbar gemacht werden.

Hier wird eine fortlaufende elongierende Gabel als benachbarte rote und grüne Signale dargestellt. Neue Initiierungsereignisse können in zwei Gruppen unterteilt werden: Ursprünge, die aktiviert wurden, während die Zellen mit der ersten Markierung inkubiert wurden, und Ursprünge, die während der Inkubation mit der zweiten Markierung aktiviert wurden. Erstere bestehen aus benachbarten grünen, roten und grünen Signalen, letztere hingegen aus einer ausschließlich grünen Linie.

Terminationsereignisse zeigen sich als benachbarte rot-grün. Rot markierte Signale sind verstreut. Replikationsursprünge bestehen aus aufeinanderfolgenden Ursprüngen und Terminierungssignalen.

Je nach experimentellem Design können blockierte oder kollabierte Gabeln entweder als reines rotes Signal oder als rote Linie, gefolgt von einem kurzen grünen Abschnitt, definiert werden. In diesem Experiment weisen die wildtypischen DT 40-Zellen eine durchschnittliche Gabelgeschwindigkeit von 0,4 µm pro Minute auf. Mit 63 % fortlaufenden Gabeln, 10 % Ursprüngen, 16 % blockierten Gabeln, 8 % Abschlüssen und 3 % verstreuten Fasern.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Dynamik der Replikationsgabel in DT 40-Zellen visualisieren und analysieren kann. Dies wird Ihnen ein wesentliches Werkzeug zur Untersuchung von Defekten in der DNA-Replikation liefern.