Experimentelle Ansätze zur Untersuchung Mitochondriale Lokalisation und Funktion eines Kernzellzyklus-Kinase, Cdk1

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens ist es, die submitochondriale Lokalisation einer normalerweise nukleären Zellzykluskinase zu bestimmen und dann zu analysieren, wie sich ihre mitochondriale Lokalisation auf das Fortschreiten des Zellzyklus auswirkt. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im Bereich der mitochondrialen Forschung zu beantworten, z. B. wie der Zellkern während des Zellzyklus mit den Mitochondrien kommuniziert. Durch die Markierung von Proteinen mit einer mitochondrienführenden Sequenz können wir die spezifischen Überexpressionen in Proteinen in den Mitochondrien nutzen, um ihre mitochondrienspezifischen Funktionen zu untersuchen.

Obwohl diese Methode Einblicke in das Targeting bestimmter Proteine in Mitochondrien geben kann, kann sie auch auf die anderen Organellen wie den Zellkern, ER, Golgi und ein Lysosom angewendet werden. Nach dem Kultivieren, Homogenisieren und Pelletieren der Zellen gemäß dem Textprotokoll wird der Überstand in ein neues Röhrchen überführt. Und zentrifugieren Sie die Probe bei 7.000 g und 4 Grad Celsius für 10 Minuten.

Verwenden Sie dann 200 Mikroliter eiskalten IBC-Puffer, um das Pellet zu resuspendieren, und teilen Sie das Homogenat in zwei Aliquote. Die Proben werden erneut bei 7.000 g und 4 Grad Celsius für 10 Minuten zentrifugiert. Und wiederholen Sie den Waschvorgang.

Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie 30 Mikroliter Zelllysepuffer zu einem der Pellets hinzu und lagern Sie das Lysat bei 80 Grad Celsius für das Immunblotting. Um die Natriumcarbonat-Extraktion mit dem zweiten Pellet durchzuführen, um lösliche und membrangebundene Proteine zu trennen, fügen Sie 250 Mikroliter 0,1 molares Natriumcarbonat pH 11,0 hinzu und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis. Bei 100.000 g 20 Minuten zentrifugieren.

Sammeln Sie dann den Überstand und fügen Sie eine gleiche Menge frisch hergestellter 20%iger Trichloressigsäure hinzu, um die Proteine auszufällen. 30 Minuten auf Eis halten. In der Zwischenzeit werden dem Pellet 30 Mikroliter Zelllysepuffer zugesetzt und gemäß dem Textprotokoll beschallt, bevor es bei 80 Grad Celsius für das Immunblotting gelagert wird.

Nach der 30-minütigen TCA-Inkubation zentrifugieren Sie die Reaktion bei 15.000 g für 10 Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und verwenden Sie dann 80 Mikroliter Zelllysepuffer, um das Pellet wieder zu suspendieren. Nach der Isolierung der mitochondrialen Fraktionen aus den Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben, werden die mitochondrialen Fraktionen in 10 gleiche Teile aufgeteilt.

Pelletieren Sie die Proben bei 7.000 g und 4 Grad Celsius für 10 Minuten. Verwenden Sie 30 Mikroliter eines Konzentrationsbereichs von hypotonen Saccharosepuffern mit oder ohne Trypsin, um jedes Pellet aufzulösen. Und 30 Minuten auf Eis inkubieren.

Geben Sie 3 Mikroliter 10 millimolare PMSF in die trypsinhaltigen Durchstechflaschen, um die Trypsinverdauung zu stoppen. Und 10 Minuten auf Eis inkubieren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 g und 4 Grad Celsius für 10 Minuten.

Und überträufeln Sie den Überstand in ein neues Rohr. Um das Pellet zu lysieren, fügen Sie 30 Mikroliter Zelllysepuffer hinzu. Die Proben wie im Textprotokoll beschrieben beschallen und bei 80 Grad Celsius lagern.

Um mitochondrien-gerichtete GFP/RFP-markierte cyclinB-1 Cdk-1-Vektoren zu konstruieren, klonieren Sie die Mitochondrien-Targeting-Sequenz aus dem Vorläufer der humanen Cytochrom-c-Oxidase-Untereinheit 8A und rahmen Sie mit dem n-Terminus von GFP oder RFP an den Nhe1- und bAmH1-Stellen von pEGFP-N1 oder pERFP-N1 unter Verwendung von Standard-molekularen Klonierungstechniken ein. Amplifizieren Sie unter Verwendung der im Textprotokoll beschriebenen Primer die Gene Cdk1 und CyclinB1 nach Standardtechniken. Verwenden Sie dann BamH1, um die PCR-Produkte zu verdauen.

Führen Sie die Reaktionen auf einem 1%igen Agarose-Gel durch, bevor Sie eine Rasierklinge verwenden, um die DNA-Fragmente der richtigen Größe auszuschneiden. Verwenden Sie dann ein Gel-Extraktionskit, um die DNA aufzureinigen. Als nächstes verdauen Sie ein Mikrogramm MTS-pEGFP-N1- und MTS-pERFP-N1-Plasmide mit 1 Mikroliter BamH1 bei 37 Grad Celsius für 2 Stunden.

Dann 1 Mikroliter alkalische Phosphatase des Kälberdarms hinzufügen und 30 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nachdem Sie die Verdauungsprodukte auf einem 1%igen Agarose-Gel laufen lassen und die DNA wie gerade beschrieben gereinigt haben, richten Sie eine Ligationsreaktion mit den im Textprotokoll aufgeführten Reagenzien ein. Dann inkubieren Sie die Reaktion über Nacht bei 4 Grad Celsius.

Transformieren Sie e. coli dH5-alpha-kompetente Zellen mit 10 Mikrolitern der Ligationsmischung. Und züchten Sie die Bakterien über Nacht auf Platten aus LB-Agar plus 10 Milligramm pro Milliliter Kanamycin bei 37 Grad Celsius.

Verwenden Sie am nächsten Tag eine sterile Pipettenspitze, um eine Kolonie von einem Teller zu nehmen. Und stecken Sie die Spitze in ein Röhrchen mit 5 Millilitern LB-Kanamycin. Inkubieren Sie die Kultur über Nacht und verwenden Sie am nächsten Morgen ein Mini-Vorbereitungskit gemäß dem Textprotokoll, um das Plasmid zu isolieren.

Um exponentiell wachsende MCF-10A-Zellen zu transfizieren, verwenden Sie Cdk1- oder CyclinB-1-Plasmide, um Plasmidtransfektionsreagenz im Verhältnis 1:2 in 100 Mikrolitern Serum und antibiotikafreiem Medium herzustellen. Transfizieren Sie die Zellen und inkubieren Sie sie 48 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Färben und visualisieren Sie die Mitochondrien gemäß dem Textprotokoll.

Um die Zellsortierung durchzuführen, transfizieren Sie 2 mal 10 Zellen in die 5. Zellen mit den gewünschten Vektoren in einer 6-Well-Platte unter Verwendung eines Verhältnisses von 1:2 von DNA zu Transfektionsreagenz, das in 2,5 Millilitern Serum und antibiotikafreiem Medium hergestellt wurde. Nachdem die Transfektion 48 Stunden lang inkubiert wurde, verwenden Sie Durchflusszytometrie, um die Zellen, die die GFP-markierten Cdk-1- und RFP-markierten ClyclinB1-Proteine stabil exprimieren, gemäß dem Textprotokoll lebend zu sortieren. Um die Länge des Zellzyklus mit dem EdU-Markierungs-Durchflusszytometrie-Assay zu messen, werden die Zellen in 6-Well-Platten mit einer Dichte von 2,5 mal 10 bis 5 Zellen pro Well gesät

Nach einer Inkubation über Nacht wird dem Kulturmedium EdU in einer Endkonzentration von 25 Mikromolaren zugesetzt und eine weitere Stunde inkubiert. Verwenden Sie dann im Abstand von zwei Stunden 1 % BSA in 500 Mikrolitern PBS, um eine Vertiefung der Zellen zu waschen. Und in einer 1,5-Milliliter-Tube sammeln.

Die Zellen bei 350 g 5 Minuten lang zentrifugieren. Entsorgen Sie dann den Überstand. Entfernen Sie das Pellet, indem Sie 100 Mikroliter Fixierlösung hinzufügen.

Gut mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Verwenden Sie anschließend 1 Milliliter 1% BSA in PBS, um die Zellen dreimal zu waschen. Verwenden Sie dann 0,5 Milliliter 70%iges Ethanol, um die Zellen über Nacht bei 4 Grad Celsius zu fixieren.

Bei der Durchführung der EdU-Markierung mit Zellen, die mit GFP- und RFP-markierten Proteinen transfiziert wurden, ist es entscheidend, die Fluoreszenzsignale von GFP und RFP zu löschen. Um dies zu erreichen, fügen wir einen zusätzlichen Schritt der Zellfixierung über Nacht mit 70 % Ethanol hinzu. Am nächsten Tag, nachdem Sie die Zellen gemäß dem Textprotokoll gewaschen und permeabilisiert haben, geben Sie 0,5 Milliliter Reaktionscocktail in jedes Röhrchen und mischen Sie gut.

Nach der Inkubation im Dunkeln und einer weiteren Wäsche verwenden Sie 50 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodid oder PI in 1%BSA PBS, um die DNA zu färben. Analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie, um die EdU-positive Population zu verfolgen. Präsentieren Sie ein Streudiagramm von EdU-markierten Zellen, die auf DNA-Gehalt und EdU gefärbt wurden.

Verwenden Sie den APC-Kanal für Alexa 647 EdU unter Verwendung eines 670 30-Bandpassfilters, bei dem das gesamte Licht weniger als 685 Nanometer auf diesen Filter trifft, und den Phycoerythrin-Kanal für PI mit einem 581 15-Bandpass-Filter davor, wobei das gesamte Licht weniger als 600 Nanometer auf diesen Filter trifft. Mit einer Standard-Gating-Strategie für die Akquisition wird die FSC-Fläche nach SSC-Fläche für die Morphologie aufgetragen, gefolgt von PI durch Alexa 647 EdU für die Zellfärbung. Zeichnen Sie die Daten für alle Röhrchen nacheinander auf und erfassen Sie 10.000 Ereignisse pro Probe.

In dieser Abbildung wurden das mitochondriale Matrixprotein Hsp60 und das Intermembranraumprotein Timm13 als submitochondriale Lokalisierungsmarker verwendet. Ähnlich wie bei Hsp60, aber im Gegensatz zu Timm13 waren CyclinB1 und Cdk1 vor dem Trypsinverdau geschützt, was darauf hindeutet, dass sie an der mitochondrialen Matrix lokalisieren. Wie hier gezeigt, wurde durch Western Blotting der isolierten mitochondrialen Fraktionen unter Verwendung der MTS- und GFP-markierten cyclinB1- und Cdk-1-Konstrukte eine Überexpression von cyclinB1 und/oder Cdk-1 in den Mitochondrien erreicht.

Unter Verwendung eines EdU-Puls-Chase-Assays konnte gezeigt werden, dass markierte S-Phase-Zellen die G2M-Phase durchlaufen und in Zellen, die das mitochondriale Wildtyp-Cyclin B1 Cdk-1 exprimieren, innerhalb von 4 Stunden in der G1-Phase erscheinen. Im Vergleich zu 6 Stunden bei Zellen, die mit einer Vektorkontrolle oder einer Mutante cyclinB1 Cdk-1 transfiziert wurden, deutet dies darauf hin, dass eine Erhöhung des mitochondrialen CyclinB1 Cdk-1 die Zellzyklusprogression beschleunigt. Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie die mitochondriale ATP-Erzeugung, der Sauerstoffverbrauch, das Membranpotenzial und die reaktive Sauerstoffspezies gemessen werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. wie die mitochondriale Lokalisation der Zellzykluskinase Cdk-1 die mitochondriale Atmung und die Energieabgabe verändert.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die mitochondriale Lokalisation und die mitochondrienspezifischen Funktionen einer Kernkinase untersuchen können.