Experimentelle Ansätze zur Untersuchung Mitochondriale Lokalisation und Funktion eines Kernzellzyklus-Kinase, Cdk1

Das übergeordnete Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, die Submitochondrien-Lokalisation einer normalerweise im Zellkern lokalisierten Zellzykluskinase zu bestimmen und anschließend zu analysieren, wie sich ihre mitochondriale Lokalisation auf den Fortschritt des Zellzyklus auswirkt. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Mitochondrienforschung zu beantworten, beispielsweise wie der Zellkern während des Zellzyklus mit den Mitochondrien kommuniziert. Indem Proteine mit einer mitochondriellen Leitersequenz markiert werden, können wir gezielt eine Überexpression des Proteins in den Mitochondrien erzielen und somit deren mitochondrienspezifische Funktionen untersuchen.

Obwohl diese Methode Einblicke in die mitochondriale Zielgerichtetheit bestimmter Proteine ermöglichen kann, lässt sie sich auch auf andere Organellen wie den Zellkern, das ER, das Golgi-Apparat und ein Lysosom anwenden. Nach dem Kultivieren, Homogenisieren und Zentrifugieren der Zellen gemäß dem schriftlichen Protokoll überführen Sie das Überstand in ein neues Röhrchen. Und zentrifugieren Sie die Probe bei 7.000 g und 4 Grad Celsius für 10 Minuten.

Verwenden Sie anschließend 200 Mikroliter eiskalte IBC-Pufferlösung, um das Pellet erneut aufzusuchen, und teilen Sie das Homogenat in zwei Aliquote auf. Zentrifugieren Sie die Proben erneut bei 7.000 × g und 4 °C für 10 Minuten. Wiederholen Sie den Waschschritt.

Nach dem Verwerfen des Überstandes 30 Mikroliter Zelllysepuffer zu einem der Pellets hinzufügen und das Lysat für die Immunoblotanalyse bei 80 Grad Celsius lagern. Um eine Natriumcarbonat-Extraktion mit dem zweiten Pellet durchzuführen, um lösliche und membrangebundene Proteine zu trennen, 250 Mikroliter 0,1 molarer Natriumcarbonat-Lösung (pH 11,0) hinzufügen und 30 Minuten auf Eis inkubieren. Anschließend bei 100.000 × g 20 Minuten zentrifugieren.

Anschließend sammeln Sie den Überstand und geben ein gleiches Volumen frisch hergestellter 20 %igen Trichloressigsäure hinzu, um die Proteine auszufällen. Lassen Sie die Probe 30 Minuten auf Eis. In der Zwischenzeit geben Sie 30 Mikroliter Zelllysepuffer zum Pellet hinzu und führen eine Beschallung gemäß dem Textprotokoll durch, bevor Sie die Probe zur Immunoblot-Analyse bei 80 Grad Celsius lagern.

Nach der 30-minütigen TCA-Inkubation die Reaktion bei 15.000 g 10 Minuten lang zentrifugieren. Den Überstand verwerfen und dann den Pellet mit 80 Mikroliter Zelllysepuffer erneut suspendieren. Nach der Isolierung der mitochondrialen Fraktionen aus Zellen gemäß dem schriftlichen Protokoll die mitochondrialen Fraktionen in 10 gleiche Anteile aufteilen.

Zentrifugieren Sie die Proben bei 7.000 g und 4 Grad Celsius für 10 Minuten. Verwenden Sie 30 Mikroliter eines Bereichs an Konzentrationen hypotonischer Saccharose-Puffer mit oder ohne Trypsin, um jedes Pellet aufzulösen. Inkubieren Sie dann 30 Minuten auf Eis.

Fügen Sie 3 µL einer 10 mmolaren PMSF-Lösung zu den Trypsin-haltigen Vials hinzu, um die Trypsin-Digestion zu stoppen. Anschließend 10 Minuten auf Eis inkubieren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 14.000 × g und 4 °C für 10 Minuten.

Und überführen Sie das Überstand in ein neues Gefäß. Um das Pellet aufzulysieren, geben Sie 30 Mikroliter Zelllysepuffer hinzu. Sonizieren Sie die Proben gemäß der schriftlichen Anleitung und lagern Sie sie bei 80 Grad Celsius.

Um mitochondriengesteuerte GFP/RFP-markierte CyclinB1-Cdk1-Vektoren herzustellen, klonieren Sie die mitochondriale Targeting-Sequenz aus dem Vorläuferprotein der menschlichen Cytochrom-c-Oxidase-Untereinheit 8A und fügen Sie sie mittels der Restriktionsstellen NheI und BamHI am N-Terminus von GFP oder RFP in die Vektoren pEGFP-N1 bzw. pERFP-N1 ein, und zwar unter Verwendung standardmäßiger molekularbiologischer Klonierungstechniken. Amplifizieren Sie mithilfe der im Textprotokoll angegebenen Primer die Gene für Cdk1 und CyclinB1 nach etablierten Methoden. Danach digerieren Sie die PCR-Produkte mit BamH1.

Führen Sie die Reaktionen auf einem 1 %igen Agarosegel durch und schneiden Sie mit einem Rasierklingenblatt die DNA-Fragmente der korrekten Größe aus. Reinigen Sie anschließend die DNA mit einem Gel-Extraktionskit. Danach digerieren Sie ein Mikrogramm der Plasmide MTS-pEGFP-N1 und MTS-pERFP-N1 mit einem Mikroliter BamH1 bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden.

Fügen Sie dann 1 µL kalbintestinale alkalische Phosphatase hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C für 30 Minuten. Nachdem Sie die Verdauungsprodukte auf einem 1 %igen Agarosegel aufgetrennt und die DNA wie gerade beschrieben gereinigt haben, richten Sie eine Ligationsreaktion mit den im Textprotokoll aufgeführten Reagenzien ein. Inkubieren Sie die Reaktion anschließend über Nacht bei 4 °C.

Transformieren Sie e. coli dH5-alpha kompetente Zellen mit 10 µL der Ligationsmischung und kultivieren Sie die Bakterien über Nacht auf LB-Agar-Platten mit 10 mg/mL Kanamycin bei 37 °C.

Am folgenden Tag eine Kolonie mit einer sterilen Pipettenspitze von einer Platte entnehmen und die Spitze in ein Reagenzglas mit 5 Milliliter LB-Kanamycin geben. Die Kultur über Nacht inkubieren und am nächsten Morgen gemäß der schriftlichen Anleitung ein Minipräp-Kit verwenden, um das Plasmid zu isolieren.

Um exponentiell wachsende MCF-10A-Zellen zu transfizieren, verwenden Sie Cdk1- oder CyclinB-1-Plasmide, um das Plasmid-Transfektionsreagenz im Verhältnis von 1:2 in 100 µL serum- und antibiotikafreiem Medium herzustellen. Transfizieren Sie die Zellen und inkubieren Sie sie 48 Stunden bei 37 °C. Färben und visualisieren Sie die Mitochondrien gemäß dem Textprotokoll.

Zur Durchführung des Zellsortings transfectieren Sie 2 × 10⁵ Zellen mit den gewünschten Vektoren in einer 6-Loch-Platte unter Verwendung eines 1:2-Verhältnisses von DNA zu Transfektionsreagenz, das in 2,5 Milliliter serum- und antibiotikafreiem Medium hergestellt wurde. Nach einer 48-stündigen Inkubation der Transfektion verwenden Sie die Durchflusszytometrie, um lebende Zellen, die stabil die GFP-markierte Cdk-1- und RFP-markierte CyclinB1-Proteine exprimieren, gemäß dem Textprotokoll zu sortieren. Zur Bestimmung der Zellzykluslänge mittels EdU-Markierungs-Durchflusszytometrie säen Sie die sortierten Zellen in 6-Loch-Platten mit einer Dichte von 2,5 × 10⁵ Zellen pro Loch aus.

Nach einer Übernacht-Inkubation EdU in das Kulturmedium mit einer Endkonzentration von 25 µM zugeben und weitere eine Stunde inkubieren. Danach alle zwei Stunden eine Zellmulde mit 500 µL PBS, das 1 % BSA enthält, waschen und die Zellen in einem 1,5-mL-Röhrchen sammeln.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 350 g für 5 Minuten. Danach entsorgen Sie das Überstand. Lösen Sie das Pellet auf, indem Sie 100 Mikroliter Fixierungslösung hinzufügen.

Gut mischen und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend die Zellen dreimal mit je 1 Milliliter 1 % BSA in PBS waschen. Danach die Zellen mit 0,5 Millilitern 70 %igem Ethanol bei 4 Grad Celsius über Nacht fixieren.

Bei der EdU-Markierung von Zellen, die mit GFP- und RFP-markierten Proteinen transfiziert wurden, ist es entscheidend, die Fluoreszenzsignale von GFP und RFP abzuschwächen. Dazu fügen wir einen zusätzlichen Schritt der Übernacht-Fixierung der Zellen mit 70 %igem Ethanol hinzu. Am folgenden Tag, nach dem Waschen und Permeabilisieren der Zellen gemäß dem Textprotokoll, geben Sie 0,5 Milliliter Reaktionscocktail in jedes Gefäß und mischen gründlich.

Nach der Inkubation im Dunkeln und einem weiteren Waschschritt verwenden Sie 50 Mikrogramm pro Milliliter Propidiumiodid oder PI in 1 % BSA in PBS, um die DNA zu färben. Analysieren Sie die Zellen mittels Durchflusszytometrie, um die EdU-positive Population zu verfolgen. Stellen Sie eine gestreute Punktdiagrammdarstellung von EdU-markierten Zellen dar, die auf DNA-Gehalt und EdU gefärbt wurden.

Verwenden Sie den APC-Kanal für Alexa 647 EdU mit einem 670/30-Bandpassfilter, wobei sämtliches Licht, das unterhalb von 685 Nanometern liegt, auf dieses Filter trifft, sowie den Phycoerythrin-Kanal für PI mit einem 581/15-Bandpassfilter davor, wobei sämtliches Licht, das unterhalb von 600 Nanometern liegt, auf dieses Filter trifft. Verwenden Sie eine Standard-Gating-Strategie für die Datenaufnahme, tragen Sie FSC-Fläche gegen SSC-Fläche für die Morphologie auf und anschließend PI gegen Alexa 647 EdU für die Zellfärbung. Erfassen Sie die Daten für alle Proben nacheinander, wobei jeweils 10.000 Ereignisse pro Probe aufgezeichnet werden.

In dieser Abbildung wurden das Matrixprotein der Mitochondrien Hsp60 und das Protein Timm13 des intermembranösen Raums als Marker für die subzelluläre Lokalisation in Mitochondrien verwendet. Ähnlich wie Hsp60, jedoch im Gegensatz zu Timm13, waren CyclinB1 und Cdk1 vor dem Verdau durch Trypsin geschützt, was darauf hinweist, dass sie sich in der mitochondrialen Matrix befinden. Wie hier gezeigt, wurde mittels Western Blot-Analyse der isolierten mitochondrialen Fraktionen unter Verwendung von MTS- und GFP-markierten Konstrukten von CyclinB1 und Cdk-1 eine Überexpression von CyclinB1 und/oder Cdk-1 in den Mitochondrien erreicht.

Mithilfe eines EdU-Puls-Chase-Assays wurde gezeigt, dass markierte Zellen in der S-Phase innerhalb von nur 4 Stunden durch die G2M-Phase fortschritten und in der G1-Phase auftauchten, wenn sie den wildtypischen mitochondrialen CyclinB1-Cdk-1 exprimierten. Im Vergleich dazu benötten Zellen, die mit einem Vektor-Kontrollkonstrukt oder einem mutierten CyclinB1-Cdk-1 transfiziert wurden, 6 Stunden, was darauf hinweist, dass eine Steigerung des mitochondrialen CyclinB1-Cdk-1 die Zellzyklusprogression beschleunigt. Nach dieser Vorgehensweise können weitere Methoden wie die mitochondriale ATP-Produktion, Sauerstoffverbrauch, Membranpotential und reaktive Sauerstoffspezies gemessen werden, um zusätzliche Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise wie die mitochondriale Lokalisation der Zellzyklus-Kinase Cdk-1 die mitochondriale Atmung und Energieproduktion verändert.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die mitochondriale Lokalisation und die mitochondrienspezifischen Funktionen einer nukleären Kinasen untersucht.