Name: Visualisierung der UV-induzierten Replikation Zwischenprodukte in E. coli Mit Hilfe von zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Lernen Sie die zweidimensionale Agarose-Gel-Analyse zur Visualisierung von DNA-Replikationszwischenprodukten nach UV-Schäden in E. coli. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Reparaturmechanismen.

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Die Arbeit in unserem Labor wird von CAREER-Preis MCB0551798 von der National Science Foundation und AREA gewähren R15GM86839 aus dem NIGMS-NIH unterstützt.

1. Wachstum und UV-Bestrahlung. <ol><li> 200 ul einer frischen Übernacht-Kultur, die das Plasmid pBR322 in Davis Medium 1 gewachsen mit 0,4% Glucose, 0,2% Casaminosäuren und 10 pg / ml Thymin (DGCthy mittel) und 100 ug / ml Ampicillin wird pelletiert. Das Zellpellet wird dann in 200 ul DGCthy Medium ohne Ampicillin resuspendiert und verwendet werden, um 20 ml DGCthy Beimpfen. </li><li> Kulturen sind ohne Ampicillin-Selektion in einem Schüttelinkubator bei 37 ° C auf eine OD 600 von 0,5 (~ 5 x 10 8 Zellen / ml) gewachsen. Wachstum ohne Ampicillin verhindert Selektion gegen anormales oder unproduktive Replikation Zwischenprodukte, die in einigen Mutanten entstehen können. Darüber hinaus, wenn mit UV-Licht, um Schäden zu induzieren, ist die Entfernung des Ampicillin aus den Medien notwendig, weil es stark absorbiert bei diesen Wellenlängen und schirmt den Zellen, wodurch die effektive Dosis von UV. </li><li> Arbeiten unter gelb leuchtet, ist die Kultur in einem 15cm Durchmesser Petrischale auf einer rotierenden Plattform für Agitation gestellt. Unsere Kulturen sind in einem Abstand von einer 15-Watt-Entkeimungslampe, dass eine Exposition von ~ 1 J/m2/sec, die mit Hilfe eines UVC Photometer produziert platziert. Die Kulturen werden mit 50 J/m2 bestrahlt und dann sofort wieder in platziert das Schütteln 37 ° C Inkubator für die Dauer des Experiments. Diese Dosis produziert, durchschnittlich 1 Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer alle 4,5 kb von ssDNA. Die gelbe Beleuchtung verhindert Photoreaktivierung-Auflösung von Cyclobutan-Pyrimidin-Dimere durch Photolyase. </li></ol> 2. DNA Isolation. <ol><li> In Zeiten, in denen die Replikation Zwischenprodukte untersucht werden sollen, ist eine 0,75 ml Aliquot der Kultur in 0,75 ml eiskalter Net30 Puffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 30 mM EDTA) gegeben und auf Eis gestellt, bis zum Ende des den zeitlichen Verlauf. Wir starten üblicherweise eine 90-minütige zeitlichen Verlauf, wobei die Proben bei 0 untersucht, 15, 30, 45, 60 und 90 Minuten. Die EDTA und Kälte dienen, effektiv zu stoppen, Replikation und Nukleotidexzisionsreparatur reparieren. </li><li> Jede Probe wird dann pelletiert, resuspendiert in 150 ul von 1,5 mg / ml Lysozym und 0,2 mg / ml RNaseA in TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA), und lysiert bei 37 ° C für 20 min. Zu diesem Zeitpunkt werden 10 &amp;mgr; l Proteinase K (10mg/ml) und 10 &amp;mgr; l von 20% Sarkosyl zugegeben und die Inkubation läßt man 1 h weiter. Proteinase K und Sarkosyl Hilfe von DNA-Fragmenten, die mit der Membran oder Proteine ​​in Verbindung gebracht werden, bevor Phenolextraktion auftritt, kann loslassen. Seit aktiv replizierenden DNA wird oft Protein oder Membran-Komplexen gebunden ist, hilft diese Erhöhung der Ausbeute der Replikation Fragmente, die wiederhergestellt werden. </li><li> Die Proben werden dann durch Zugabe von 2 Volumen Phenol zu jeder Probe und die Rohre sind 5 Minuten lang vorsichtig invertiert extrahiert. Dann 2 Volumen Chloroform / Isoamylalkohol (24 / 1) zugegeben und die Röhrchen werden vorsichtig wieder für 5 Minuten umgedreht. </li><li> Die Proben werden bei 14.000 rpm in einer Mikrozentrifuge für 5 Minuten und die obere wässrige Phase von jeder Probe zentrifugiert wird entfernt, und in ein frisches Röhrchen. Dann 4 Volumen Chloroform / Isoamylalkohol (24 / 1) zugegeben, die Rohre sind 5 Minuten lang vorsichtig invertiert und erneut zentrifugiert bei 14.000 rpm für 5 Minuten. </li><li> Die obere, wässrige Phase in jeder Probe wird dann für 1 Stunde mit dem Spotting 100 &amp;mgr; jeder Probe auf einem 47mm Whatman 0,025 um Pore Scheibe, die auf 250 ml 0,1 × TE schwimmt in einem Becherglas dialysiert. Da die Replikation Strukturen mit Einzelstrang Regionen oder Verzweigungspunkte anfälliger für Scheren sind wir in der Regel schneiden unsere Pipettenspitzen off mit einer Rasierklinge, um den Mund weiter und minimieren Scherkräfte. Im Allgemeinen sollte Pipettieren auf ein Minimum reduziert werden, bis nach dem DNA wurde mit Restriktionsenzymen verdaut worden. </li><li> Jede Probe wird dann mit PvuII (New England Biolabs), die das Plasmid linearisiert nur hinter den Replikationsursprung verdaut. </li><li> Vor dem Laden in das Agarosegel, 100 &amp;mgr; Chloroform und 20 &amp;mgr; l von 6X loading Farbstoff Bromphenolblau und Xylencyanol enthält, sind zu jeder Probe zugegeben und gemischt. Dann wird 40 ul der wässrigen Phase, welche die Be-Farbstoff in das Gel geladen. Zur Minimierung der strukturellen Verzerrungen, strukturelle Artefakte und DNA Scheren, macht diese Isolation Verfahren beinhalten keine Schritte, um für Einzelstrang Regionen, Niederschlag, oder konzentrieren sich die DNA-Proben nach Zell-Lyse zu bereichern. </li></ol> 3. 2D-Gel und Southern-Analyse. <ol><li> Die 2-dimensionalen Agarose-Gel-Analyse von 3 geändert. Für die 1. Dimension sind die eingeschränkten DNA-Proben durch ein 0,4% Agarosegel in 1x TBE bei 1V/cm laufen. Ein Liter 10x TBE-Stammlösung enthält: <ul><li> 108 g Tris Base </li><li> 55 g Borsäure </li><li> 40 ml 0,5 M EDTA (pH 8,0) </li></ul></li><li> Ein Lambda-Hind III Größenmarker in die erste Gasse geladen ist, dann Proben werden in jedem anderen Spur geladen. Wir starten üblicherweise die ersten dIMENSION ~ 12-15 Uhr. Skipping Gassen macht es einfacher, die Gassen Scheibe aus, um in die zweite Dimension gegossen. Die niedrige Spannung und geringe Prozent Agarosegel dient dazu, die DNA-Fragmente in erster Linie nach Größe aufgetrennt werden. </li><li> Für die zweite Dimension, sind Gelspuren aus der ersten Dimension Gel mit einem großen Fleischermesser in Scheiben geschnitten. Die erste Spur mit dem Lambda-Hind III Marker kann mit Ethidiumbromid angefärbt werden. Mit dem Lambda-Hind III Marker als Leitfaden, zuschneiden und entsorgen Sie die Region des Gels, die unten ist, wo das linearisierte Plasmid erwartet zu laufen. Unter diesen Bedingungen finden wir, dass linearisierte pBR322 läuft leicht über dem Xylencyanol Fleck. </li><li> Um warf die zweite Dimension ist jede Spur horizontal am oberen Rand eines leeren Gel Caster platziert. Eine Lösung von 1,0% Agarose in 1X TBE wird hergestellt und auf 55 ° C abgekühlt Zu diesem Zeitpunkt ist die Gel-Lösung in gegossen, um die zweite Dimension gegossen, so dass Sie vollständig abdecken Gelscheiben. Nachdem das Gel ausgehärtet ist, wird es bei 6.5V/cm in einer Elektrophorese-Einheit, dass der Puffer zu zirkulieren lässt laufen. Wir starten üblicherweise die zweite Dimension ~ 5,5-7 Stunden. Die hohe Spannung und hohe Prozent Agarosegel effektiv trennt die DNA-Fragmente nach ihrer Form basiert, wie auch die Größe. Nichtlineare Formen laufen langsamer durch die zweite Dimension. </li><li> Nach der Elektrophorese wird das Gel wird dann in H 2 O gespült, zweimal in 400 ml 0,25 M Salzsäure für 15 Minuten, mit H 2 O gespült, und dann zweimal in 400 ml 0,4 M NaOH für 30 Minuten gewaschen. Die Säure wäscht dienen teilweise nick die DNA-Moleküle in kleinere Fragmente, die effizienter zu übertragen. Dieser Schritt ist notwendig aufgrund der Größe und ungewöhnlichen Formen der DNA-Replikation Zwischenprodukte. </li><li> Die DNA in den Gelen wird dann auf eine Hybond N + Nylon übertragen Membran 4. Wir verwenden eine rückläufige Alkali-Transfer-System mit 0,4 M NaOH. Kurz gesagt, sind zwei Blätter Löschpapier in 0,4 M NaOH getränkt auf einem großen Stapel Papierhandtücher gelegt. Die Nylonmembran wird auch in 0,4 M NaOH getränkt und platziert auf der Oberseite des Löschpapier. Das Gel wird dann vorsichtig oben auf dieser geschichtet, gefolgt von einem weiteren Stück Löschpapier, in der NaOH-Lösung benetzt. Schließlich ist ein langes Stück angefeuchtet Löschpapier über den oberen Schichten und seinen beiden Enden in ein Geschirr mit 1 L 0,4 M NaOH-Lösung als Docht dienen platziert. Wir in der Regel lassen die DNA-Transfer für 6-12 Stunden. </li><li> Die Nylonmembran wird entfernt, gewaschen 20-30 sec in 5X SSC-Puffer, und platziert in einer Hybridisierung Rolle Flasche mit 10.5ml Prähybridisierungslösung. Dann wird die Membran bei 42 ° C mit einer Rotation von mehr als 6 Stunden inkubiert. Prähybridisierungslösung: <ul><li> 5,0 ml Formamid </li><li> 0,5 ml 20% SDS </li><li> 2,5 ml 20X SSC * </li><li> 2,0 ml 50X Denhardt * </li><li> 0,5 ml Salmon Sperm DNA (10mg/ml) * Rezepte für SSC und Denhardt kann in 5 gefunden werden </li></ul></li><li> Während der Prähybridisierung Zeit ist 1 pg Plasmid pBR322 mit 32P durch Nick-Translation nach dem Protokoll von Roche mit alpha bezeichnet [32-P]-dCTP geliefert gekennzeichnet. Die radioaktiv markierten Sonde (100 &amp;mgr; l) wird durch Inkubation bei 98 ° C denaturiert für 10 Minuten in einem Schraubdeckel Mikrozentrifugenröhrchen, und dann sofort auf Eis gestellt. </li><li> Die denaturierte Sonde wird auf 5,9 ml Hybridisierungslösung, die enthält, hinzugefügt: <ul><li> 3,0 ml Formamid </li><li> 1,5 ml SSC </li><li> 1,0 ml H 2 O </li><li> 0,15 ml 50X Denhardt </li><li> 0,10 ml 20% SDS </li><li> 0,15 ml 10mg/ml Salmon Sperm DNA </li></ul></li><li> Die Prähybridisierungslösung ist aus der Rolle Flasche gegossen und die Hybridisierungslösung gegossen in. Die Walze Flasche wird dann an die 42 ° C Inkubator und gedreht von mehr als 12 Stunden zurück. </li><li> Die Hybridisierungslösung wird der Walze Flasche gegossen. Dann wird der Blot 4-mal für 20 Minuten gewaschen in die Rolle Flasche mit ~ 150 ml einer Waschlösung mit 0.5X SSC, 0,1% SDS bei 42 ° C mit Rotation. </li><li> Nach dem letzten Waschschritt wird die Membran auf ein Papiertuch gelegt, bis die Flüssigkeit sichtbar verschwunden ist. Die Membran wird dann in Polyvinylchlorid Plastikfolie gewickelt und ausgesetzt zu einem Phosporimager Bildschirm. Wir visualisieren und zu quantifizieren, die Radioaktivität mit einem Sturm 840 und die damit verbundenen ImageQuant Software. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse: <img src="/files/ftp_upload/2220/2220fig1.jpg" alt="Abbildung 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Abbildung 1"> Abbildung 1. Plasmid-Replikation Zwischenprodukte bei der An-und Abwesenheit von UV-induzierten DNA-Schäden beobachtet. Die Migration Muster von PvuII verdaut pBR322 Plasmid durch 2D-Agarose-Gel-Analyse beobachtet wird grafisch dargestellt. Non-Replikation linearen Plasmide als lineare 4,4-kb-Fragment laufen. Replizierenden Plasmiden Form Y-förmige Strukturen, die langsamer als die nicht-replizierenden Fragmente aufgrund ihrer größeren Größe und keine Migrationnlinear Form. Diese Migration Muster bildet einen Bogen, der aus erstreckt sich von der linearen Bereich in Richtung des Brunnens. Nach UV-Bestrahlung, Doppel-Y-oder X-förmige Moleküle sind in der Kegel Region, die langsamer wandert als der Bogen der Y-förmige Moleküle beobachtet. Ein Beispiel für die Southern-Analyse der 2D-Gel sondiert mit 32P-markierten pBR322 ist für die Zellen unmittelbar nach UV-Bestrahlung und 15 Minuten nach UV-Bestrahlung (mit freundlicher Genehmigung des Verlags) gezeigt.

<ol><li>Davis, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Isolation+of+Biochemically+Deficient+Mutants+of+Bacteria+by+Means+of+Penicillin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Isolation of Biochemically Deficient Mutants of Bacteria by Means of Penicillin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 35, 1-10 (1949).</li>
<li>Courcelle, J., Donaldson, J. R., Chow, K. H., Courcelle, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Damage-Induced+Replication+Fork+Regression+and+Processing+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA Damage-Induced Replication Fork Regression and Processing in Escherichia coli.</a> Science. 299, 1064-1067 (2003).</li>
<li>Friedman, K. L., Brewer, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+replication+intermediates+by+two-dimensional+agarose+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Analysis of replication intermediates by two-dimensional agarose gel electrophoresis.</a> Methods Enzymol. 262, 613-627 (1995).</li>
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<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvABC+is+required+to+resolve+holliday+junctions+that+accumulate+following+replication+on+damaged+templates+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RuvABC is required to resolve holliday junctions that accumulate following replication on damaged templates in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 281, 28811-28821 (2006).</li>
<li>Donaldson, J. R., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RuvAB+and+RecG+Are+Not+Essential+for+the+Recovery+of+DNA+Synthesis+Following+UV-Induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">RuvAB and RecG Are Not Essential for the Recovery of DNA Synthesis Following UV-Induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> Genetics. 166, 1631-1640 (2004).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecO+Acts+with+RecF+and+RecR+to+Protect+and+Maintain+Replication+Forks+Blocked+by+UV-induced+DNA+Damage+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">RecO Acts with RecF and RecR to Protect and Maintain Replication Forks Blocked by UV-induced DNA Damage in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 279, 3492-3496 (2004).</li>
<li>Belle, J. J., Casey, A., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inactivation+of+the+DnaB+helicase+leads+to+the+collapse+and+degradation+of+the+replication+fork%3A+a+comparison+to+UV-induced+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Inactivation of the DnaB helicase leads to the collapse and degradation of the replication fork: a comparison to UV-induced arrest.</a> J Bacteriol. 189, 5452-5462 (2007).</li>
<li>Chow, K. H., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecBCD+and+RecJ%2FRecQ+initiate+DNA+degradation+on+distinct+substrates+in+UV-irradiated+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">RecBCD and RecJ/RecQ initiate DNA degradation on distinct substrates in UV-irradiated Escherichia coli.</a> Radiat Res. 168, 499-506 (2007).</li>
<li>Al-Hadid, Q., Ona, K., Courcelle, C. T., Courcelle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA433+cells+are+defective+in+recF-mediated+processing+of+disrupted+replication+forks+but+retain+recBCD-mediated+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">RecA433 cells are defective in recF-mediated processing of disrupted replication forks but retain recBCD-mediated functions.</a> Mutat Res. 645, 19-26 (2008).</li>
</ol>

Typische Ergebnisse aus Wildtyp-Zellen in Anwesenheit und Abwesenheit von UV-induzierten Schäden sind in Abbildung 1 dargestellt. In Abwesenheit von Schäden, kann ~ 1% der gesamten Plasmid-DNA in der Y-Bogen gefunden werden, wenn die Zellen rasch wachsende in der exponentiellen Phase. Nach der Bestrahlung ist ein vorübergehender Anstieg der Y-förmige Moleküle beobachtet, wie blockiert Replikationsgabeln an geschädigten Stellen ansammeln. Die X-förmige Replikation Zwischenprodukte auch vorübergehend ansammeln und bis zu ...

<table><tbody><tr><td>Ein Beispiel der Southern-Analyse des 2D-Gels, das untersucht wurde</td><td>GE Healthcare</td><td>G15T8</td><td>Yellow Lighting</td></tr><tr><td>15 &amp;mu;Watt keimabtötende Lampe</td><td>Sylvania</td><td>F20T12/GO</td><td>UV-Lampe</td></tr><tr><td>Blak-Ray UV-Intensitätsmessgerät 254 nm</td><td>Daigger</td><td>EF28195T</td><td>UVC-Photometer</td></tr><tr><td>Scheiben mit 0,025 &amp;mu;m Porengröße</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>VSWP04700</td><td>Schwimmende Dialysescheiben</td></tr><tr><td>PvuII</td><td>Fermentas</td><td>ER0632</td><td>Restriktionsendonuklease</td></tr><tr><td>Nick-Translation-Kit</td><td>Roche Group</td><td>976776</td><td>Zur Herstellung einer mit 32P markierten Sonde</td></tr><tr><td>Abdruckpapier</td><td>Whatman, GE Healthcare</td><td>3030-704</td><td>Für den Southern-Transfer</td></tr><tr><td>Nylonmembran</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN203S</td><td>Für den Southern-Transfer</td></tr></tbody></table>

visualisierung der uv-induzierten replikation zwischenprodukte in e. coli mit hilfe von zweidimensionalen agarose-gel-analyse

Visualization of UV-induced Replication Intermediates in E. coli using Two-dimensional Agarose-gel Analysis

Ungenaue Replikation in Anwesenheit von DNA-Schäden verantwortlich ist für die Mehrheit der zellulären Umlagerungen und Mutagenese in alle Zelltypen zu beobachten und wird allgemein angenommen, um direkt mit der Entstehung von Krebs beim Menschen in Verbindung gebracht werden. DNA-Schäden, wie sie durch UV-Bestrahlung induziert wird, stark beeinträchtigt die Fähigkeit der Replikation der genomischen Vorlage exakt zu duplizieren. Eine Reihe von Genprodukten identifiziert worden, die erforderlich sind, wenn die Replikation Begegnungen DNA-Läsionen in der Vorlage. Allerdings hat eine verbleibende Herausforderung, wie diese Proteine ​​Prozess Läsionen während der Replikation bestimmen<em&gt; In vivo</em&gt;. Mit Escherichia coli als Modellsystem, beschreiben wir ein Verfahren, bei dem zwei-dimensionalen Agarose-Gel-Analyse verwendet werden, um die strukturellen Zwischenprodukte, die auf replizierende Plasmide entstehen identifiziert werden können<em&gt; In vivo</em&gt; Folgende UV-induzierten DNA-Schäden. Dieses Verfahren wurde verwendet, um nachzuweisen, dass Replikationsgabeln durch UV-induzierte Schäden blockiert eine vorübergehende Umkehr, die von RecA und mehrere Genprodukte mit dem RecF Weg verbundenen stabilisiert zu unterziehen. Die Technik zeigt, dass diese Replikation Zwischenprodukte bis zu einer Zeit, die mit der Entfernung der Läsionen, die durch Nukleotidexzisionsreparatur Reparatur und Replikation fortgesetzt korreliert werden beibehalten.

Wir präsentieren ein Verfahren, mit dem zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse verwendet werden, um die Struktur der Replikation Zwischenprodukte, die nach UV-Bestrahlung auftreten, identifiziert werden können.

Visualisierung der UV-induzierten Replikation Zwischenprodukte in E. coli Mit Hilfe von zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse

Eine ungenaue Replikation bei vorliegender DNA-Schädigung ist für die Mehrheit der zellulären Umlagerungen und Mutagenesen verantwortlich, die in allen Zelltypen beobachtet werden ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die DNA-strukturellen Zwischenprodukte sichtbar zu machen, die entstehen, wenn die Replikation auf DNA-Läsionen trifft, unter Verwendung einer zweidimensionalen Gelelektrophorese. Dies wird erreicht, indem zunächst die DNA aus aktiv teilenden Zellen isoliert wird, in denen replikationsblockierende Läsionen induziert wurden. Anschließend wird die Gelelektrophorese verwendet, um die gewonnene DNA anhand ihrer Größe zu trennen.Anschließend werden die Gelen ausschneiden und horizontal in ein zweites Gel eingebracht, das die DNA weiter basierend auf Größe und Form trennt. Schließlich wird eine Southern-Analyse verwendet, um die DNA-Strukturen sichtbar zu machen, die mit replizierenden DNA-Fragmenten zu Zeitpunkten vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Einbringung von UV-induzierten Schäden assoziiert sind. Letztendlich kann dieses Verfahren zeigen, dass die Unfähigkeit, DNA-Läsionen in bestimmten Mutanten zu verarbeiten, zur Anreicherung von DNA-Reparatur-Intermediaten führt.Hallo, mein Name ist Arthur Ian. Ich komme aus dem Corella-Labor der Portland State University. Hallo, mein Name ist Brand she, ich komme ebenfalls aus dem Corella-Labor.Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur zweidimensionalen Gelelektrophorese. In unserem Labor nutzen wir dieses Verfahren, um Intermediatmoleküle der DNA-Replikation und -Reparatur zu untersuchen. Beginnen wir also.Um dieses Verfahren zu beginnen, züchten Sie eine 200 µL große Übernachtkultur von E. coli, die das Plasmid PBR 3 22 in DGC-Thigh-Medium mit Ampicillin bei 37 °C enthält. Die Verwendung von DGC-Thigh-Medium minimiert die UV-Abschirmung. Nach der Übernachtinkubation pelletieren Sie die Zellen bei 14.000 ×g für 30 Sekunden.Suspenderen Sie das Zellpellet anschließend in 200 Mikrolitern DG-C-th-Medium ohne Ampicillin und impfen Sie es an. Kultivieren Sie 20 Milliliter DG-C-th-Medium ohne Ampicillin-Selektion. Führen Sie das Wachstum in einem schüttelnden Inkubator bei 37 Grad Celsius bis zu einem OD600 von 0,5 durch, was einer Dichte von etwa fünf mal 10 hoch acht Zellen pro Milliliter entspricht. Das Wachstum ohne Ampicillin vermeidet eine Selektion gegen abnormale oder unproduktive Replikationsintermediate, die bei einigen Mutanten auftreten können.Zusätzlich ist, falls UV-Licht zur Schädigungsinduktion verwendet wird, die Entfernung des Ampicillins aus dem Medium notwendig, da es bei diesen Wellenlängen stark absorbiert und die Zellen abschirmt, wodurch die effektive Dosis an UV-Strahlung während des Wachstums der Zellen verringert wird. Verwenden Sie ein UVC-Photometer, um den Abstand zu einer 15-Watt-keimabtötenden Lampe zu bestimmen, der eine Bestrahlungsstärke von etwa einem JUUL pro Quadratmeter pro Sekunde erzeugt.Die nachfolgenden Schritte sollten unter gelbem Licht durchgeführt werden, da dies die photoreaktive Umkehrung von Cyclobutan-Pyrimidin-Dimeren durch Photolyase nach UV-Bestrahlung verhindert. Sobald die gewünschte Zelldichte erreicht ist, überführen Sie die Kultur mit einer Pipette in eine Petrischale mit 15 cm Durchmesser auf einer rotierenden Plattform, um eine gleichmäßige Bestrahlung der gesamten Zellpopulation sicherzustellen. Bestrahlen Sie anschließend die Kulturen mit 50 Joule pro Quadratmeter und übertragen Sie sie unverzüglich in einen sterilen, vorgewärmten Kolben. Stellen Sie den Kolben danach zurück in den schüttelnden Inkubator bei 37 Grad Celsius.Für die Dauer des Experiments erzeugt diese Dosis durchschnittlich ein Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer pro 4,5 Kilobasen Einzelstrang-DNA für jeden zu untersuchenden Zeitpunkt. Pipettieren Sie ein 0,75-Milliliter-Aliquot der Kultur in 0,75 Milliliter eiskaltes NET 30-Puffer. NET 30-Puffer dient als Stopp-Puffer, der Replikation und Nukleotid-Exzisionsreparatur daran hindert, fortzuschreiten.Nach Zugabe des Stopfpuffers kann die Probe bis zum Ende der Zeitreihe auf Eis aufbewahrt werden. Nach der Zeitreihe jede Probe pelletieren und die Pellets resuspendieren. Die Zellen in 150 Mikroliter Lysepuffer bei 37 Grad Celsius 20 Minuten lang ohne Rühren lysieren.Da sich replizierende Strukturen mit Einzelstrangbereichen oder Verzweigungspunkten leichter zerschneiden lassen, schneiden Sie die Pipettenspitzen mit einer Rasierklinge ab, um die Mündung zu verbreitern und Scherkräfte zu minimieren. Im Allgemeinen sollten das Pipettieren und Rühren bis nach der Verdauung der DNA mit Restriktionsenzymen nach der Lyse auf ein Minimum beschränkt werden. Geben Sie nach der Lyse Proteinase K und Sarcosyl hinzu und lassen Sie die Inkubation eine Stunde lang weiterlaufen. Dies dient der Freisetzung von DNA-Fragmenten, die mit Proteinen assoziiert sind.Da aktive replizierende DNA häufig an Protein- oder Membrankomplexe gebunden ist, erhöht dies die Ausbeute an Replikationsfragmenten. Nach einer Stunde die Proben extrahieren, indem zwei Volumina Phenol zu jeder Probe gegeben und die Röhrchen fünf Minuten lang vorsichtig invertiert werden. Anschließend zwei Volumina Chloroform, Isoamylalkohol hinzufügen und die Röhrchen weitere fünf Minuten vorsichtig invertieren.Zentrifugieren Sie anschließend die Proben fünf Minuten lang mit 14.000 U/min in einer Mikrozentrifuge und überführen Sie die obere wässrige Phase jeder Probe in ein frisches Röhrchen. Geben Sie dann das Vierfache des Volumens an Chloroform-ISO-Alkohol hinzu und invertieren Sie die Röhrchen erneut vorsichtig für fünf Minuten. Zentrifugieren Sie die Proben erneut fünf Minuten lang mit 14.000 U/min.Legen Sie eine Dialysemembran auf 250 Milliliter 0,1 xte in einem Becher und geben Sie 100 Mikroliter jeder Probe auf die Membran. Lassen Sie die Proben nach der Dialyse eine Stunde lang dialysieren. Geben Sie 80 Mikroliter jeder Probe in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen, das 20 Mikroliter Enzymgemisch enthält.Digrieren Sie die Proben über Nacht bei 37 Grad Celsius. PV zwei linearisiert das Plasmid direkt stromabwärts vom Replikationsursprung. Geben Sie vor dem Beladen des Agarosegels 100 Mikroliter Chloroform und 20 Mikroliter sechsfarbigen Farbstoff, der Bromo enthält, hinzu.Phenolblau und Xylencyan zu jeder Probe geben und Chloroform hinzufügen, um eventuell an DNA-Enden gebundenes PV vollständig zu entfernen. Beginnen Sie die zweidimensionale Agarose-Gelelektrophorese, indem Sie die geschnittenen DNA-Proben in der ersten Dimension laufen lassen. Laden Sie zunächst einen Lambda-HindIII-Größenmarker in die erste Spur eines zuvor vorbereiteten 0,4 %igen Agarosegels in 1×TBE.Dann laden Sie 40 Mikroliter der wässrigen Phase, die den Lade-Farbstoff für jede Probe enthält, auf, wobei Läufe übersprungen werden, um das Schneiden des Gels zu erleichtern. Nach der Elektrophorese führen Sie die erste Dimension bei einer Spannung von einem Volt pro Zentimeter für etwa 12 bis 15 Stunden durch. Die niedrige Spannung und das Agarosegel mit niedrigem Prozentanteil dienen hauptsächlich der Trennung der DNA-Fragmente nach Größe.Nachdem die erste Dimension durchgelaufen ist, schneiden Sie mit einem großen Metzgermesser die erste Spur, die den Lambda-Hind-III-Marker enthält, aus und färben Sie mit Äthidiumbromid. Für die zweite Dimension schneiden Sie die Gele mit dem großen Metzgermesser entlang der Spuren unter Verwendung des Lambda-Hind-III-Markers als Orientierungshilfe aus und entsorgen Sie den Bereich unterhalb der Position, an der das linearisierte Plasmid in jeder Spur erwartet wird. Zum Gießen der zweiten Dimension legen Sie jeden Schnitt horizontal über die Oberseite eines leeren Giegels.Bereiten Sie eine Lösung mit 1 % AROS in einem XTBE vor und kühlen Sie sie auf 55 Grad Celsius ab. Gießen Sie nach dem Abkühlen die Gel-Lösung, um die zweite Dimension zu gießen, und achten Sie darauf, dass die Gel-Scheiben vollständig bedeckt sind. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Scheiben gleichmäßig ausgerichtet sind und der Gießrahmen waagerecht steht, bevor das Gel gegossen wird.Nachdem das Gel erstarrt ist, führen Sie die zweite Dimension fünf einhalb bis sieben Stunden lang bei 6,5 Volt pro Zentimeter in einer Elektrophoreseeinheit durch, die eine effektive Umwälzung des Puffers bei Hochspannung und hohem Agarosegehalt ermöglicht. Dabei werden die DNA-Fragmente aufgrund ihrer Form sowie ihrer Größe getrennt. Nichtlineare Formen wandern nach der Elektrophorese langsamer durch die zweite Dimension. Spülen Sie das Gel einmal mit Wasser ab und waschen Sie es anschließend zweimal je 15 Minuten mit 400 Milliliter 0,25-molarer Salzsäure unter leichtem Schütteln.Die Säurewäschen dienen dazu, die DNA-Moleküle teilweise in kleinere Fragmente einzuschneiden, die während der Southern-Analyse effizienter übertragen werden und aufgrund der großen Größe und ungewöhnlichen Form der DNA-Replikationsintermediate notwendig sind. Um das Gel für die alkalische Übertragung vorzubereiten, spülen Sie das Gel erneut mit Wasser ab und waschen es anschließend zweimal in 400 Milliliter 0,4-molarer Natriumhydroxidlösung je 30 Minuten lang. Die DNA in den Gelen wird dann mittels eines gravitationsgestützten alkalischen Transfersystems auf eine High-Bond-N+-Nylonmembran übertragen, wobei 0,4 molare Natriumhydroxidlösung verwendet wird, wie im schriftlichen Teil dieses Verfahrens beschrieben. Lassen Sie die DNA sechs bis zwölf Stunden übertragen. Anschließend fahren Sie gemäß dem schriftlichen Protokoll mit der Sondenhybridisierung fort.Nachdem die Membran inkubiert und gewaschen wurde, legen Sie die Membran auf ein Papierhandtuch, bis die Flüssigkeit sichtbar verschwunden ist. Wickeln Sie die Membran dann in Polyvinylchlorid-Folie ein und belichten Sie sie auf einem Phospho-Imager-Screen. Schließlich kann die Radioaktivität mit einem Storm-840-Gerät und der dazugehörigen Image-Quant-Software sichtbar gemacht und quantifiziert werden.Das Migrationsmuster von PV zwei verdautem PBR 3 22-Plasmid, beobachtet mittels 2D-Aros-Gel-Analyse, ist dargestellt. Nicht replizierende lineare Plasmide wandern als lineares 4,4-KB-Fragment, während replizierende Plasmide Y-förmige Strukturen bilden, die aufgrund ihrer größeren Größe und ihrer nichtlinearen Form langsamer wandern als die nicht replizierenden Fragmente. Dieses Migrationsmuster bildet einen Bogen, der sich vom linearen Bereich in Richtung der Mulde nach UV-Bestrahlung erstreckt.Doppelte Y- oder X-förmige Moleküle werden im Kegelbereich beobachtet und wandern langsamer als der Bogen aus Y-förmigen Molekülen. Ein Beispiel der Southern-Analyse des mit P 32 markierten PBR 3 22 hybridisierten 2D-Gels ist für Zellen unmittelbar nach UV-Bestrahlung und 15 Minuten nach UV-Bestrahlung dargestellt. Etwa 1 % der gesamten zellulären DNA findet sich im Y-Bogen, wenn sich die Zellen nach einer Bestrahlung in der exponentiellen Wachstumsphase schnell teilen.Ein vorübergehender Anstieg von Y-förmigen Molekülen wird beobachtet, wenn blockierte Replikationsgabeln an beschädigten Stellen anreichern. Die L-förmigen Replikationsintermediate reichern sich ebenfalls vorübergehend an und verbleiben bis zu einem Zeitpunkt, der mit der Reparatur der Läsionen korreliert. Soeben haben wir Ihnen gezeigt, wie man DNA-Reparaturintermediate mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese sichtbar machen kann.Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, auf Scherkräfte zu achten, die die Ausbeute verringern können, und alle Proben sowie Gele schonend zu behandeln. Das war's. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll zeigt eine einfache Einzelmolekül-Fluoreszenz-Mikroskopie-Technik zur Visualisierung der DNA-Replikation von einzelnen replisomes in Echtzeit.

Visualizing Einzel-Molekül-DNA-Replikation mit Fluoreszenz-Mikroskopie

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Screening für Funktionelle nichtkodierenden genetischen Varianten Mit elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) und DNA-Affinitätspräzipitation Assay (DAPA)

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Induzierung einer Site Specific Replikation Verstopfungen in<i&gt; E. coli</i&gt; Ein fluoreszierendes Repressor Operator System verwenden

Im Folgenden wird das Verfahren zur Analyse des Replikationsverlaufs durch pathogene, strukturanfällige Wiederholungen mittels 2-dimensionaler Gelelektrophorese skizziert.

Elektrophoretische Analyse der Replikation durch strukturanfällige DNA-Wiederholungen innerhalb des SV40-basierten humanen Episoms

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