Visualisierung der UV-induzierten Replikation Zwischenprodukte in E. coli Mit Hilfe von zweidimensionalen Agarose-Gel-Analyse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die DNA-Strukturzwischenstufen, die auftreten, wenn die Replikation auf DNA-Läsionen trifft, mit Hilfe der zweidimensionalen Gelanalyse zu visualisieren. Dies wird erreicht, indem zunächst die DNA von sich aktiv teilenden Zellen isoliert wird, in denen replikationsblockierende Läsionen induziert wurden. Dann wird die Gelelektrophorese verwendet, um die wiedergewonnene DNA nach Größe zu trennen.

Als nächstes werden die Lanes ausgeschnitten und horizontal in einem zweiten Gel neu gegossen, das die DNA je nach Größe und Form weiter trennt. Schließlich wird die Südstaatenanalyse verwendet, um die DNA-Strukturen zu visualisieren, die mit der Replikation von DNA-Fragmenten zu Zeiten vor und zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Einführung von UV-induzierten Schäden verbunden sind. Letztendlich kann dieses Verfahren verwendet werden, um zu zeigen, dass die Unfähigkeit, DNA-Läsionen in bestimmten Mutanten zu verarbeiten, zu einer Akkumulation von DNA-Reparatur-Zwischenprodukten führt.

Hallo, mein Name ist Arthur Ian. Ich komme vom Corella Lab an der Portland State University. Hallo, mein Name ist Brand she, ich bin auch aus dem Corella Lab.

Heute zeigen wir Ihnen ein Verfahren zur zweidimensionalen Gelelektrophorese. Wir verwenden dieses Verfahren in unserem Labor, um die DNA-Replikation und die Reparatur von Zwischenprodukten zu untersuchen. Also lasst uns loslegen.

Um dieses Verfahren zu beginnen, züchten Sie eine 200-Mikroliter-Übernachtkultur von E. coli, die das Plasmid PBR 3 22 enthält, in DGC-Oberschenkelmedium mit Ampicillin bei 37 Grad Celsius. Die Verwendung von DGC Oberschenkelmedium minimiert die UV-Abschirmung. Nach der Inkubation über Nacht werden die Zellen 30 Sekunden lang bei 14.000 RRP M pelletiert.

Dann resuspendieren Sie das Zellpellet in 200 Mikrolitern DG C th Medium ohne Ampicillin und impfen Sie. 20 Milliliter DG C Oberschenkelmedium züchten Kulturen ohne Ampicillinauswahl. In einem Schüttelinkubator bei 37 Grad Celsius ergibt sich ein OD 600 von 0,5, was etwa fünfmal 10 pro Milliliter Wachstum ohne Ampicillin entspricht, wodurch eine Selektion gegen abnormale oder unproduktive Replikationszwischenprodukte vermieden wird, die bei einigen Mutanten auftreten können.

Darüber hinaus ist bei Verwendung von UV-Licht, um Schäden herbeizuführen, die Entfernung des Ampicillins aus dem Medium notwendig, da es bei diesen Wellenlängen stark absorbiert und abschirmt. Die Zellen reduzieren die effektive Dosis von UV-Strahlung, während die Zellen wachsen. Verwenden Sie ein UVC-Photometer, um den Abstand zu einer keimtötenden 15-Watt-Lampe zu bestimmen, die eine Belichtungsrate von etwa einem JUUL pro Meter zum Quadrat pro Sekunde erzeugt.

Die nachfolgenden Schritte sollten unter gelbem Licht durchgeführt werden, da dies die Umkehrung der Photoreaktivierung von Cyclobutan-Perin-Dimeren durch Photoliase nach der UV-Bestrahlung verhindert. Sobald die gewünschte Zelldichte erreicht ist, übertragen Sie die Kultur mit einer Pipette in eine Petrischale mit einem Durchmesser von 15 Zentimetern auf einer rotierenden Plattform, um eine gleichmäßige Bestrahlung der gesamten Zellpopulation zu gewährleisten. Anschließend bestrahlen Sie die Kulturen mit 50 Joule pro Quadratmeter und überführen sie sofort in einen sterilen Vorwärmkolben und stellen sie wieder in den schüttelnden 37 Grad Celsius heißen Inkubator.

Für die Dauer des Experiments erzeugt diese Dosis durchschnittlich ein Cyclobutan-Perindimer pro 4,5 Kilobasen einzelsträngiger DNA für jeden zu untersuchenden Zeitpunkt. Pipettieren Sie ein Aliquot von 0,75 Millilitern der Kultur in 0,75 Milliliter eiskaltes Netz 30. Das Puffernetz 30 dient als Stopppuffer, der verhindert, dass die Replikation und die Reparatur der Nukleotidexzision fortgesetzt werden.

Nach Zugabe des Stopppuffers kann die Probe bis zum Ende des Zeitverlaufs auf Eis gehalten werden. Nach dem Zeitverlauf jede Probe pelleten und resuspendieren Sie die Pellets. In 150 Mikrolitern Lysepuffer lyzieren die Zellen bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten ohne Rühren.

Da die Replikation von Strukturen mit Einzelstrangregionen oder Verzweigungspunkten anfälliger für Scherungen ist, schneiden Sie die Pipettenspitzen mit einer Rasierklinge ab, um den Mund breiter zu machen und die Scherkräfte zu minimieren. Im Allgemeinen sollte das Pipettieren und Rühren auf ein Minimum beschränkt werden, bis die DNA nach der Lyse mit Restriktionsenzymen verdaut wurde, Proteinase K und Sarcas-Zellen hinzufügen und die Inkubation eine Stunde lang fortsetzen lassen. Dies dient dazu, DNA-Fragmente freizusetzen, die mit dem Protein assoziiert sind.

Da aktiv replizierende DNA oft an Protein- oder Membrankomplexe gebunden ist, trägt dies dazu bei, die Ausbeute an Replikationsfragmenten zu erhöhen. Nach einer Stunde extrahieren Sie die Proben, indem Sie jeder Probe zwei Volumen Phenol hinzufügen und die Röhrchen fünf Minuten lang vorsichtig umdrehen. Fügen Sie dann zwei Volumina Chloroform, Isoamyl und Alkohol hinzu und drehen Sie die Röhrchen vorsichtig für weitere fünf Minuten um.

Zentrifugieren Sie anschließend die Proben fünf Minuten lang bei 14.000 U/min in einer Mikrozentrifuge und überführen Sie die obere wässrige Phase jeder Probe in ein frisches Röhrchen. Fügen Sie dann vier Volumen Chloroform-ISO-Alkohol hinzu und drehen Sie die Röhrchen erneut fünf Minuten lang vorsichtig um. Zentrifugieren Sie die Proben erneut fünf Minuten lang bei 14.000 U/min.

Legen Sie eine Dialysemembran auf 250 Milliliter 0,1 xte in ein Becherglas und geben Sie 100 Mikroliter jeder Probe auf die Membran. Lassen Sie die Proben nach der Dialyse eine Stunde lang dialysieren. Geben Sie 80 Mikroliter jeder Probe in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen mit 20 Mikrolitern Enzymmischung.

Verdauen Sie die Proben über Nacht bei 37 Grad Celsius. PV zwei linearisiert das Plasmid direkt stromabwärts des Replikationsursprungs. Vor dem Laden des Agros-Gels werden 100 Mikroliter Chloroform und 20 Mikroliter sechsfacher Brom-haltiger Farbstoff hinzugefügt.

Phenolblau und Xylolcyan in jede Probe und Mischung aus Chloroform entfernen alle verbleibenden PV two, die an DNA-Enden gebunden sind. Beginnen Sie mit der zweidimensionalen Arous-Gel-Analyse, indem Sie die eingeschränkten DNA-Proben durch die erste Dimension führen. Laden Sie zuerst einen Lambda Hinterrad Marker in drei Größen in die erste Spur eines zuvor vorbereiteten 0,4%Agros Gels in einem XTBE.

Laden Sie dann 40 Mikroliter der wässrigen Phase, die den Ladefarbstoff für jede Probe enthält, und überspringen Sie die Spuren, um das Schneiden des Gels zu erleichtern. Führen Sie nach der Elektrophorese die erste Dimension bei einem Volt pro Zentimeter für etwa 12 bis 15 Stunden durch. Das AGROS-Gel mit niedriger Spannung und niedrigem Anteil dient dazu, die DNA-Fragmente in erster Linie nach Größe zu trennen.

Nachdem die erste Dimension abgelaufen ist, schneide mit einem großen Metzgermesser die erste Spur mit dem Lambda-Hinterdrei-Marker aus und beize sie mit Aheriumbromid. Für die zweite Dimension schneiden Sie die Gelbahnen mit dem großen Metzgermesser heraus, wobei Sie den Lambda Hind Three-Marker als Hilfszuschnitt verwenden, und verwerfen Sie den Bereich darunter, in dem das linearisierte Plasmid auf jeder Bahn ausgeführt werden soll. Um die zweite Dimension zu casten, platzieren Sie jede Scheibe horizontal über die Oberseite eines leeren Gelgießers.

Bereiten Sie eine Lösung von 1%AROS in einem XTBE vor und kühlen Sie es auf 55 Grad Celsius ab. Gießen Sie nach dem Abkühlen die Gellösung hinein, um die zweite Dimension zu gießen, und achten Sie darauf, dass die Gelscheiben vollständig bedeckt sind. Es ist wichtig, dass die Scheiben gleichmäßig ausgerichtet und der Rizinus waagerecht ist, bevor Sie das Gel einfüllen.

Sobald das Gel ausgehärtet ist, führen Sie die zweite Dimension, fünfeinhalb bis sieben Stunden bei 6,5 Vol. pro Zentimeter in einer Elektrophoreseeinheit durch, die es dem Puffer ermöglicht, das Hochspannungs- und hochprozentige Agros-Gel zu rezirkulieren, das die DNA-Fragmente sowohl aufgrund ihrer Form als auch ihrer Größe effektiv trennt. Nichtlineare Formen durchlaufen nach der Elektrophorese langsamer die zweite Dimension. Spülen Sie das Gel einmal in Wasser ab und waschen Sie es dann zweimal in 400 Millilitern 0,25 molare Salzsäure für 15 Minuten unter leichtem Rühren.

Die sauren Waschungen dienen dazu, die DNA-Moleküle teilweise in kleinere Fragmente zu zerschneiden, die während der südlichen Analyse effizienter übertragen werden und aufgrund der großen Größe und der ungewöhnlichen Form der DNA-Replikationszwischenprodukte notwendig sind. Um das Gel für den Alkalitransfer vorzubereiten, spülen Sie das Gel erneut in Wasser aus und waschen Sie es dann zweimal in 400 Millilitern 0,4 molar Natriumhydroxid für 30 Minuten. Die DNA in den Gelen wird dann unter Verwendung eines Abwärtsalkalitransfersystems mit 0,4 molaren Natriumhydroxid, wie im schriftlichen Teil dieses Verfahrens beschrieben, auf eine n-plus-Nylonmembran mit hoher Bindung übertragen. Lassen Sie den DNA-Transfer für sechs bis 12 Stunden nach dem DNA-Transfer mit Sondenhybridisierung fortsetzen, wie in dem schriftlichen Protokoll beschrieben.

Nachdem die Membran sondiert und gewaschen wurde, legen Sie die Membran auf ein Papiertuch, bis die Flüssigkeit sichtbar verschwunden ist. Wickeln Sie dann die Membran in Polyvinylchlorid-Plastikfolie ein und setzen Sie sie einem Phospho-Imager-Bildschirm aus. Schließlich kann die Radioaktivität mit Hilfe eines Sturms 8 40 und des zugehörigen Bildquants visualisiert und quantifiziert werden.

Das Migrationsmuster von PV zwei verdauten PBR 3 22 Plasmiden, das durch 2D-Aros-Gel-Analyse beobachtet wurde, ist grafisch dargestellt. Nicht replizierende lineare Plasmide verlaufen als lineare 4,4 KB große Fragmente, die Plasmide in Form von Y-förmigen Strukturen replizieren, die aufgrund ihrer größeren Größe und nichtlinearen Form langsamer wandern als die nicht replizierenden Fragmente. Dieses Migrationsmuster bildet einen Bogen, der sich vom linearen Bereich in Richtung der gut folgenden UV-Bestrahlung erstreckt.

Doppelte Y- oder X-förmige Moleküle werden im Zapfenbereich beobachtet und wandern langsamer als der Bogen der Y-förmigen Moleküle. Ein Beispiel für die südliche Analyse des mit P 32 untersuchten 2D-Gels, markiert PBR 3 22, ist für Zellen unmittelbar nach der UV-Bestrahlung und 15 Minuten nach der UV-Bestrahlung unmittelbar nach der UV-Bestrahlung gezeigt. Etwa 1 % der gesamten Plasma-DNA befindet sich im Y-Lichtbogen, wenn die Zellen nach einer Bestrahlung in exponentieller Phase schnell wachsen.

Eine vorübergehende Zunahme von YS-förmigen Molekülen wird beobachtet, da sich blockierte Replikationsgabeln an geschädigten Stellen ansammeln. Die L-förmigen Replikationsintermedien akkumulieren ebenfalls vorübergehend, akkumulieren und bestehen bis zu einem Zeitpunkt, der mit dem Zeitpunkt der Reparatur der Läsionen korreliert. Wir haben Ihnen gerade gezeigt, wie Sie DNA-Reparatur-Zwischenprodukte mit Hilfe der zweidimensionalen Gelelektrophorese visualisieren können.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich der Scherkräfte bewusst zu sein, die die Ausbeute verringern können, und sanft mit allen Proben und Gelen umzugehen. Das war's also. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei Ihren Experimenten.