Screening für Funktionelle nichtkodierenden genetischen Varianten Mit elektrophoretische Mobilitäts-Shift-Assay (EMSA) und DNA-Affinitätspräzipitation Assay (DAPA)

Das übergeordnete Ziel dieser experimentellen Strategie ist es, die Funktionalität von krankheitsassoziierten nicht-kodierenden Varianten zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen in der Genomik zu beantworten, z. B. wie genetische Varianten, die die Aminosäuresequenz nicht wirklich verändern, dennoch zum Krankheitsphänotyp beitragen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen optimierten Prozess zur Bewertung der genetischen Varianz für die Funktionsaktivität bietet und Einblicke in die betroffenen regulatorischen Proteine und Signalwege gibt.

Diese Technik kann bei der Untersuchung jeder Krankheit mit einer möglichen kausalen Variante von Vorteil sein. Denn das Verfahren zur Analyse dieser Varianten ist universell, unabhängig vom untersuchten Phänotyp. Obwohl diese Methode Einblicke in menschliche Krankheiten geben kann, kann sie auch auf Mutationen in jedem Organismus angewendet werden.

In diesem Experiment werden Kernlysate aus B-lymphoblastoiden Zellen hergestellt, dieses Verfahren kann jedoch auf die meisten Zelllinien angewendet werden. Nachdem Sie die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt haben, schleudern Sie die gewünschte Anzahl von Zellen für die Lyse herunter. Aspirieren Sie das Medium, fügen Sie 10 Milliliter eiskaltes PBS hinzu und schleudern Sie die Zellen wieder herunter.

Waschen Sie die Zellen ein zweites Mal mit PBS und entfernen Sie das PBS nach dem Schleudern. Resuspendieren Sie den Zellgaumen in eiskaltem PBS mit einem Milliliter PBS pro 10 bis sieben Zellen. Aliquotieren Sie einen Milliliter der Zellsuspension in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen, so dass jedes Röhrchen 10 bis siebte Zellen in PBS enthält.

Zwei Minuten zentrifugieren und das PBS absaugen. Zu einem Arbeitsbestand von CE-Puffer, einem millimolaren Dithiothreitol oder DTT, einem 1X-Phosphatase-Inhibitor und 0,5 millimolaren Phenylmethansulfonylfluorid oder PMSF hinzufügen. Resuspendieren Sie jede Zellpalette mit 400 Mikrolitern dieses Puffers und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang auf Eis.

Geben Sie 25 Mikroliter 10%Nonidet P-40 in jedes Mikrozentrifugenröhrchen und mischen Sie durch Pipettieren. Zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei vier Grad Celsius und maximaler Geschwindigkeit. Dekantieren und entsorgen Sie den Überstand.

Als nächstes fügen Sie einem Arbeitsstock NE-Puffer, ein millimolares DTT, einen 1X-Phosphoaase-Inhibitor und einen millimolaren PMSF hinzu. Resuspendieren Sie jeden Zellgaumen mit 30 Mikrolitern dieses Puffers und mischen Sie es durch Vortexen. Inkubieren Sie bei 4 Grad Celsius in einem Röhrchenrotator für 10 Minuten.

Zwei Minuten zentrifugieren. Sammle den klaren Überstand, bei dem es sich um das Kernlysat handelt. Aliquotieren Sie das Kernlysat vor der Lagerung bei minus 80 Grad Celsius, um mehrere Gefrier-Auftauzyklen zu vermeiden, die das Protein abbauen könnten.

Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie einen 50 nanomolaren Arbeitsstock des Oligonukleotids vorbereiten, wie im Protokolltext beschrieben. Lege die Oligos fünf Minuten lang bei 90 Grad Celsius in einen Hitzeblock. Schalten Sie nach fünf Minuten den Heizblock aus und lassen Sie die Oligos vor der Verwendung mindestens eine Stunde lang langsam auf Raumtemperatur abkühlen.

Bereiten Sie als Nächstes den elektrophoretischen Mobilitäts-Shift-Assay oder das EMSA-Gel vor. Nehmen Sie den Objektträger aus einem vorgefertigten Gel mit sechs Prozent Tris-Borat-EDTA oder FSME-Gel und spülen Sie ihn mehrmals unter deionisiertem Wasser ab, um den Puffer aus den Vertiefungen zu entfernen. Bauen Sie das Gelelektrophoresegerät zusammen und prüfen Sie, ob es undicht ist, indem Sie die innere Kammer mit 0,5x TBE-Puffer füllen.

Wenn kein Puffer in die äußere Kammer eindringt, füllen Sie die äußere Kammer etwa zu zwei Dritteln. Lassen Sie das Gel 60 Minuten lang bei 100 Volt vorlaufen. Wenn der Vorlauf abgeschlossen ist, spülen Sie jede Vertiefung mit 200 Mikrolitern 0,5-fachem TBE-Puffer.

Bereiten Sie einen verbindlichen Puffer-Mastermix vor. Mischen Sie in einem Mikrozentrifugenröhrchen diese Reagenzien, die allen Reaktionen gemeinsam sind. 10X Bindungspuffer, DTT-Polysorbat, Poly(dI-dC) und DNA von Lachsspermien.

Um die EMSA-Reaktionen in Gang zu setzen, geben Sie nukleasefreies Wasser in jedes Mikrozentrifugenröhrchen, so dass das endgültige Volumen nach Zugabe aller Reagenzien 20 Mikroliter beträgt. Geben Sie die entsprechende Menge Mastermix in jedes Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie acht Mikrogramm Kernlysat in die entsprechenden Mikrozentrifugenröhrchen.

Röhrchen, die das Oligo ohne Kernextrakt enthalten, sind als Negativkontrollen beizufügen. Geben Sie 50 Femtomol Oligo in die entsprechenden Mikrozentrifugenröhrchen und schnippen Sie zum Mischen. Schleudern Sie den Inhalt kurz bis zum Boden der Tube.

Inkubieren Sie alle Röhrchen 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Geben Sie als Nächstes zwei Mikroliter 10X orangefarbenen Ladefarbstoff in jedes Mikrozentrifugenröhrchen. Pipettieren Sie zum Mischen auf und ab.

Laden Sie die Proben in das sechsprozentige TBE-Gel vor dem Lauf, indem Sie zum Mischen auf und ab pipettieren und dann jede Probe in eine separate Vertiefung ausstoßen. Lassen Sie das Gel etwa 60 bis 75 Minuten lang bei 80 Volt laufen, bis der orangefarbene Farbstoff zu zwei Dritteln bis drei Vierteln des Gels gewandert ist. Wenn der Lauf abgeschlossen ist, hebeln Sie die Plastikkassette mit einem Gelmesser auf.

Nehmen Sie das Gel aus der Kassette und geben Sie es in ein Gefäß mit 0,5 Prozent FSME-Puffer, damit es nicht austrocknet. Legen Sie das Gel auf die Oberfläche eines Infrarot- und Chemilumineszenz-Bildgebungssystems. Beseitigen Sie alle Blasen oder Verunreinigungen, die das Bild stören.

Scannen Sie das Gel mit der Software des Scansystems, wie im Protokolltext beschrieben. Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie ein Arbeitsmaterial aus fünf mikromolaren Oligos vor, wie im Protokolltext beschrieben. Lege die Oligos für fünf Minuten bei 95 Grad Celsius in einen Hitzeblock.

Schalten Sie nach fünf Minuten den Heizblock aus und lassen Sie die Oligos vor der Verwendung langsam auf Raumtemperatur abkühlen. Erwärmen Sie die folgenden Puffer auf Raumtemperatur: Bindungspuffer, Waschpuffer mit niedriger Stringenz, Waschpuffer mit hoher Stringenz und Elutionspuffer. Bereiten Sie die Bindemittel für jede Variante vor.

Mischen Sie ein Volumen Kernlysat mit zwei Volumen Bindungspuffer. Fügen Sie 1X Phosphatase-Inhibitor, 0,5 millimolare PMSF und 1X Bindungsverstärker hinzu. Fügen Sie 10 Mikroliter von fünf mikromolaren biotinylierten Capture-DNA zu jeder Bindungsmischung hinzu.

Mixen, indem man die Tube mehrmals schnippt. Die Bindungsmischungen werden 20 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Fügen Sie als Nächstes 100 Mikroliter Streptavidin MicroBeads zu jeder Bindungsmischung hinzu.

10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Für jede zu testende Oligosonde wird eine Bindungssäule in den Magnetseparator eingesetzt. Stellen Sie sicher, dass die Säulen mit der Oligovariante beschriftet sind, die in der Bindungsmischung verwendet wurde.

Platzieren Sie ein Mikrozentrifugenröhrchen direkt unter jeder Bindungssäule und tragen Sie 100 Mikroliter Bindungspuffer auf, um die Säule zu spülen. Pipettieren Sie den Inhalt jeder Bindungsmischung in separate Spalten. Lassen Sie die Flüssigkeit vollständig durch die Säule in das Mikrozentrifugenröhrchen fließen.

Tragen Sie 100 Mikroliter Waschpuffer mit geringer Stringenz auf die Säule auf und warten Sie, bis der Säulenbehälter leer ist. Tragen Sie erneut 100 Mikroliter Waschpuffer mit geringer Stringenz auf die Säule auf. Tragen Sie 100 Mikroliter Waschpuffer mit hoher Stringenz auf die Säule auf und warten Sie, bis der Säulenbehälter leer ist.

Tragen Sie erneut 100 Mikroliter Waschpuffer mit hoher Stringenz auf die Säule auf. Geben Sie 30 Mikroliter nativen Elutionspuffer in die Säule und lassen Sie sie fünf Minuten stehen. Fügen Sie schließlich weitere 50 Mikroliter nativen Elutionspuffer hinzu, um die gebundenen Transkriptionsfaktoren zu eluieren.

Um die Reproduzierbarkeit der EMSA-Ergebnisse und die Folgen von Gefrier-Auftau-Zyklen zu untersuchen, wurden Oligos, die das Referenz- oder Nicht-Referenz-Allel einer genetischen Variante enthielten, verwendet, um die gleiche Zubereitung von B-Lymphozyten-Kernextrakt nach mehreren Zyklen des Einfrierens und Auftauens zu untersuchen. Der blaue Pfeil zeigt die freie Sonde an. Die Bindung der Transkriptionsfaktoren an das Oligo ist als Bande in der oberen Hälfte des Gels zu sehen, die durch den roten Pfeil gekennzeichnet ist.

Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Einfrieren und Auftauen dieses speziellen Kernextrakts bis zu fünfmal anscheinend keinen Einfluss auf die Integrität der Proteine hat. Es ist auch wichtig, das Signal-Rausch-Verhältnis für die EMSA zu optimieren. Verschiedene Konzentrationen von Oligos wurden verwendet, um ein einzelnes Präparat des Kernlysats zu untersuchen.

Es wurde eine Zunahme der Intensität der Bande auf bis zu 100 Femtomol Oligo beobachtet. Repräsentative Ergebnisse aus einer Studie zu einem Lupus-assoziierten Risikoallel sind hier dargestellt. Der Transkriptionsfaktor STAT 1 wurde zunächst durch DAPA identifiziert, gefolgt von einer Proteomanalyse.

Ein DAPA-Western-Blot bestätigte dann die Identität von STAT 1 und die höhere Bindung der phosphorylierten Form von STAT 1 an das Lupus-Risiko-Oligo. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Techniken wie Massenspektrometrie und Western Blot durchgeführt werden. Dies wird uns helfen, das regulatorische Protein zu identifizieren, das eine allelabhängige Bindung zeigt.

Reporter-Assays wie Luciferase können auch verwendet werden, um Veränderungen in der Genexpression in Abhängigkeit vom Allel zu untersuchen.