In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die Stoia-Metrik und die strukturellen Informationen über das Protein zu bestimmen. Alle Bandkomplexe, die lebende biologische Zellen exprimieren, Hefezellen, sind gentechnisch so verändert, dass sie die interessierenden Proteine exprimieren, die entweder an eine Donor- oder eine Akzeptor-Fluoreszenzsonde gebunden sind. Donorsonden können direkt mit einem Laser angeregt werden.

Während Akzeptoren nur durch eine Energieübertragung von einem nahe gelegenen angeregten Donor angeregt werden können, werden die Zellen dem Licht eines gepulsten Nahinfrarotlasers ausgesetzt. Die von den Sonden inseminierende Fluoreszenz wird durch ein Transmissionsgitter in ihre spektralen Bestandteile getrennt und auf die Oberfläche eines elektronenvermehrenden CCD-Arrays projiziert. Daher werden vollständige Fluoreszenzspektren von einzelnen, alle Bänder für jede Position in der Probe erhalten.

Das spektrale Profil der detektierten Fluoreszenz hängt von der spezifischen Wechselwirkung der interessierenden Proteine ab. Die Daten werden analysiert, um für jedes Bildpixel einer Scanzelle die getrennten Emissionen der Donor- und Akzeptorsonde zu bestimmen. Die Effizienz der Energieübertragung wird an jedem Bildpixel bestimmt, und dann werden die Pixel entsprechend ihrer Bundeffizienz und ihrem Histogramm gebogen.

Die Histogramm-Interpretation ermöglicht die in vivo Bestimmung von Proteinen, komplexer Größe und Konfiguration. Hallo, mein Name ist Michael Stoneman von der Riku Research Group an der University of Wisconsin Milwaukee. Mein Name ist Singh.

Ich komme von Rikus Lab in Wisconsin, Milwaukee. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die vollständigen Emissionsprofile von Hunderten aller Bandkomplexe innerhalb einer Zelle mit einem vollständigen Scan der Zelle erhalten werden. Typischerweise erfordern die meisten Fluoreszenzmikroskopie-Methoden, dass die interessierende Zelle mehrmals gescannt wird, um genügend spektrale Informationen zu sammeln, um die Bundeffizienz in verschiedenen Bereichen innerhalb der Zelle zu bestimmen.

Diffusionsbiochemische Reaktionen können jedoch die molekulare Zusammensetzung dieser interessierenden Regionen verändern und dadurch die im Scan des Bildes erhaltenen Informationen einschränken. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen bei der Untersuchung von Protein- und Proteininteraktionen in lebenden Zellen zu beantworten, wie z. B. wie groß ist der Schaden für Oligomere? In welcher Phase des Proteinlebenszyklus farmen die Oligomere und welche Rolle spielt das Oligomer dieses Proteins für die zelluläre Funktion?

Das spektral aufgelöste Zwei-Fotomikroskop sammelt spektrale Informationen über die Olima-Komplexe in der Bildzelle, indem es den Fokus des Anregungsstrahls über die interessierende Probe an einer Reihe von Stellen abtastet. Ein Paar orthogonaler Abtastspiegel wird verwendet, um den Fokus des Laserstrahls über die Probe in zwei verschiedene Richtungen zu verschieben. Die Bewegung der Abtastspiegel ist computergesteuert und synchronisiert mit der Extraktion der Fluoreszenzintensitätsdaten von der CCD-Kamera, aus den Zeilenscan können räumliche Karten der Fluoreszenzintensität rekonstruiert werden, die einer bestimmten Wellenlänge des Lichts entsprechen.

Karten der Röntgenfluoreszenzintensität genau zu rekonstruieren und die tatsächliche Wellenlänge zu berechnen, die jeder dieser Karten entspricht, muss das Zeilenscan-Protokoll mit Fluoreszeinlösung kalibriert werden. Um den Kalibrierungsvorgang zu starten, senden Sie an das Anregungsspektrum mit einer Wellenlänge von 800 Nanometern, was dem Doppelten der maximalen Anregungswellenlänge des Donor-Tags GFP entspricht, zwei zwei zum Senden an das Anregungsspektrum, verschieben Sie das Prisma, das sich im Laserresonator befindet, um die Gruppengeschwindigkeitsdispersion mit dem Computerprogramm zu ändern, mit dem die Kamera verbunden ist. Senden Sie einen Befehl an den CCD-Chip, um die Temperatur des CCD-Chips auf die niedrigste erreichbare Temperatur zu senken.

Um dunkles Rauschen zu reduzieren. Pipettieren Sie 10 Mikroliter Fluoreszeinlösung auf eine Objektträgerabdeckung mit Deckglas, so dass eine dünne Schicht der Probe gleichmäßig im Bereich zwischen dem Deckglas und dem Objektträger verteilt ist, und geben Sie einen kleinen Tropfen Tauchöl auf die Oberfläche des Deckglases. Befestigen Sie nun das Mikroskop, schieben Sie auf den XY-, Z-Verschiebungstisch und verschieben Sie den Objektträger und den Tisch in Richtung der optischen Achse. Durch manuelles Einstellen des Linearantriebs verschieben Sie den Objektträger, bis das Mikroskopobjektiv mit dem Tropfen Immersionsöl in Kontakt kommt, schalten Sie die Kamera in einen Videomodus der Datenerfassung, so dass das einfallende Licht, das auf das CCD-Array trifft, in Echtzeit auf dem Computerbildschirm angezeigt wird.

Schalten Sie alle Umgebungslichter aus, um die am CCD-Array erkannten Hintergrundgeräusche zu verringern. Stellen Sie das Mikrometer, das den Translationstisch steuert, langsam in Richtung der optischen Achse ein, um die Probe in den Brennpunkt des Laserstrahls zu bringen. Wenn die Fluoreszeinprobe scharf ist, erscheint die Emission als scharfe Linie auf dem CCD-Array.

Laden Sie die Auslesung der Pixelintensitäten vom CCD-Array auf den Computer herunter. Messen Sie die Pixelintensität in Abhängigkeit von der Position auf dem CCD-Array, indem Sie die heruntergeladene Matrix der Intensitätswerte in Bild J öffnen und eine Linie durch den Fluoreszenzbereich ziehen. Verwenden Sie den Befehl image day.

Analysieren Sie das Diagrammprofil, um ein Diagramm zu erstellen, das das Emissionsspektrum der Fluoreszeinprobe veranschaulicht. Passen Sie den inkrementellen Parameter des Spiegels an, der die Bewegung des Lasers steuert. Fokussierung in Y-Richtung, so dass benachbarte y-Positionen innerhalb der Probe zu einer Bewegung des Peaks der Fluoreszenzspektren um genau ein Pixel entlang der spektralen Dimension auf dem CCD-Array führen.

Um dies zu überwachen, laden Sie die Intensität der Fluoreszeinspektren für zwei verschiedene Y-Positionen in der Probe herunter. Öffnen Sie dann die Intensitätsbilder mit Bild J und suchen Sie die Peak-Pixelposition für jedes der Fluoreszenzspektren. Wenn Sie den Bild-J-Cursor bei geöffnetem Verschluss des CCD lassen, scannen Sie den Laserfokus über die Probe in X-Richtung.

Das Licht, das von jedem Voxel entlang der Scanzeile emittiert wird, sollte am Ende jedes Zeilenscans auf das CCD-Array fallen, die Daten aus dem CCD-Array speichern, die für diesen Zeilenscan erhalten wurden, und dann die Pixel des CCD-Arrays löschen. Verschieben Sie die Position des Lasers. Fokussieren Sie in Y-Richtung um den zuvor ermittelten Betrag.

Scannen Sie dann den Laserstrahl in X-Richtung über die Probe. Auch hier wird der Verschluss des CCD offen gelassen, um die Daten zu speichern. Wiederholen Sie diesen Zeilenscanvorgang, bis ein physischer Bereich, der etwa 50 % größer ist als die Abmessungen einer einzelnen biologischen Zelle, mit Laserlicht beleuchtet wurde.

Die Beziehung zwischen der Zeilennummer eines bestimmten Zeilenbildes und der Wellenlänge sollte verwendet werden, um die Bilder zu rekonstruieren und mehrere Gesichtskarten mit Fluoreszenzintensitäten bei verschiedenen Wellenlängen zu erhalten. Um das fluoreszierende Einreichungsbild meiner Ex-Frau für eine bestimmte Wellenlänge zu erhalten, suchen Sie die Zeilennummer auf dem Bild, das aus dem ersten Zeilenscan erhalten wurde, das dieser Wellenlänge entspricht. Dann entspricht die benachbarte Zeile des nachfolgenden Zeilenbildes der nächsten Zeile des Fluoreszenzemissionsbildes.

Für diese spezielle Wellenlänge stapeln Sie alle Bildreihen, die dieser Wellenlänge entsprechen, um die räumlichen Karten der XY-Fluoreszenzintensität der Probe bei dieser Wellenlänge zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle anderen erhältlichen Wellenlängen, um Daten über Ihre Proben zu sammeln. Nehmen Sie zuerst die Platten mit den umgewandelten Hefekolonien aus dem Inkubator.

Es sollte mindestens drei Arten von transformierten Zellen geben. Zellen, die die Proteine von Interesse exprimieren, die mit beiden Arten von Fluoreszenzsonden markiert sind. Zellen, die nur Proteine exprimieren, die mit den Donor-Fluoreszenzsonden markiert sind, und Zellen, die nur Proteine exprimieren, die mit den Akzeptor-Fluoreszenzsonden markiert sind.

Geben Sie 100 Mikroliter 100 millimolares Kaliumchlorid in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Kratzen Sie dann mit einer Mikropipettenspitze drei bis fünf Hefekolonien von der Zellplatte ab, die Proteine exprimieren, die sowohl mit Donator- als auch mit Ausnahme einer Fluoreszenzsonde markiert sind, und impfen Sie das 100 millimolare Kaliumchlorid. Entfernen Sie mit diesen Zellen 10 Mikroliter der Zellsuspension und geben Sie sie auf ein frisches Mikroskop ab. Gleiten.

Decken Sie das Tröpfchen mit einem Deckglas ab und geben Sie ein Tröpfchen Öl auf die Oberfläche des Deckglases. Schließen Sie anschließend manuell den Verschluss im Weg des Laserstrahls, um zu verhindern, dass das Laserlicht das Mikroskopobjektiv erreicht. Befestigen Sie den Objektträger am XY-, Z-Translationstisch und verschieben Sie den Objektträger in Richtung der optischen Achse, bis das Mikroskopobjektiv mit dem Tropfen Immersionsöl in Berührung kommt.

Schalten Sie nun die Weitfeldlichtbeleuchtung ein und gehen Sie zur Kamera. Videomodus der Datenerfassung. Das Weitfeldbild der Probe wird aufgrund des Vorhandenseins des Transmissionsgitters im Emissionspfad stark verschwommen.

Platzieren Sie daher einen Bandpassfilter mit einer kleinen vollen Breite von maximal der Hälfte im Strahlengang vor dem Transmissionsgitter. Verschieben Sie den Translationstisch langsam in Richtung der optischen Achse, während Sie das Bild der Zellen auf dem Kamerabildschirm betrachten, bis die Zellen scharf gestellt werden. Verschieben Sie den Tisch entweder in X- oder Y-Richtung, um eine einzelne Zelle an die Stelle des Laserstrahlfokus zu bringen.

Schalten Sie die Weitfeldbeleuchtungsquelle aus, und entfernen Sie den Bandpfadfilter aus dem Emissionspfad. Entsperren Sie den Laserstrahl für kurze Zeit, während Sie gleichzeitig das am CCD-Array empfangene Signal anzeigen. Wenn während der Zeit, in der der Laserstrahl auf die Zelle trifft, ein Fluoreszenzsignal auf dem CCD-Array erkannt wird, führen Sie einen vollständigen Fluoreszenzdatenerfassungscan dieser Zelle durch.

Es ist wichtig, die gleichen Scanparameter zu verwenden, insbesondere die Anzahl der Zeilen und die Gründe für die Inkrementierung, wie sie in dem zuvor gezeigten Kalibrierungsverfahren bestimmt wurden. Wiederholen Sie den Prozess der Zellortungs- und Fluoreszenzdatenerfassung für eine große Anzahl von Zellen, die Proteine exprimieren, die sowohl an Donor-Tags als auch an Akzeptor-Tags gebunden sind. Nachdem genügend Fluoreszenzbilder von Zellen gesammelt wurden, die Proteine exprimieren, die mit beiden Rezeptoren markiert sind, wiederholen Sie den gesamten Prozess für beide Zellen, die nur Proteine exprimieren, die mit den Donorfluoreszenzsonden markiert sind, und für Zellen, die nur Proteine exprimieren, die mit den Akzeptorfluoreszenzsonden markiert sind.

Rekonstruieren Sie abschließend alle Scans, um eine spektrale Auflösung zu erhalten. Räumliche XY-Fluoreszenz-Intensitätskarten für jeden Datensatz unter Verwendung des zuvor beschriebenen Verfahrens, das in diesen drei Abbildungen dargestellt ist, sind die resultierenden räumlichen Karten, die aus spektral aufgelösten zwei Photonenmikroskopie-Messungen berechnet wurden, die an einer Hefezelle durchgeführt wurden, die den sterilen Alpha-Faktor-Rezeptor exprimiert. Zweidimensionale Karten von Donor- und Akzeptorsignalen wurden durch die Analyse der spektralen Emissionsprofile erhalten, die von jedem Ort der Zelle erhalten wurden.

Fluoreszenzintensitäten werden entsprechend ihrer Werte mit Falschfarben versehen und die Skala wird als Einschub dargestellt. Eine zweidimensionale Karte der scheinbaren Bundeffizienzen wurde dann unter Verwendung der KDA- und KAD-Bilder unter Verwendung der Werte berechnet, die aus der Karte der scheinbaren Bundeffizienz der gerade gezeigten Zelle extrahiert wurden. Es wurde ein Histogrammdiagramm erstellt. Die gemessenen EAPP-Werte der Zelle werden durch Kreise dargestellt.

Die rote durchgezogene Linie stellt die beste Anpassung an die gemessenen Daten dar, indem sie die Summe der einzelnen Kalziumfunktionen verwendet, die durch durchgezogene grüne Linien dargestellt werden. Die Analyse des Histogramms, das im Protokolltext beschrieben ist, bestätigt, dass der sterile Zwei-Alpha-Faktor-Rezeptor-All-Ligament-Komplex in vivo die Form eines RBA-förmigen Tetramers annimmt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 12 Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Während dieses Experiments ist es wichtig, die Leistung der Anregungsquelle gering zu halten. Es ist wichtig, eine mehrfache Erregung des Spenders durch einen einzigen Impuls zu vermeiden.