Name: In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-19T17:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 26 s
Description: Lernen Sie die spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Quantifizierung von G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen in lebenden Zellen. Diese Methode liefert stoichiometrische Informationen über Oligomerkomplexe.

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Diese Arbeit wurde von der UW-Milwaukee Forschung Wachstumsinitiative, die Wisconsin-Institut für Biomedizinische und Health Technologies, und der Bradley-Stiftung unterstützt.

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In diesem Vortrag dargestellt wir, wie man die Größe und strukturelle Informationen über ein Protein-Oligomer-Komplex in vivo zu bestimmen. Während die vorgestellten Daten aus einer bestimmten Membran-Rezeptor (dh Ste2p) in Hefe-Zellen exprimiert erhalten wurde, ist die Methode, allumfassend, dass sie auf jede Art von Protein in jeder Art von Zelle, die einzige Bedingung zum Ausdruck angewendet werden kann, dass die Proteine sind mit den entsprechenden fluoreszierenden Markern gekennzeichnet. Zukünftige Änderun...

<table><tbody><tr><td>Pepton</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenglykol 4000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>Hefestickstoffbase ohne (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; und Aminosäuren</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0335-15-9</td><td></td></tr><tr><td>Synthetische Hefe-Minimalmedium-Zusätze</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td></td></tr><tr><td>D-Glukose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher Scientific</td><td>S70210</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>A702-500</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Acros Organics</td><td>424090010</td><td></td></tr><tr><td>Leucin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP385</td><td></td></tr><tr><td>His</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP382</td><td></td></tr><tr><td>Plan-Achromat-Unendlich-korrigiertes 100x-Ölimmersionsobjektiv, NA=1,43</td><td>Nikon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektral aufgelöstes Zweiphotonen-Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo quantifizierung der g protein-gekoppelten rezeptor-wechselwirkungen mit spektral aufgelöste zwei-photonen-mikroskopie

In vivo Quantification of G Protein Coupled Receptor Interactions using Spectrally Resolved Two-photon Microscopy

Die Untersuchung von Protein-Interaktionen in lebenden Zellen ist ein wichtiger Bereich der Forschung, weil die Informationen sowohl Vorteile industrielle Anwendungen sowie Erhöhungen fundamentale biologische Wissen angesammelt. Förster (Fluorescence) Resonance Energy Transfer (FRET) zwischen einem Donor-Molekül in einem elektronisch angeregten Zustand und einem nahe gelegenen Acceptormolekül wurde häufig für Untersuchungen von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen eingesetzt. Die Proteine ​​von Interesse sind mit zwei verschiedenen Arten von fluoreszierenden Sonden markiert und ausgedrückt in biologischen Zellen. Die fluoreszierenden Sonden werden dann angeregt, in der Regel mit Hilfe von Laserlicht und die spektralen Eigenschaften der Fluoreszenzemission, die aus der fluoreszierenden Sonden gesammelt und analysiert. Informationen über den Grad der Protein-Wechselwirkungen in der spektralen Emission Daten eingebettet. In der Regel muss die Zelle mehrmals gescannt werden, um genügend spektralen Informationen sammeln, um genau zu quantifizieren das Ausmaß der Protein-Interaktionen für jede Region von Interesse innerhalb der Zelle. Allerdings kann die molekulare Zusammensetzung dieser Regionen im Laufe des Erwerbs-Prozess zu ändern, wodurch die räumliche Bestimmung der quantitativen Werte der scheinbaren FRET Effizienzen auf durchschnittlich mehr als ganze Zellen. Durch eine spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskop, sind wir in der Lage, einen vollständigen Satz von spektral aufgelöste Bilder nach nur einem kompletten Scan Anregung der Probe von Interesse zu erhalten. Von diesem Pixel-Ebene spektralen Daten, FRET eine Karte von Effizienzen in der Zelle berechnet wird. Durch Anlegen einer einfachen Theorie von FRET in oligomeren Komplexen, die experimentell erhaltenen Verteilung der Effizienz der gesamten Zelle FRET, zeigt eine einzige spektral aufgelösten Scan stöchiometrischen und strukturelle Informationen über das Oligomer-Komplex unter-Studie. Hier beschreiben wir das Verfahren zur Herstellung von biologischen Zellen (die Hefe Saccharomyces cerevisiae) zum Ausdruck Membranrezeptoren (steriles 2 α-Faktor-Rezeptoren) mit zwei verschiedenen Arten von fluoreszierenden Sonden markiert. Darüber hinaus zeigen wir kritische Faktoren bei der Erhebung Fluoreszenz Daten unter Verwendung der spektral aufgelösten Zwei-Photonen-Mikroskopie-Systems beteiligt. Die Verwendung dieses Protokolls kann verlängert werden, um jede Art von Protein, das in einer lebenden Zelle mit einem fluoreszierenden Marker angebracht, um es zum Ausdruck gebracht werden kann, zu studieren.

Durch den Einsatz einer spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie-System sind auf Pixel-Ebene Karten von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Wirkungsgrade für Zellen, die Membran-Rezeptoren angenommen, dass sie homo-oligomeren Komplexen Form erhalten. Von der Effizienz Karten FRET, sind wir in der Lage, stöchiometrische Informationen über die Oligomer-Komplex unter-Studie zu schätzen.

In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie

Die Untersuchung von Protein-Interaktionen in lebenden Zellen ist ein wichtiger Forschungsbereich, da die gewonnenen Erkenntnisse sowohl der Industrie zugutekommen ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, stöchiometrische und strukturelle Informationen über ein Protein zu gewinnen. Alle Ligament-Komplexe, die lebende biologische Zellen enthalten, werden mithilfe genetisch veränderter Hefezellen hergestellt, die die Proteine von Interesse exprimieren, jeweils verknüpft mit einer Donor- oder Akzeptor-Fluoreszenzsonde. Donor-Sonden können direkt durch einen Laser angeregt werden.Während Akzeptoren nur durch Energieübertragung von einem benachbarten angeregten Donor angeregt werden können, werden die Zellen einem Licht eines gepulsten Nahinfrarotlasers ausgesetzt. Die Fluoreszenzstrahlung der Sonden wird durch ein Transmissionsgitter in ihre spektralen Komponenten zerlegt und auf die Oberfläche eines elektronenvervielfachenden CCD-Arrays projiziert. Daher werden für jede Position in der Probe vollständige Fluoreszenzspektren einzelner, aller Ligamente erhalten.Das spektrale Profil der detektierten Fluoreszenz hängt von der spezifischen Wechselwirkung der untersuchten Proteine ab. Die Daten werden analysiert, um für jedes Bildpixel einer gescannten Zelle die getrennten Emissionen der Donor- und Akzeptorsonden zu bestimmen. D

in-vivo-quantification-g-protein-coupled-receptor-interactions-using

Research

Forschung

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Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt, wie Bild-Protein-Protein-Interaktionen mit Hilfe eines FRET-basierten Proximity Assay.

Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Hier beschreiben wir detailliert Live Cell Imaging Verfahren zur Untersuchung Chemotaxis. Wir präsentieren fluoreszenzmikroskopische Methoden zur raum-zeitlichen Dynamik der Signalwege bei der Migration von Zellen zu überwachen. Die Messung der Signal-Ereignisse ermöglicht es uns, besser zu verstehen, wie ein GPCR-Signalisierung Netzwerk Gradienten Erfassung Lockstoffe und steuert direktionale Migration von eukaryotischen Zellen erreicht.

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Ein analytisches Werkzeug, das zelluläre Morphologie Änderungen von Dreidimensionale Fluorescence Images Quantifiziert

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um einzelne Rezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen sichtbar zu machen und zu verfolgen und dadurch die laterale Beweglichkeit der Rezeptoren, die Größe von Rezeptorkomplexen sowie die Visualisierung transienter Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu analysieren. Dieses Protokoll kann auf andere Membranproteine ausgeweitet werden.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Einfache Methoden zum Nachweis der selektiven Aktivierung von G-Proteinen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren stellen nach wie vor eine herausragende Herausforderung bei der zellulären Signalübertragung dar. Hier wurden Fӧrster Resonanzenergietransfer (FRET) Biosensoren entwickelt, indem ein GPCR an G-Proteinpeptide paarweise gebunden wurde, um Konformationsänderungen bei kontrollierten Konzentrationen in lebenden Zellen zu untersuchen.

G-Protein-selektive GPCR Konformationen gemessen mit FRET-Sensoren in einer Live Cell Suspension Fluorometer Assay

Guanosintriphosphat (GTP) -Bindung ist eine der frühesten Ereignisse in der G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) -Aktivierung. Dieses Protokoll beschreibt die pharmakologisch charakterisierende spezifische GPCR-Ligand-Wechselwirkungen durch die Überwachung der Bindung des radioaktiv markierten GTP-Analogs [ 35 S] Guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphats ([ 35 S] GTPγS) in Antwort auf einen Liganden von Interesse.

Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

Ein Verfahren wird vorgestellt, um Proteinkinase-A-Aktivitäten in kopffesten, sich verhaltenden Mäusen zu visualisieren. Ein verbesserter A-Kinase-Aktivitätsreporter, tAKAR, wird in kortikalen Neuronen ausgedrückt und für die Bildgebung durch ein Schädelfenster zugänglich gemacht. Die zweiphotonenfluoreszenzspezifische Bildmikroskopie wird verwendet, um PKA-Aktivitäten in vivo während der erzwungenen Fortbewegung zu visualisieren.

Visualisierung der Proteinkinase Eine Aktivität bei kopffixierten Behaving Mäusen mit In Vivo Zweiphotonen fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy

Morphologische Veränderungen treten in immunreagierenden Fibroblastenzellen nach aktivierung auf und fördern Veränderungen bei der Zellrekrutierung. Verwendung von 2-Photonen-Bildgebung in Verbindung mit einem gentechnisch veränderten Fibroblasten-spezifischen Protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) Mauslinie und grün fluoreszierend markiert Lipopolysaccharid-FITC, können wir hochspezifische Aufnahme von Lipopolysaccharid in dermalen Fibroblasten und morphologischen...

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Aufgrund des inhärenten niedrigen Signal-Rausch-Verhältnisses (SNR) von Fӧrster-Resonanz-Energieübertragungssensoren (FRET) war die Messung von cAMP-Signalen eine Herausforderung, insbesondere in drei räumlichen Dimensionen. Hier beschreiben wir eine hyperspektrale FRET-Bildgebungs- und Analysemethodik, die die Messung der cAMP-Verteilung in drei räumlichen Dimensionen ermöglicht.

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Lernen Sie die spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie zur Quantifizierung von G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen in lebenden Zellen. Diese Methode liefert stoichiometrische Informationen über Oligomerkomplexe.

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