Name: Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Fluoreszenz-Biomembran-Kraftsonden-Technik zur gleichzeitigen Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Calcium-Signalgebung in einzelnen T-Lymphozyten. Diese Methode ermöglicht präzise Einzelzellanalysen.

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Die Forschung im Zusammenhang mit dieser Arbeit und die Entwicklung der fBFP-Technologie im Zhu-Labor wurden durch NIH-Zuschüsse AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 und TW008753 unterstützt. Wir danken Evan Evans für die Erfindung dieses befähigenden experimentellen Werkzeugs und den Mitgliedern des Evans-Labors, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong und Ken Halvorsen, für ihre Hilfe beim Aufbau des BFP. Wir danken auch den anderen Mitgliedern des Zhu-Labors, Fang Kong, Chenghao Ge und Kaitao Li, für ihre Hilfe bei der Entwicklung der Instrumente.

<ol><li>Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+and+signal+modulation+by+cell+adhesion+receptors%3A+the+role+of+integrins%2C+cadherins%2C+immunoglobulin-cell+adhesion+molecules%2C+and+selectins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins.</a> Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).</li>
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<li>Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+in+situ+analysis+of+TCR-pMHC+recognition%3A+response+of+an+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network.</a> Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).</li>
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<li>Marshall, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423, 190-193 (2003).</li>
<li>Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+catch+bonds+between+an+integrin+and+its+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand.</a> The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+bonds+govern+adhesion+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear.</a> The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+glycoprotein+Ibalpha+forms+catch+bonds+with+human+WT+vWF+but+not+with+type+2B+von+Willebrand+disease+vWF%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).</li>
<li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 (2010).</li>
<li>Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biomolecular+interactions+by+fast+three-dimensional+tracking+of+laser-confined+carrier+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).</li>
<li>Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+switching+and+coupling+between+two+dissociation+pathways+in+a+P-selectin+adhesion+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).</li>
<li>Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Flanking+Region+of+the+A1+Domain+Regulates+the+Force-dependent+Binding+of+von+Willebrand+Factor+to+Platelet+Glycoprotein+Ib%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib.</a> Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1%2FICAM-1+catch+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+force-regulated+conformational+changes+and+ligand+dissociation+from+a+single+integrin+on+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells.</a> The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).</li>
<li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+in+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing in T lymphocyte activation.</a> Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).</li>
<li>Bashour, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).</li>
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<li>Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+cytoplasmic+calcium+signals+in+a+2-stage+platelet+activation+process+induced+by+the+glycoprotein+Ibalpha+mechanoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor.</a> Blood. 100, 2793-2800 (2002).</li>
<li>Lefort, C. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+arrest+by+LFA-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil arrest by LFA-1 activation.</a> Frontiers in immunology. 3, 157(2012).</li>
<li>Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+dynamic+catch+bonds+between+TCR+and+agonist+peptide-MHC+triggers+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling.</a> Cell. 157, 357-368 (2014).</li>
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<li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1%2Bsyndecan-4+trimolecular+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature communications. 5, 4886(2014).</li>
<li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces%3A+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).</li>
<li>Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+history+dependence+of+receptor-ligand+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Force history dependence of receptor-ligand dissociation.</a> Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).</li>
<li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+and+kinetics+of+force-induced+conformational+changes+of+an+alphaA+domain-containing+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin.</a> PloS one. 6, e27946(2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Eine erfolgreiche fBFP Experiment bringt einige kritische Überlegungen. Erstens, für die Kraftberechnung zu zuverlässig sein, die Mikropipette, die RBC und die Sonde Perle sollte so nah wie möglich koaxial ausgerichtet werden. Die Projektion der RBC in der Pipette über eine Sonde Pipetten Durchmesser sein, so dass die Reibung zwischen dem RBC und dem Pipetten vernachlässigbar ist. Für eine typische menschliche RBC ist die optimale Pipetten Durchmesser von 2,0-2,4 um, die eine beste Anpassung der Gleichung 1 17,30</...

Zell-zu-Zell und Zell-extrazellulären Matrix (ECM) Haftung wird durch die Bindung zwischen Zelloberflächenrezeptoren, ECM-Proteine ​​und / oder Lipide 1 vermittelt. Bindung erlaubt den Zellen funktionalen Strukturen 1 zu bilden, ebenso wie zu erkennen, zu kommunizieren und zu reagieren, um die Umwelt 1-3. Anders als lösliche Proteine ​​(zB Cytokine und Wachstumsfaktoren), die binden aus einem dreidimensionalen (3D) Fluidphase auf die Zelloberflächenrezeptoren Zelladhäsionsrezeptoren bilden Bindungen mit ihren Liganden über einen schmalen Spalt junctional zu zwei einander gegenüberliegenden Oberflächen, die Molekular beschränken brücken Diffusion in einem zweidimensionalen (2D) Schnittstelle 4-7. Im Gegensatz zu 3D-Kinetik, die üblicherweise durch herkömmliche Bindungstests (zB Oberflächenplasmonresonanz oder SPR) gemessen werden, 2D-Kinetik mit spezialisierten Techniken wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) 8-10 quantifiziert werden, Durchflusskammer 11,12, Mikro 13,14, optischePinzette 15 und Biomembran Kraftsonde (BFP) 16-21. Mehr als lediglich die Bereitstellung physikalische Verknüpfung für die zelluläre Kohäsion, sind Adhäsionsmoleküle, eine Hauptkomponente des Signal-Maschine, damit die Zelle mit ihrer Umgebung zu kommunizieren. Hat eine zunehmende Interesse für das Verständnis, wie Ligand Eingriff Adhäsionsmoleküle initiiert intrazellulären Signalisierung und wie die anfängliche Signal innerhalb der Zelle transduziert. Intuitiv Eigenschaften des Rezeptor-Ligand-Bindung kann die Signale induziert auswirken. Es ist jedoch schwierig, mechanistische Beziehungen zwischen der extrazellulären Interaktion und intrazelluläre Signalereignisse sezieren Verwendung traditioneller Ensemble von biochemischen Assays wegen ihrer vielen Einschränkungen, beispielsweise eine schlechte zeitliche Auflösung und das völlige Fehlen von räumlicher Auflösung. Bestehende Verfahren, die sowohl biophysikalischer (2D-Rezeptor-Liganden-Bindung Kinetik) zu ermöglichen und biochemische (Signalisierung) Beobachtungen über Live-Zellen umfassen Substrate von abstimmbaren Steifigkeit 22, Elastomer Säule Arrays 23 und Strömungsraum / mikrofluidischen Vorrichtungen mit Fluoreszenzfähigkeit 24-26 integriert. Jedoch haben Auslesungen Signalisierung und Rezeptor-Ligandenbindungs ​​separat (häufig durch verschiedene Verfahren) erhalten werden, was es erschwert, zeitlichen und räumlichen Beziehungen der Bindungseigenschaften mit Signalisierungsereignisse zu sezieren. Konventionelle BFP ist eine ultrasensitive Kraftspektroskopie mit hoher Raum-Zeit-Auflösung 17. Es verwendet eine flexible roten Blutkörperchen (RBC) als Kraftsensor, eine Messung der Einzelmolekül 2D Kinetik, mechanische Eigenschaften und Konformationsänderungen 14,16,19-21,27-29. Ein Fluoreszenz-Bildgebung basiert BFP (fBFP) korreliert die Rezeptor-Ligand-Bindungskinetik mit der Bindung ausgelöste Zellsignalisierung bei Einzelmolekülskala. Mit diesem Setup in situ Zellsignalisierung Tätigkeiten im Zusammenhang mit der Oberfläche mechanical Stimulation wurde in T-Zellen, 27 beobachtet. Die fBFP ist vielseitig und kann für die Untersuchung der Zellhaftung und Signalisierung durch andere Moleküle in anderen Zellen vermittelt werden.

<table><tbody><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat (NaH2PO4 & Bull; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Phosphatpuffer Zubereitung</td></tr><tr><td>Anhy. Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>Phosphatpufferpräparation</td></tr><tr><td>Natriumcarbonat (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>Karbonat/Bikarbonat-Pufferpräparat</td></tr><tr><td>Natriumbikarbonat (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Karbonat/Bikarbonat Präparation Puffer</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>N2-5% Pufferpräparation</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>N2-5% Pufferpräparation</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>N2-5% Pufferpräparation</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>N2-5%-Puffervorbereitung</td></tr><tr><td>MAL-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5002-1</td><td>Bead-Funktionalisierung</td></tr><tr><td>Biotin-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5026-1</td><td>Erythrozyten-Biotinylierung</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6261</td><td>Erythrozyten-Osmolaritätseinstellung</td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid (NH4OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6899</td><td>Glasperle Silanisierung</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>BDH</td><td>67-56-1</td><td>Glasperlensilanisierung</td></tr><tr><td>30% Wasserstoffperoxid (H2O2)</td><td>J. T. Barker</td><td>Jan-86</td><td>Glasperlensilanisierung</td></tr><tr><td>Essigsäure (glazial)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Glasperlensilanisierung</td></tr><tr><td>3-Mercaptopropyltrimethoxysilan (MPTMS)</td><td>Uct Specialties, llc</td><td>4420-74-0</td><td>Funktionalisierung von Glasperlen</td></tr><tr><td>Borosilikatglas</td><td>Distrilab Particle Technology</td><td>9002</td><td>Funktionalisierung von Glasperlen</td></tr><tr><td>Streptavidin&minus; Maleimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9415</td><td>Funktionalisierung von Glasperlen</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>Ligandenfunktionalisierung</td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-1201</td><td>Intrazelluläre Calciumfluoreszenzfarbstoffbeladung</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Intrazelluläre Calciumfluoreszenzfarbstoffbeladung</td></tr><tr><td>Quantibrite PE-Kügelchen</td><td>BD Biosciences</td><td>340495</td><td>Dichtequantifizierung</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSR II</td><td>Dichtequantifizierung</td></tr><tr><td>Kapillarrohr 0,7-1,0 mm x 30 Zoll</td><td>Kimble Chase</td><td>46485-1</td><td>Mikropipette zur Herstellung von</td></tr><tr><td>Flammen/Braunen Mikropipetten Abzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Mikropipette zur Herstellung</td></tr><tr><td>von Pipetten Microforce</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Mikropipette zur Herstellung</td></tr> von <tr><td>Mineralöl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2629-1</td><td>Kammerbaugruppe</td></tr><tr><td>Mikroskop Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>Kammerbaugruppe</td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>Kammerbaugruppe</td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td>309602-Kammer-Montage</td></tr><tr><td>Mikropipettenhalter</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td>Kammer-Montage</td></tr><tr><td>Eigenentwickelte mechanische Teile und Adapter, Herstellung von CNC-Bearbeitung.&nbsp;</td><td>Biophysik-Instrument</td><td>Alle Teile werden gemäß den CAD-Entwürfen angepasst.</td><td>BFP-System</td></tr><tr><td>Mikroskop (TiE invers)</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>BFP System</td></tr><tr><td>Objektiv CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)</td><td>Nikon</td><td>MRH00401</td><td>BFP System</td></tr><tr><td>Kamera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2020C</td><td>BFP System</td></tr><tr><td>Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2185A</td><td>BFP System</td></tr><tr><td>Manueller Submikron-Sondenkopf mit hochauflösender Fernbedienung</td><td>Karl Süss</td><td>PH400</td><td>BFP-System</td></tr><tr><td>Antivibrationstisch (5' x 3')</td><td>TMC</td><td>77049089</td><td>BFP-System</td></tr><tr><td>3D-manueller Translationstisch</td><td>Newport</td><td>462-XYZ-M</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks 3D-CAD-Software</td><td>SOLIDWORKS Corp.</td><td>Version 2012 SP5</td><td>BFP-System</td></tr><tr><td>LabVIEW-Software</td><td>National Instruments</td><td>Version 2009</td><td>BFP-System, BFP-Programm</td></tr><tr><td>3D-Piezo-Translationstisch</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-105.3P</td><td>BFP-System Linearer</td></tr><tr><td>Piezo-Accuator</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-753.1CD</td><td>BFP-System</td></tr><tr><td>Mikromanager-Software</td><td></td><td>Version 1.4</td><td>fBFP-System, Fluoreszenz Bildgebungsprogramm</td></tr><tr><td>Dual Cam (DC-2)</td><td>Photometrie</td> 77054724 <td>fBFP-System</td><td></td></tr><tr><td>Dual Cam Emissionsfilter (T565LPXR)</td><td>Photometrie</td><td>77054725</td><td>fBFP-System</td></tr><tr><td>Fluoreszenzkamera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-R2 C10600-10B</td><td>fBFP-System</td></tr><tr><td>Paraffinfolie aus Kunststoff (Parafilm)</td><td>Bemis Company, Inc</td><td>PM996</td><td>Flaschenversiegelung</td></tr><tr><td>Karbonat/ Bicarbonat-Puffer (pH 8,5)</td><td></td><td></td><td>8,4 g/L Natriumcarbonat (Na2CO3), 10,6 g/l Natriumbikarbonat (NaHCO3)</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer (pH 6,5-6,8)</td><td></td><td></td><td>27,6 g/l NaPhosphat monobasisch (NaH2PO4 &bull; H2O), 28,4 g/L Anhy. Zweibasisches Naphosphat (Na2HPO4)</td></tr><tr><td>N2-5% Puffer (pH 7,2)</td><td></td><td></td><td>20,77 g/l Kaliumchlorid (KCl), 2,38 g/l Natriumchlorid (NaCl), 0,13 g/l monobasisches Kaliumphosphat (KH2PO4), 0,71 g/L anhy. Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4), 9,70 g/L Saccharose</td></tr></tbody></table>

fluoreszenz biomembrane kraft sonde: concurrent quantifizierung von rezeptor-ligand-kinetik und binding-induzierte intrazelluläre signaling auf einzelzell

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membranrezeptor-Liganden-Wechselwirkungen vermitteln viele zelluläre Funktionen. Bindungskinetik und nachgeschalteten Signal durch diese molekularen Wechselwirkungen ausgelöst werden wahrscheinlich durch die mechanische Umgebung, in der Bindung und Signalisierung erfolgen betroffen. Eine neuere Studie hat gezeigt, dass eine mechanische Kraft kann die Antigen-Erkennung durch regulieren und Auslösen der T-Zellrezeptor (TCR). Dies wurde durch eine neue Technologie, die wir entwickelt und bezeichnet Fluoreszenz Biomembran Kraftsonde (fBFP), die Einzelmolekülkraftspektroskopie mit Fluoreszenzmikroskopie kombiniert möglich. Mit seinem ultra-soft menschlichen roten Blutkörperchen als sensitive Kraftsensor, ein High-Speed-Kamera und Echtzeit-Bildgebung Tracking-Techniken ist von ~ 1 pN (10 -12 N), ~ 3 nm die fBFP und ~ 0,5 ms in Kraft, räumlicher und zeitlicher Auflösung. Mit der fBFP, kann man genau einzigen Rezeptor-Ligand-Bindungskinetik unter Kraftregelung und gleichzeitig image Bindung ausgelöste intrazelluläre cal messencium Signalisierung auf einer einzelnen lebenden Zellen. Diese neue Technologie kann verwendet werden, um andere Membranrezeptor-Liganden-Wechselwirkung und Signalisierung in anderen Zellen unter mechanischer Regulierung untersuchen.

Die BFP Technik wurde von der Evans Labor 1995 17 voran. Diese picoforce Werkzeug wurde ausgiebig auf Wechselwirkungen von Proteinen auf Oberflächen immobilisiert zu messen, um so zweidimensionale Kinetik von Adhäsionsmolekülen zu analysieren, um die Interaktion mit ihren Liganden 16,19,20 verwendet, 30, um das Molekular Elastizität 21,29 zu messen und zu bestimmen, Protein Konformationsänderungen 21. Für eine fBFP, ein zusätzlicher Satz von Epifluoreszenz bezogene Einrichtung...

Wir beschreiben eine Technik zur gleichzeitigen Messung der kraftregulierten Einzelrezeptor-Liganden-Bindungskinetik und Echtzeit-Bildgebung der Kalzium-Signalübertragung in einem einzelnen T-Lymphozyten.

Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, gleichzeitig die rezeptorähnliche Bindung zu messen und die bindungsinduzierte Kalziumsignalgebung an einer einzelnen Zelle zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst Biotin isoliert und die Osmolarität menschlicher roter Blutkörperchen oder RBCs angepasst wird, um sie als ultragenaue Kraftwandler zu verwenden. Der zweite Schritt besteht darin, mikroskalige Glaskügelchen funktionalisieren, was Reinigung, Verdünnung und Beschichtung mit Liganden umfasst.Anschließend werden die T-Zellen isoliert und mit dem Kalziumfarbstoff Fluo-2 AM inkubiert, wodurch die Beobachtung der intrazellulären Kalziumionenkonzentration ermöglicht wird. Der letzte Schritt besteht darin, die Mikropipetten in der experimentellen Kammer vorzubereiten, die speziell für den Versuchsaufbau erforderlich sind. Letztendlich wird die fluoreszenzbasierte Biomembran-Kraftsonde, kurz BFP-Technik, verwendet, um die Adhäsion einer Zelle an eine ligandenbeschichtete Kugel darzustellen, die Bindungskinetik zwischen Rezeptor und Ligand zu messen und gleichzeitig den intrazellulären Kalziumspiegel zu überwachen.Diese Technik ist nützlich, um zu verstehen, wie mech

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Durch den Einsatz einer spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie-System sind auf Pixel-Ebene Karten von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) Wirkungsgrade für Zellen, die Membran-Rezeptoren angenommen, dass sie homo-oligomeren Komplexen Form erhalten. Von der Effizienz Karten FRET, sind wir in der Lage, stöchiometrische Informationen über die Oligomer-Komplex unter-Studie zu schätzen.

In vivo Quantifizierung der G Protein-gekoppelten Rezeptor-Wechselwirkungen mit spektral aufgelöste Zwei-Photonen-Mikroskopie

Dieses Video zeigt die Verwendung von Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie, um die Wechselwirkung zwischen Zelloberflächenproteinen bei Zell-Zell-Kontakten zu detektieren. Durch die Expression des interessierenden Transmembran-Adhäsionsrezeptors, der mit einem fluoreszierenden Protein markiert ist, und durch Mischen von zwei verschiedenen Zellpopulationen, die zwei spektral getrennte Fluoreszenzmarkierungen besitzen, wird die Trans-Interaktion zwischen den Rezeptoren zweier benachbarter Zellen...

Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie zur Untersuchung der Proteininteraktion an Zellkontakten

In diesem Video werden Biomembran-Kraftsonden (BFPs) verwendet, um die Kräfte zwischen Rezeptoren und Liganden zu messen. Diese Technik kann Wechselwirkungen erkennen, indem der Druck überwacht wird, der erforderlich ist, um die Bindungen zwischen dem pMHC, das auf den Sondenkügelchen konjugiert ist, und den TCRs auf den Zielzellen aufzubrechen.

Biomembran-Kraftsonde zur Quantifizierung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen

Die hier beschriebene Fluoreszenz-basierten Calciummobilisierungsassay ist ein Medium-Durchsatz Rückwärts pharmakologischen Screening-System für die Identifizierung von funktionell aktivierenden Liganden (n) der Orphan-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs).

Charakterisierung von G-Protein gekoppelten Rezeptoren durch eine Fluoreszenz-basierte Calciummobilisierungsassay

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um einzelne Rezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen sichtbar zu machen und zu verfolgen und dadurch die laterale Beweglichkeit der Rezeptoren, die Größe von Rezeptorkomplexen sowie die Visualisierung transienter Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu analysieren. Dieses Protokoll kann auf andere Membranproteine ausgeweitet werden.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Dieses Protokoll beschreibt einen Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie basierende Ansatz zur Untersuchung von Interaktionen zwischen den Proteinen, die Vermittlung von Zell-Zell-Interaktionen, d.h. Proteine in der Zelle Verzweigungen direkt in lebenden Zellen lokalisiert. Wir bieten detaillierte Richtlinien auf Kalibrierung, Datenerfassung und -Analyse, einschließlich Korrekturen möglich Artefakt Quellen.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

Wir beschreiben einen bildgebenden Ansatz zur Bestimmung des durchschnittlichen oligomeren Zustands von mEGFP-getaggten Rezeptor-Oligomeren, die durch Ligandenbindung in der Plasmamembran lebender Zellen induziert werden. Das Protokoll basiert auf der Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Mikroskopie in Kombination mit der Number and Brightness (N&amp;B)-Analyse.

Oligomerisierungsdynamik von Zelloberflächenrezeptoren in lebenden Zellen durch totale interne Reflexionsfluoreszenzmikroskopie kombiniert mit Zahlen- und Helligkeitsanalyse

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Messung der Adenin-Nukleotid-Bindung an Rezeptoren in Echtzeit in einer zellulären Umgebung vor. Die Bindung wird als Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen Trinitrophenylnukleotidderivaten und Proteinen, die mit einer nicht-kanonischen, fluoreszierenden Aminosäure markiert sind, gemessen.

Messung der Nukleotidbindung an intakte, funktionelle Membranproteine in Echtzeit

Wir stellen eine Methode zur Erfassung von Fluoreszenz-Reporter-Zeitkursen aus einzelnen Zellen mit mikrostrukturierten Arrays vor. Das Protokoll beschreibt die Vorbereitung von Einzelzellarrays, den Aufbau und Betrieb der Live-Cell-Scanning-Zeitraffermikroskopie und ein Open-Source-Bildanalyse-Tool zur automatisierten Vorauswahl, visuellen Kontrolle und Verfolgung von zellintegrierten Fluoreszenzzeitverläufen pro Adhäsionsstelle.

Live-Cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - eine vielseitige Technik zur Quantifizierung der zellulären Kinetik

Wir präsentieren ein experimentelles Protokoll und einen Datenanalyse-Workflow zur Durchführung der zweifarbigen Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) in Kombination mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET), um die Membranrezeptordynamik in lebenden Zellen mit modernen Fluoreszenzmarkierungstechniken zu untersuchen.

Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen

Hier beschreiben wir eine Reihe von Methoden zur Charakterisierung der Interaktion von Proteinen mit Membranen von Zellen oder Mikrovesikeln.

Analyse der Wechselwirkung fluoreszierend markierter Proteine mit künstlichen Phospholipid-Mikrovesikeln mittels quantitativer Durchflusszytometrie

Erfahren Sie die Fluoreszenz-Biomembran-Kraftsonden-Technik zur gleichzeitigen Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Calcium-Signalgebung in einzelnen T-Lymphozyten. Diese Methode ermöglicht präzise Einzelzellanalysen.

Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell (Video) | JoVE Journal

Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell

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