Name: Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Erfahren Sie die Fluoreszenz-Biomembran-Kraftsonden-Technik zur gleichzeitigen Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Calcium-Signalgebung in einzelnen T-Lymphozyten. Diese Methode ermöglicht präzise Einzelzellanalysen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Forschung im Zusammenhang mit dieser Arbeit und die Entwicklung der fBFP-Technologie im Zhu-Labor wurden durch NIH-Zuschüsse AI044902, AI077343, AI038282, HL093723, HL091020, GM096187 und TW008753 unterstützt. Wir danken Evan Evans für die Erfindung dieses befähigenden experimentellen Werkzeugs und den Mitgliedern des Evans-Labors, Andrew Leung, Koji Kinoshita, Wesley Wong und Ken Halvorsen, für ihre Hilfe beim Aufbau des BFP. Wir danken auch den anderen Mitgliedern des Zhu-Labors, Fang Kong, Chenghao Ge und Kaitao Li, für ihre Hilfe bei der Entwicklung der Instrumente.

<ol><li>Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+and+signal+modulation+by+cell+adhesion+receptors%3A+the+role+of+integrins%2C+cadherins%2C+immunoglobulin-cell+adhesion+molecules%2C+and+selectins%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+reviews%22%5BJournal%5D)">Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins.</a> Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).</li>
<li>Davis, M. M., Bjorkman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+antigen+receptor+genes+and+T-cell+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell antigen receptor genes and T-cell recognition.</a> Nature. 334, 395-402 (1988).</li>
<li>Dado, D., Sagi, M., Levenberg, S., Zemel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+medicine%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of stem cell differentiation.</a> Regenerative medicine. 7, 101-116 (2012).</li>
<li>Edwards, L. J., Zarnitsyna, V. I., Hood, J. D., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+T+cell+recognition+of+antigen%3A+significance+of+two-dimensional+kinetic+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Insights into T cell recognition of antigen: significance of two-dimensional kinetic parameters.</a> Frontiers in immunology. 3, 86(2012).</li>
<li>Zhu, C., Jiang, N., Huang, J., Zarnitsyna, V. I., Evavold, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+in+situ+analysis+of+TCR-pMHC+recognition%3A+response+of+an+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Insights from in situ analysis of TCR-pMHC recognition: response of an interaction network.</a> Immunological reviews. 251, 49-64 (2013).</li>
<li>Huang, J., Meyer, C., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+antigen+recognition+at+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+immunology%22%5BJournal%5D)">T cell antigen recognition at the cell membrane.</a> Molecular immunology. 52, 155-164 (2012).</li>
<li>Zarnitsyna, V., Zhu, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+triggering%3A+insights+from+2D+kinetics+analysis+of+molecular+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+biology%22%5BJournal%5D)">T cell triggering: insights from 2D kinetics analysis of molecular interactions.</a> Physical biology. 9, 045005(2012).</li>
<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+Force+Microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Atomic Force Microscope.</a> Physical Review Letters. 56, 930-933 (1986).</li>
<li>Marshall, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+catch+bonds+involving+cell-adhesion+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Direct observation of catch bonds involving cell-adhesion molecules.</a> Nature. 423, 190-193 (2003).</li>
<li>Kong, F., Garcia, A. J., Mould, A. P., Humphries, M. J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+catch+bonds+between+an+integrin+and+its+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Demonstration of catch bonds between an integrin and its ligand.</a> The Journal of cell biology. 185, 1275-1284 (2009).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+bonds+govern+adhesion+through+L-selectin+at+threshold+shear%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Catch bonds govern adhesion through L-selectin at threshold shear.</a> The Journal of cell biology. 166, 913-923 (2004).</li>
<li>Yago, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+glycoprotein+Ibalpha+forms+catch+bonds+with+human+WT+vWF+but+not+with+type+2B+von+Willebrand+disease+vWF%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Platelet glycoprotein Ibalpha forms catch bonds with human WT vWF but not with type 2B von Willebrand disease vWF.</a> The Journal of clinical investigation. 118, 3195-3207 (2008).</li>
<li>Chesla, S. E., Selvaraj, P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+two-dimensional+receptor-ligand+binding+kinetics+by+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Measuring two-dimensional receptor-ligand binding kinetics by micropipette.</a> Biophysical journal. 75, 1553-1572 (1998).</li>
<li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinetics+of+two-dimensional+TCR+and+pMHC+interactions+determine+T-cell+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The kinetics of two-dimensional TCR and pMHC interactions determine T-cell responsiveness.</a> Nature. 464, 932-936 (2010).</li>
<li>Heinrich, V., Wong, W. P., Halvorsen, K., Evans, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+biomolecular+interactions+by+fast+three-dimensional+tracking+of+laser-confined+carrier+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir+%3A+the+ACS+journal+of+surfaces+and+colloids%22%5BJournal%5D)">Imaging biomolecular interactions by fast three-dimensional tracking of laser-confined carrier particles.</a> Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids. 24, 1194-1203 (2008).</li>
<li>Chen, W., Evans, E. A., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+receptor-ligand+interactions+between+surfaces+by+thermal+fluctuations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Monitoring receptor-ligand interactions between surfaces by thermal fluctuations.</a> Biophysical journal. 94, 694-701 (2008).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical. 68, 2580-2587 (1995).</li>
<li>Evans, E., Leung, A., Heinrich, V., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+switching+and+coupling+between+two+dissociation+pathways+in+a+P-selectin+adhesion+bond%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical switching and coupling between two dissociation pathways in a P-selectin adhesion bond.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 11281-11286 (2004).</li>
<li>Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+Flanking+Region+of+the+A1+Domain+Regulates+the+Force-dependent+Binding+of+von+Willebrand+Factor+to+Platelet+Glycoprotein+Ib%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The N-terminal Flanking Region of the A1 Domain Regulates the Force-dependent Binding of von Willebrand Factor to Platelet Glycoprotein Ib.</a> Journal of Biological Chemistry. 288, (2013).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forcing+switch+from+short-+to+intermediate-+and+long-lived+states+of+the+alphaA+domain+generates+LFA-1%2FICAM-1+catch+bonds%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Forcing switch from short- to intermediate- and long-lived states of the alphaA domain generates LFA-1/ICAM-1 catch bonds.</a> The Journal of biological chemistry. 285, 35967-35978 (2010).</li>
<li>Chen, W., Lou, J., Evans, E. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+force-regulated+conformational+changes+and+ligand+dissociation+from+a+single+integrin+on+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Observing force-regulated conformational changes and ligand dissociation from a single integrin on cells.</a> The Journal of cell biology. 199, 497-512 (2012).</li>
<li>Judokusumo, E., Tabdanov, E., Kumari, S., Dustin, M. L., Kam, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanosensing+in+T+lymphocyte+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Mechanosensing in T lymphocyte activation.</a> Biophysical journal. 102, L5-L7 (2012).</li>
<li>Bashour, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD28+and+CD3+have+complementary+roles+in+T-cell+traction+forces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">CD28 and CD3 have complementary roles in T-cell traction forces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2241-2246 (2014).</li>
<li>Nesbitt, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+glycoprotein+Ib%2FV%2FIX+and+integrin+alpha+IIbbeta+3-dependent+calcium+signals+cooperatively+regulate+platelet+adhesion+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct glycoprotein Ib/V/IX and integrin alpha IIbbeta 3-dependent calcium signals cooperatively regulate platelet adhesion under flow.</a> The Journal of biological chemistry. 277, 2965-2972 (2002).</li>
<li>Mazzucato, M., Pradella, P., Cozzi, M. R., De Marco, L., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+cytoplasmic+calcium+signals+in+a+2-stage+platelet+activation+process+induced+by+the+glycoprotein+Ibalpha+mechanoreceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Sequential cytoplasmic calcium signals in a 2-stage platelet activation process induced by the glycoprotein Ibalpha mechanoreceptor.</a> Blood. 100, 2793-2800 (2002).</li>
<li>Lefort, C. T., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+arrest+by+LFA-1+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Neutrophil arrest by LFA-1 activation.</a> Frontiers in immunology. 3, 157(2012).</li>
<li>Liu, B., Chen, W., Evavold, B. D., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+dynamic+catch+bonds+between+TCR+and+agonist+peptide-MHC+triggers+T+cell+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Accumulation of dynamic catch bonds between TCR and agonist peptide-MHC triggers T cell signaling.</a> Cell. 157, 357-368 (2014).</li>
<li>Lou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-enhanced+adhesion+regulated+by+a+selectin+interdomain+hinge%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Flow-enhanced adhesion regulated by a selectin interdomain hinge.</a> The Journal of cell biology. 174, 1107-1117 (2006).</li>
<li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1%2Bsyndecan-4+trimolecular+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature communications. 5, 4886(2014).</li>
<li>Chen, W., Zarnitsyna, V. I., Sarangapani, K. K., Huang, J., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+Receptor-Ligand+Binding+Kinetics+on+Cell+Surfaces%3A+From+Adhesion+Frequency+to+Thermal+Fluctuation+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+molecular+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Measuring Receptor-Ligand Binding Kinetics on Cell Surfaces: From Adhesion Frequency to Thermal Fluctuation Methods.</a> Cellular and molecular bioengineering. 1, 276-288 (2008).</li>
<li>Marshall, B. T., Sarangapani, K. K., Lou, J., McEver, R. P., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+history+dependence+of+receptor-ligand+dissociation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical%22%5BJournal%5D)">Force history dependence of receptor-ligand dissociation.</a> Biophysical. 88, 1458-1466 (2005).</li>
<li>Xiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+and+kinetics+of+force-induced+conformational+changes+of+an+alphaA+domain-containing+integrin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Structural basis and kinetics of force-induced conformational changes of an alphaA domain-containing integrin.</a> PloS one. 6, e27946(2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Eine erfolgreiche fBFP Experiment bringt einige kritische Überlegungen. Erstens, für die Kraftberechnung zu zuverlässig sein, die Mikropipette, die RBC und die Sonde Perle sollte so nah wie möglich koaxial ausgerichtet werden. Die Projektion der RBC in der Pipette über eine Sonde Pipetten Durchmesser sein, so dass die Reibung zwischen dem RBC und dem Pipetten vernachlässigbar ist. Für eine typische menschliche RBC ist die optimale Pipetten Durchmesser von 2,0-2,4 um, die eine beste Anpassung der Gleichung 1 17,30</...

Zell-zu-Zell und Zell-extrazellulären Matrix (ECM) Haftung wird durch die Bindung zwischen Zelloberflächenrezeptoren, ECM-Proteine ​​und / oder Lipide 1 vermittelt. Bindung erlaubt den Zellen funktionalen Strukturen 1 zu bilden, ebenso wie zu erkennen, zu kommunizieren und zu reagieren, um die Umwelt 1-3. Anders als lösliche Proteine ​​(zB Cytokine und Wachstumsfaktoren), die binden aus einem dreidimensionalen (3D) Fluidphase auf die Zelloberflächenrezeptoren Zelladhäsionsrezeptoren bilden Bindungen mit ihren Liganden über einen schmalen Spalt junctional zu zwei einander gegenüberliegenden Oberflächen, die Molekular beschränken brücken Diffusion in einem zweidimensionalen (2D) Schnittstelle 4-7. Im Gegensatz zu 3D-Kinetik, die üblicherweise durch herkömmliche Bindungstests (zB Oberflächenplasmonresonanz oder SPR) gemessen werden, 2D-Kinetik mit spezialisierten Techniken wie Rasterkraftmikroskopie (AFM) 8-10 quantifiziert werden, Durchflusskammer 11,12, Mikro 13,14, optischePinzette 15 und Biomembran Kraftsonde (BFP) 16-21. Mehr als lediglich die Bereitstellung physikalische Verknüpfung für die zelluläre Kohäsion, sind Adhäsionsmoleküle, eine Hauptkomponente des Signal-Maschine, damit die Zelle mit ihrer Umgebung zu kommunizieren. Hat eine zunehmende Interesse für das Verständnis, wie Ligand Eingriff Adhäsionsmoleküle initiiert intrazellulären Signalisierung und wie die anfängliche Signal innerhalb der Zelle transduziert. Intuitiv Eigenschaften des Rezeptor-Ligand-Bindung kann die Signale induziert auswirken. Es ist jedoch schwierig, mechanistische Beziehungen zwischen der extrazellulären Interaktion und intrazelluläre Signalereignisse sezieren Verwendung traditioneller Ensemble von biochemischen Assays wegen ihrer vielen Einschränkungen, beispielsweise eine schlechte zeitliche Auflösung und das völlige Fehlen von räumlicher Auflösung. Bestehende Verfahren, die sowohl biophysikalischer (2D-Rezeptor-Liganden-Bindung Kinetik) zu ermöglichen und biochemische (Signalisierung) Beobachtungen über Live-Zellen umfassen Substrate von abstimmbaren Steifigkeit 22, Elastomer Säule Arrays 23 und Strömungsraum / mikrofluidischen Vorrichtungen mit Fluoreszenzfähigkeit 24-26 integriert. Jedoch haben Auslesungen Signalisierung und Rezeptor-Ligandenbindungs ​​separat (häufig durch verschiedene Verfahren) erhalten werden, was es erschwert, zeitlichen und räumlichen Beziehungen der Bindungseigenschaften mit Signalisierungsereignisse zu sezieren. Konventionelle BFP ist eine ultrasensitive Kraftspektroskopie mit hoher Raum-Zeit-Auflösung 17. Es verwendet eine flexible roten Blutkörperchen (RBC) als Kraftsensor, eine Messung der Einzelmolekül 2D Kinetik, mechanische Eigenschaften und Konformationsänderungen 14,16,19-21,27-29. Ein Fluoreszenz-Bildgebung basiert BFP (fBFP) korreliert die Rezeptor-Ligand-Bindungskinetik mit der Bindung ausgelöste Zellsignalisierung bei Einzelmolekülskala. Mit diesem Setup in situ Zellsignalisierung Tätigkeiten im Zusammenhang mit der Oberfläche mechanical Stimulation wurde in T-Zellen, 27 beobachtet. Die fBFP ist vielseitig und kann für die Untersuchung der Zellhaftung und Signalisierung durch andere Moleküle in anderen Zellen vermittelt werden.

<table><tbody><tr><td>Monobasisches Natriumphosphat-Monohydrat (NaH2PO4 & Bull; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>Phosphatpuffer Zubereitung</td></tr><tr><td>Anhy. Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>Phosphatpufferpräparation</td></tr><tr><td>Natriumcarbonat (Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>Karbonat/Bikarbonat-Pufferpräparat</td></tr><tr><td>Natriumbikarbonat (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>Karbonat/Bikarbonat Präparation Puffer</td></tr><tr><td>Natriumchlorid (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>N2-5% Pufferpräparation</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>N2-5% Pufferpräparation</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>N2-5% Pufferpräparation</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td>N2-5%-Puffervorbereitung</td></tr><tr><td>MAL-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5002-1</td><td>Bead-Funktionalisierung</td></tr><tr><td>Biotin-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5026-1</td><td>Erythrozyten-Biotinylierung</td></tr><tr><td>Nystatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6261</td><td>Erythrozyten-Osmolaritätseinstellung</td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid (NH4OH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-6899</td><td>Glasperle Silanisierung</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>BDH</td><td>67-56-1</td><td>Glasperlensilanisierung</td></tr><tr><td>30% Wasserstoffperoxid (H2O2)</td><td>J. T. Barker</td><td>Jan-86</td><td>Glasperlensilanisierung</td></tr><tr><td>Essigsäure (glazial)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ARK2183</td><td>Glasperlensilanisierung</td></tr><tr><td>3-Mercaptopropyltrimethoxysilan (MPTMS)</td><td>Uct Specialties, llc</td><td>4420-74-0</td><td>Funktionalisierung von Glasperlen</td></tr><tr><td>Borosilikatglas</td><td>Distrilab Particle Technology</td><td>9002</td><td>Funktionalisierung von Glasperlen</td></tr><tr><td>Streptavidin&minus; Maleimid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9415</td><td>Funktionalisierung von Glasperlen</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>Ligandenfunktionalisierung</td></tr><tr><td>Fura2-AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-1201</td><td>Intrazelluläre Calciumfluoreszenzfarbstoffbeladung</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>Intrazelluläre Calciumfluoreszenzfarbstoffbeladung</td></tr><tr><td>Quantibrite PE-Kügelchen</td><td>BD Biosciences</td><td>340495</td><td>Dichtequantifizierung</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSR II</td><td>Dichtequantifizierung</td></tr><tr><td>Kapillarrohr 0,7-1,0 mm x 30 Zoll</td><td>Kimble Chase</td><td>46485-1</td><td>Mikropipette zur Herstellung von</td></tr><tr><td>Flammen/Braunen Mikropipetten Abzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-97</td><td>Mikropipette zur Herstellung</td></tr><tr><td>von Pipetten Microforce</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td>Mikropipette zur Herstellung</td></tr> von <tr><td>Mineralöl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2629-1</td><td>Kammerbaugruppe</td></tr><tr><td>Mikroskop Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-G</td><td>Kammerbaugruppe</td></tr><tr><td>Mikroinjektor</td><td>World Precision Instruments</td><td>MF34G-5</td><td>Kammerbaugruppe</td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td>309602-Kammer-Montage</td></tr><tr><td>Mikropipettenhalter</td><td>Narishige</td><td>HI-7</td><td>Kammer-Montage</td></tr><tr><td>Eigenentwickelte mechanische Teile und Adapter, Herstellung von CNC-Bearbeitung.&nbsp;</td><td>Biophysik-Instrument</td><td>Alle Teile werden gemäß den CAD-Entwürfen angepasst.</td><td>BFP-System</td></tr><tr><td>Mikroskop (TiE invers)</td><td>Nikon</td><td>MEA53100</td><td>BFP System</td></tr><tr><td>Objektiv CFI Plan Fluor 40x (NA 0.75, WD 0.72 mm, Spg)</td><td>Nikon</td><td>MRH00401</td><td>BFP System</td></tr><tr><td>Kamera, GE680, 640 x 480, GigE, 1/3" CCD, mono</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2020C</td><td>BFP System</td></tr><tr><td>Prosilica GC1290 - ICX445, 1/3", C-Mount, 1280 x 960, Mono., CCD, 12 Bit ADC</td><td>Graftek Imaging</td><td>02-2185A</td><td>BFP System</td></tr><tr><td>Manueller Submikron-Sondenkopf mit hochauflösender Fernbedienung</td><td>Karl Süss</td><td>PH400</td><td>BFP-System</td></tr><tr><td>Antivibrationstisch (5' x 3')</td><td>TMC</td><td>77049089</td><td>BFP-System</td></tr><tr><td>3D-manueller Translationstisch</td><td>Newport</td><td>462-XYZ-M</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks 3D-CAD-Software</td><td>SOLIDWORKS Corp.</td><td>Version 2012 SP5</td><td>BFP-System</td></tr><tr><td>LabVIEW-Software</td><td>National Instruments</td><td>Version 2009</td><td>BFP-System, BFP-Programm</td></tr><tr><td>3D-Piezo-Translationstisch</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-105.3P</td><td>BFP-System Linearer</td></tr><tr><td>Piezo-Accuator</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-753.1CD</td><td>BFP-System</td></tr><tr><td>Mikromanager-Software</td><td></td><td>Version 1.4</td><td>fBFP-System, Fluoreszenz Bildgebungsprogramm</td></tr><tr><td>Dual Cam (DC-2)</td><td>Photometrie</td> 77054724 <td>fBFP-System</td><td></td></tr><tr><td>Dual Cam Emissionsfilter (T565LPXR)</td><td>Photometrie</td><td>77054725</td><td>fBFP-System</td></tr><tr><td>Fluoreszenzkamera</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA-R2 C10600-10B</td><td>fBFP-System</td></tr><tr><td>Paraffinfolie aus Kunststoff (Parafilm)</td><td>Bemis Company, Inc</td><td>PM996</td><td>Flaschenversiegelung</td></tr><tr><td>Karbonat/ Bicarbonat-Puffer (pH 8,5)</td><td></td><td></td><td>8,4 g/L Natriumcarbonat (Na2CO3), 10,6 g/l Natriumbikarbonat (NaHCO3)</td></tr><tr><td>Phosphatpuffer (pH 6,5-6,8)</td><td></td><td></td><td>27,6 g/l NaPhosphat monobasisch (NaH2PO4 &bull; H2O), 28,4 g/L Anhy. Zweibasisches Naphosphat (Na2HPO4)</td></tr><tr><td>N2-5% Puffer (pH 7,2)</td><td></td><td></td><td>20,77 g/l Kaliumchlorid (KCl), 2,38 g/l Natriumchlorid (NaCl), 0,13 g/l monobasisches Kaliumphosphat (KH2PO4), 0,71 g/L anhy. Natriumphosphat zweibasisch (Na2HPO4), 9,70 g/L Saccharose</td></tr></tbody></table>

fluoreszenz biomembrane kraft sonde: concurrent quantifizierung von rezeptor-ligand-kinetik und binding-induzierte intrazelluläre signaling auf einzelzell

Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell

Membranrezeptor-Liganden-Wechselwirkungen vermitteln viele zelluläre Funktionen. Bindungskinetik und nachgeschalteten Signal durch diese molekularen Wechselwirkungen ausgelöst werden wahrscheinlich durch die mechanische Umgebung, in der Bindung und Signalisierung erfolgen betroffen. Eine neuere Studie hat gezeigt, dass eine mechanische Kraft kann die Antigen-Erkennung durch regulieren und Auslösen der T-Zellrezeptor (TCR). Dies wurde durch eine neue Technologie, die wir entwickelt und bezeichnet Fluoreszenz Biomembran Kraftsonde (fBFP), die Einzelmolekülkraftspektroskopie mit Fluoreszenzmikroskopie kombiniert möglich. Mit seinem ultra-soft menschlichen roten Blutkörperchen als sensitive Kraftsensor, ein High-Speed-Kamera und Echtzeit-Bildgebung Tracking-Techniken ist von ~ 1 pN (10 -12 N), ~ 3 nm die fBFP und ~ 0,5 ms in Kraft, räumlicher und zeitlicher Auflösung. Mit der fBFP, kann man genau einzigen Rezeptor-Ligand-Bindungskinetik unter Kraftregelung und gleichzeitig image Bindung ausgelöste intrazelluläre cal messencium Signalisierung auf einer einzelnen lebenden Zellen. Diese neue Technologie kann verwendet werden, um andere Membranrezeptor-Liganden-Wechselwirkung und Signalisierung in anderen Zellen unter mechanischer Regulierung untersuchen.

Die BFP Technik wurde von der Evans Labor 1995 17 voran. Diese picoforce Werkzeug wurde ausgiebig auf Wechselwirkungen von Proteinen auf Oberflächen immobilisiert zu messen, um so zweidimensionale Kinetik von Adhäsionsmolekülen zu analysieren, um die Interaktion mit ihren Liganden 16,19,20 verwendet, 30, um das Molekular Elastizität 21,29 zu messen und zu bestimmen, Protein Konformationsänderungen 21. Für eine fBFP, ein zusätzlicher Satz von Epifluoreszenz bezogene Einrichtung...

Wir beschreiben eine Technik zur gleichzeitigen Messung der kraftregulierten Einzelrezeptor-Liganden-Bindungskinetik und Echtzeit-Bildgebung der Kalzium-Signalübertragung in einem einzelnen T-Lymphozyten.

Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell

Membrane receptor-ligand interactions mediate many cellular functions. Binding kinetics and downstream signaling triggered by these molecular interactions ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, gleichzeitig die rezeptorähnliche Bindung zu messen und die bindungsinduzierte Kalziumsignalgebung an einer einzelnen Zelle zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst Biotin isoliert und die Osmolarität menschlicher roter Blutkörperchen oder RBCs angepasst wird, um sie als ultragenaue Kraftwandler zu verwenden. Der zweite Schritt besteht darin, mikroskalige Glaskügelchen funktionalisieren, was Reinigung, Verdünnung und Beschichtung mit Liganden umfasst.Anschließend werden die T-Zellen isoliert und mit dem Kalziumfarbstoff Fluo-2 AM inkubiert, wodurch die Beobachtung der intrazellulären Kalziumionenkonzentration ermöglicht wird. Der letzte Schritt besteht darin, die Mikropipetten in der experimentellen Kammer vorzubereiten, die speziell für den Versuchsaufbau erforderlich sind. Letztendlich wird die fluoreszenzbasierte Biomembran-Kraftsonde, kurz BFP-Technik, verwendet, um die Adhäsion einer Zelle an eine ligandenbeschichtete Kugel darzustellen, die Bindungskinetik zwischen Rezeptor und Ligand zu messen und gleichzeitig den intrazellulären Kalziumspiegel zu überwachen.Diese Technik ist nützlich, um zu verstehen, wie mechanische Kraft von T-Zellen über die Androgen-Erkennung wahrgenommen wird. Ein wesentlicher Vorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass FBIP die Bindungskinetik von Rezeptor-Ligand und eine intrazelluläre Signalübertragung gleichzeitig messen kann. Zu den schwierigen Teilen dieses Protokolls gehören die manuelle Herstellung von Mikro-PEP-Wegen mit den richtigen Durchmessern, das Aufnehmen von Zellen und Bienen mit Mikro-PEPs sowie die Montage der Kraftsonde, was zunächst fehlschlagen kann, obwohl er nicht anwesend sein konnte, um die Demonstration dieses Videos durchzuführen.Mitautor Arnold G., der kürzlich seine Promotion in meinem Labor abgeschlossen hat, hat wesentlich zur initialen Validierung der Herstellung des FBAP-Protokolls beigetragen. Gewinnen Sie acht bis zehn Mikroliter Blut aus einem Fingerstich und geben Sie diese zu einem Milliliter Carbonat-Bicarbonat-Puffer. Vortexen oder pipettieren Sie die Mischung und zentrifugieren Sie eine Minute bei 900 ×g. Entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie den Carbonat-Bicarbonat-Puffer durchführen. Waschen Sie ein weiteres Mal.Mischen Sie anschließend 10 µL des resultierenden Erythrozyten-Präparats mit 171 µL Karbonat-Bicarbonat-Puffer und 1049 µL Biotin-PEG-NHS-Linkerlösung und inkubieren Sie 30 Minuten bei Raumtemperatur. Waschen Sie die resultierende Erythrozyten-Mischung unter Verwendung desselben Waschverfahrens einmal mit Karbonat-Bicarbonat-Puffer und anschließend zweimal mit N2 5%-Puffer.Verdünnen Sie anschließend Nystatin in N₂-5%-Puffer. Um eine Endkonzentration von 40 Mikrolitern pro Milliliter zu erhalten, mischen Sie fünf Mikroliter der biotinylierten Erythrozyten mit 71,4 Mikrolitern Nystatin-Lösung und inkubieren die Mischung eine Stunde lang bei null Grad Celsius. Waschen Sie die Proben abschließend zweimal mit N₂-5%-Puffer und lagern Sie die biotinylierten Erythrozyten in N₂-5%-Puffer mit zusätzlich 0,5 % BSA im Kühlschrank. Bringen Sie ein Stück einer drei Zoll langen Mikropipette am Mikropipettenzieher an.Klicken Sie auf den Zugknopf, sodass die Mitte der Kapillare von der Maschine erhitzt wird und die Kapillare an beiden Enden gezogen wird, wodurch zwei Kapillaren mit scharfen Spitzen entstehen, die die Rohpipetten darstellen. Befestigen Sie anschließend eine Rohpipette am Pipettenhalter der Mikropipetten-Schmiede, und erhitzen Sie sie, um die Glaskugel an der Schmiede zum Schmelzen zu bringen. Führen Sie die Spitze der Rohpipette in die Glaskugel ein.Kühlen Sie die Glasphäre ab und ziehen Sie die rohe Pipette, um sie von außen zu durchbrechen, wobei die Spitze innerhalb der Sphäre verbleibt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gewünschte Öffnung der Spitze erreicht ist, um zuerst die Zellkammer herzustellen, die mit einem Glasschneider in zwei 40 Millimeter mal 11 Millimeter mal 0,2 Millimeter große Stücke aus einer 40 Millimeter mal 22 Millimeter mal 0,2 Millimeter großen Deckglasplatte zugeschnitten wird. Die Zellkammer wird auf der Grundlage eines selbstgebauten Kammersitzes aufgebaut, der aus zwei quadratischen Metallstücken und einem Griff besteht, der sie miteinander verbindet.Verwenden Sie Grace-Kleber, um eine Deckglasplatte auf die Unterseite des Kammerhalters so anzubringen, dass sie die beiden Metallquadrate überbrückt. Befestigen Sie auf ähnliche Weise die andere Deckglasplatte auf der Oberseite, wodurch eine parallele Deckglas-Kammer entsteht. Geben Sie anschließend mit der Pipette 200 µL experimentellen Puffer zwischen die beiden Deckgläser.Stellen Sie sicher, dass das Puffermedium an beiden Deckgläsern anliegt. Drehen und schütteln Sie die Kammer vorsichtig, damit das Puffermedium beide Enden der Kammer benetzt. Injizieren Sie dann vorsichtig Mineralöl in beide Seiten der Kammer, flankierend zur experimentellen Pufferzone, um das Puffermedium vor der Luft abzudichten.Injizieren Sie Suspensionen der Prob. Die Kügelchen befinden sich in der oberen, mittleren und unteren Region der Pufferzone als bcs bzw. Zielstrukturen. Um das BFP-Experiment zu beginnen, schalten Sie das Mikroskop und die Lichtquelle ein.Platzieren Sie die Kammer auf der Hauptmikroskopbühne. Der nächste Schritt ist die Installation aller drei Mikropipetten des BFP. Die Sonde links dient dazu, einen RBC zu greifen.Das Ziel rechts ist es, die Zelle zu greifen, und der Helfer unten rechts dient dazu, eine Perle zu greifen, um sie einzubauen. Verwenden Sie einen Mikroinjektor, um eine Mikropipette mit experimentellem Puffer rückzufluten. Nehmen Sie die Mikropipette vom Pipettenhalter ab und halten Sie sie tiefer, damit Flüssigkeit aus der Spitze tropfen kann. Führen Sie die Mikropipette schnell in die Halterpitze ein und achten Sie darauf, dass keine Luftblase in die Mikropipette gelangt.Während des Einsetzens die Halter-Schraube festziehen und anschließend jeden Pipettenhalter auf den entsprechenden Mikromanipulator montieren. Die Mikropipette in Richtung der Kammer schieben, sodass ihre Spitzen in den Pufferbereich der Kammer eintreten. Die Position der Mikropipette justieren und sie im mikroskopischen Sichtfeld lokalisieren.Bewegen Sie den Kammerhalterständer, um die Kolonien der drei Elemente zu finden. Stellen Sie nacheinander die Position der entsprechenden Mikropipette ein, indem Sie die Knöpfe der Manipulatoren drehen, sodass die Spitze der Mikropipette einer Zelle oder einem Kügelchen näherkommt, und saugen Sie die Zelle oder das Kügelchen auf. Durch die Einstellung des Drucks innerhalb der entsprechenden Mikropipette werden alle drei Mikropipetten ihre jeweiligen Elemente erfassen.Bewegen Sie den Kammershalter auf dem Objekttisch, um einen freien Bereich außerhalb der Kolonien der injizierten Elemente zu finden, in dem das Experiment durchgeführt wird. Schalten Sie den Mikroskop-Visualisierungsmodus um, um das Bild auf dem Computerprogramm zu sehen. Bewegen Sie alle drei Elemente an den Pipettenspitzen in das Sichtfeld des Programms.Als Nächstes richten Sie die Probekügelchen und die roten Blutkörperchen aus und manövrieren Sie die Probekügelchen vorsichtig zur Spitze der roten Blutkörperchen. Berühren Sie nun kurz die Kügelchen mit den roten Blutkörperchen und ziehen Sie sie sanft zurück; stellen Sie den Druck der Hilfsmikropipette so ein, dass die Kügelchen sanft weggeweht werden, sodass sie an der Spitze der roten Blutkörperchen haften bleiben. Bewegen Sie die Hilfspipette weg und richten Sie das Ziel- und Probekügelchen im Programm aus.Verwenden Sie im Fenster des Sichtfelds die Programmfunktionen, um die jeweiligen Radien der Probennadel, der roten Blutkörperchen und der kreisförmigen Kontaktfläche zwischen den roten Blutkörperchen und der Probennadel zu messen. Mithilfe dieser Werte lässt sich die Federkonstante der roten Blutkörperchen anhand der im Textprotokoll angegebenen Gleichung abschätzen. Nachdem Sie die gewünschte Federkonstante der roten Blutkörperchen in das Programm eingegeben haben, zeichnen Sie eine horizontale Linie über die Spitze der roten Blutkörperchen, wodurch sich in dem benachbarten Fenster eine Kurve ergibt, die die Helligkeit jedes Pixels anzeigt.Ziehen Sie entlang dieser Linie die Schwellwertlinie so, dass sie sich etwa auf halber Tiefe der Kurve befindet. Wählen Sie anschließend den gewünschten Experimentmodus: Adhäsionsfrequenz-Assay, Thermisches-Fluktuation-Assay oder Kraft-Klammern-Assay. Stellen Sie die Parameter nach Wunsch ein.Klicken Sie auf „Start“, wodurch das Programm die Ziel-Pipette bewegen und die Zielzelle in und aus Kontakt mit der Sonde bringen kann. Währenddessen erfolgt die Datensammlung und parallel dazu wird die Position der Pro-Perle in Echtzeit aufgezeichnet. Beenden Sie das Programm, indem Sie auf die Schaltfläche „Experiment beenden“ klicken, woraufhin ein Fenster angezeigt wird. Um die erfassten Daten zu speichern, aktivieren Sie die Fluoreszenzfunktion des BFP-Systems, indem Sie die Anregungslichtquelle und die Fluoreszenzkamera einschalten, die über ein separates Programm gesteuert werden.Danach wählen Sie die Parameter für die Fluoreszenzbildgebung aus, einschließlich Verstärkung, Belichtung und Anregungskanäle. Befolgen Sie alle Vorbereitungsschritte im BFP-Experimentprotokoll, einschließlich der Ausrichtung der Sonde und des Zielobjekts, um die Live-Fluoreszenzbildgebung der Zielzelle zu ermöglichen, die durch 340 Nanometer oder 380 Nanometer Anregungslicht angeregt wird. Verwenden Sie das Schneidewerkzeug, um grob den Bereich einzuteilen, in dem die Zelle während des gesamten Aufzeichnungszeitraums verbleiben wird.Klicken Sie anschließend gleichzeitig auf „Aufnahme“ und beginnen Sie zu klicken. Die Aufnahme ermöglicht es, dass abwechselnd Licht mit 340 Nanometer und 380 Nanometer die intrazelluläre Fluoreszenzfarbe anregt. Ein Paar entsprechender Fluoreszenzbilder wird etwa alle Sekunde abwechselnd aufgezeichnet.Ein Klick auf „Start“ beginnt das BFP-Experiment zur Analyse molekularer Wechselwirkungen und das Fluoreszenzbildgebungs-Experiment zur Überwachung der intrazellulären Kalziumsignalgebung, gefolgt von der Datenanalyse gemäß der schriftlichen Anleitung. In den zeitabhängigen Rohdatenkurven wird die Kraft aus der Positionsänderung der Probead ermittelt. Bei einem Ereignis ohne Adhäsion kehrt die Kraft im Kraft-Rücklauf-Signal nach dem Zurückziehen der Zielzelle von der Beadoberfläche auf null zurück.Umgekehrt zeigt sich bei einem Bruchkraftereignis die Adhäsion durch eine schnelle Erhöhung der Kraft auf ein positives Niveau während der Rückzugphase, gefolgt von einem schnellen Abfall zurück auf null. Bei einem Lebensdauerereignis wird die positive Kraft konstant gehalten, um eine Plateauphase zu erzeugen. Die Länge des Plateaus entspricht der Lebensdauer.Durch wiederholte Durchführung von VFP-Experimentzyklen wird eine Kraft-zu-Zeit-Kurve abgeleitet. Hier sind die Fluoreszenzbilder einiger oder zweier beladener T-Zellen dargestellt, die durch Lichtkanäle mit 340 Nanometer und 380 Nanometer angeregt wurden. Beide Bilder zeigen klare Zellkonturen, was darauf hinweist, dass die Zelle gut angefärbt wurde. Nachdem die Bindungskinetikdaten und die Fluoreszenzdaten von einer T-Zelle gewonnen wurden, werden sowohl die kumulative Lebensdauerkurve als auch die Kalziumkonzentrationskurve in derselben Abbildung dargestellt, um den Zusammenhang zwischen ihnen zu ermitteln.Nun sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein A-F-B-I-P-Experiment durchführt. Während dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, ob am Kraftsensor ein Defekt vorliegt, beispielsweise hinsichtlich des Durchmessers der Mikropipette, der Länge des gummiartigen Zellfortsatzes oder der Position der Perle.All dies wird die Genauigkeit der Kraftmessung beeinflussen. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher im Bereich der molekularen mechanischen Biologie, den Mechanismus der mechanischen Transduktion in allen möglichen biologischen Systemen zu untersuchen.

fluorescence-biomembrane-force-probe-concurrent-quantitation-receptor

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

In diesem Artikel beschreiben wir, wie wir FRET Spuren von einzelnen DNA-Molekülen auf einer Oberfläche immobilisiert mittels eines automatisierten konfokalen Mikroskop zu erhalten.

Automated System für Single Molecule Fluorescence Messungen der Oberflächen-immobilisierten Biomoleküle

Wir beschreiben eine Methode, die die Kinetik von Ionen-Transport von Membranproteinen Maßnahmen neben site-spezifische Analyse von Konformationsänderungen mittels Fluoreszenz an einzelnen Zellen. Diese Technik ist anpassungsfähig an Ionenkanälen, Transportern und Ionenpumpen und kann genutzt werden, um Einschränkungen bei den Protein-Untereinheiten zu bestimmen.

Die Untersuchung der Konformationsänderungen Dynamics von Membranproteinen In situ Mit Site-directed Fluoreszenzmarkierung

Dieses Video zeigt die Verwendung von Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie, um die Wechselwirkung zwischen Zelloberflächenproteinen bei Zell-Zell-Kontakten zu detektieren. Durch die Expression des interessierenden Transmembran-Adhäsionsrezeptors, der mit einem fluoreszierenden Protein markiert ist, und durch Mischen von zwei verschiedenen Zellpopulationen, die zwei spektral getrennte Fluoreszenzmarkierungen besitzen, wird die Trans-Interaktion zwischen den Rezeptoren zweier benachbarter Zellen...

Fluoreszenzfluktuationsspektroskopie zur Untersuchung der Proteininteraktion an Zellkontakten

In diesem Video werden Biomembran-Kraftsonden (BFPs) verwendet, um die Kräfte zwischen Rezeptoren und Liganden zu messen. Diese Technik kann Wechselwirkungen erkennen, indem der Druck überwacht wird, der erforderlich ist, um die Bindungen zwischen dem pMHC, das auf den Sondenkügelchen konjugiert ist, und den TCRs auf den Zielzellen aufzubrechen.

Biomembran-Kraftsonde zur Quantifizierung von Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen

Dieses Protokoll beschreibt, wie die Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie verwendet wird, um einzelne Rezeptoren auf der Oberfläche lebender Zellen sichtbar zu machen und zu verfolgen und dadurch die laterale Beweglichkeit der Rezeptoren, die Größe von Rezeptorkomplexen sowie die Visualisierung transienter Rezeptor-Rezeptor-Wechselwirkungen zu analysieren. Dieses Protokoll kann auf andere Membranproteine ausgeweitet werden.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Vor kurzem wurde eine Reihe von FRET-basierten Kraft-Biosensoren entwickelt, die die proteinspezifische Auflösung der intrazellulären Kraft ermöglichen. In diesem Protokoll zeigen wir, wie einer dieser Sensoren, der für den Linker des Nukleoskelett-Zytoskelett (LINC)-Komplexproteins Nesprin-2G entwickelt wurde, zur Messung von Aktomyosinkräften auf den nukleären LINC-Komplex verwendet werden kann.

Ein Protokoll für die Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -force Biosensoren mechanische Kräfte über den Kern LINC-Komplex zu messen

Dieses Protokoll beschreibt einen Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie basierende Ansatz zur Untersuchung von Interaktionen zwischen den Proteinen, die Vermittlung von Zell-Zell-Interaktionen, d.h. Proteine in der Zelle Verzweigungen direkt in lebenden Zellen lokalisiert. Wir bieten detaillierte Richtlinien auf Kalibrierung, Datenerfassung und -Analyse, einschließlich Korrekturen möglich Artefakt Quellen.

Eine Fluoreszenz Fluktuation Spektroskopie Assay von Protein-Protein-Wechselwirkungen an den Zell-Zell-Kontakten

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die gleichzeitige Verwendung von Förster Resonance Energy Transfer-basierte Spannung Sensoren zur Messung der Belastung und Fluoreszenz Proteingewinnung nach Immunofluoreszenz Proteindynamik ermöglichen die Messung der Kraft-und Kleinschreibung messen Proteindynamik innerhalb von lebenden Zellen.

Messung von Kraft-und Kleinschreibung Proteindynamik in lebenden Zellen mit einer Kombination von fluoreszierenden Techniken

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Messung der Adenin-Nukleotid-Bindung an Rezeptoren in Echtzeit in einer zellulären Umgebung vor. Die Bindung wird als Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen Trinitrophenylnukleotidderivaten und Proteinen, die mit einer nicht-kanonischen, fluoreszierenden Aminosäure markiert sind, gemessen.

Messung der Nukleotidbindung an intakte, funktionelle Membranproteine in Echtzeit

Wir präsentieren ein experimentelles Protokoll und einen Datenanalyse-Workflow zur Durchführung der zweifarbigen Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) in Kombination mit Förster Resonance Energy Transfer (FRET), um die Membranrezeptordynamik in lebenden Zellen mit modernen Fluoreszenzmarkierungstechniken zu untersuchen.

Zweifarbige Fluoreszenz-Kreuzkorrelationsspektroskopie zur Untersuchung der Protein-Protein-Interaktion und Proteindynamik in lebenden Zellen

Hier beschreiben wir eine Reihe von Methoden zur Charakterisierung der Interaktion von Proteinen mit Membranen von Zellen oder Mikrovesikeln.

Analyse der Wechselwirkung fluoreszierend markierter Proteine mit künstlichen Phospholipid-Mikrovesikeln mittels quantitativer Durchflusszytometrie

Erfahren Sie die Fluoreszenz-Biomembran-Kraftsonden-Technik zur gleichzeitigen Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Calcium-Signalgebung in einzelnen T-Lymphozyten. Diese Methode ermöglicht präzise Einzelzellanalysen.

Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell (Video) | JoVE Journal

Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell

Weitere Videos entdecken