Fluoreszenz Biomembrane Kraft Sonde: Concurrent Quantifizierung von Rezeptor-Ligand-Kinetik und Binding-induzierte intrazelluläre Signaling auf Einzelzell

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, gleichzeitig die rezeptorähnliche und -bindung zu messen und die bindungsinduzierte Kalziumsignalgebung an einer einzelnen Zelle zu beobachten. Dies wird erreicht, indem zunächst Biotin isoliert und die Osmolarität der menschlichen roten Blutkörperchen (RBCs) so eingestellt wird, dass sie als hochempfindlicher Kraftaufnehmer verwendet werden. Der zweite Schritt ist die Funktionalisierung von mikroskaligen Glasperlen, die Reinigung, Dilatation und Ligandenbeschichtung umfasst.

Anschließend werden die T-Zellen isoliert und mit dem Kalziumfarbstoff weniger inkubiert, 2:00 Uhr, was die Beobachtung der intrazellulären Kalziumionenkonzentration ermöglicht. Der letzte Schritt ist die Vorbereitung der Mikropipetten in der Experimentierkammer, die speziell für den Versuchsaufbau benötigt werden. Letztendlich wird die Fluoreszenz-Biomembran-Kraftsonde oder BFP-Technik verwendet, um die Adhäsion einer Zelle an einem ligandenbeschichteten Kügelchen zu zeigen, die Bindungskinetik der Rezeptorliganden zu messen und in der Zwischenzeit den intrazellulären Kalziumspiegel zu überwachen.

Diese Technik ist nützlich, um zu verstehen, wie mechanische Kraft von T-Zellen über die Androgenerkennung wahrgenommen wird. Ein großer Vorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden besteht darin, dass FBIP die Bindungskinetik von Rezeptorliganden und eine intrazelluläre Signalübertragung gleichzeitig messen kann. Zu den herausfordernden Teilen dieses Protokolls gehören die manuelle Herstellung von Mikro-PEP-Pfaden mit den richtigen Durchmessern, das Aufnehmen von Zellen und Bienen mit Mikro-PEPs und das Zusammenbauen der Kraftsonde, die zunächst versagen kann, obwohl er bei der Demonstration dieses Videos nicht hier sein konnte.

Co-Autor Arnold G, der kürzlich seine Doktorarbeit in meinem Labor abgeschlossen hat, hat wesentlich zur ersten Validierung des FBAP-Protokolls beigetragen. Gewinnen Sie acht bis 10 Mikroliter Blut aus einem Fingerstich und fügen Sie zu einem Milliliter Karbonatbikarbonat hinzu, puffern Sie den Strahl, lassen Sie den Vortex oder pipettieren Sie die Mischung und zentrifugieren Sie sie eine Minute lang bei 900 G. Entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie den Karbonatbikarbonatpuffer durchführen. Noch einmal waschen.

Mischen Sie anschließend 10 Mikroliter der resultierenden RBC-Packung, 171 Mikroliter Karbonat-Bicarbonat-Puffer und 1049 Mikroliter Biotin. PEG NHS Linkerlösung und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Bei Verwendung der gleichen Waschverfahren vor dem Waschen des resultierenden RBC-Gemischs einmal mit Karbonatbikarbonatpuffer und dann zweimal mit N zwei 5%-Puffer gewaschen.

Als nächstes verdünnen Sie Nystatin in N zwei 5% Puffer. Um eine Endkonzentration von 40 Mikrolitern pro Milliliter zu erreichen, mischen Sie fünf Mikroliter der biotinylierten Erythrozyten mit 71,4 Mikrolitern Nystatinlösung und inkubieren Sie eine Stunde lang bei null Grad Celsius. Waschen Sie abschließend die Proben zweimal mit N zwei 5 % Puffer und lagern Sie die biotinylierten RBC mit N zwei 5 % Puffer plus 0,5 % BSA im Kühlschrank. Montieren Sie ein Stück einer drei Zoll großen Mikropipette auf den Mikropipettenabzieher.

Klicken Sie auf den Zugknopf, so dass die Mitte der Kapillare von der Maschine erhitzt wird und die Kapillare an den beiden Enden gezogen wird, um zwei Kapillaren mit scharfen Spitzen zu erhalten, die die Rohpipetten sind. Montieren Sie als Nächstes eine Rohpipette auf den Pipettenhalter der Mikropipette Forge Heat, um die Glaskugel auf der Schmiede zu schmelzen. Führen Sie die Spitze der Rohpipette in die Glaskugel ein.

Kühle die Glaskugel ab und ziehe die rohe Pipette, um sie von außen zu brechen, wobei die Spitze in der Kugel bleibt. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die gewünschte Spitzenöffnung erreicht ist, um die Zellkammer zu bauen: Schneiden Sie zuerst mit einem Glasschneider auf einen 40 Millimeter x 22 Millimeter x 0,2 Millimeter großen Deckglas in zwei 40 Millimeter x 11 Millimeter x 0,2 Millimeter große Stücke. Die Zellkammer ist auf dem Fundament eines selbstgebauten Kammerhalters aufgebaut, der aus zwei Teilen Metallquadraten und einem Griff besteht, der sie miteinander verbindet.

Kleben Sie mit Gnadenkleber einen Deckglas so an die Unterseite des Kammerhalters, dass er die beiden Metallquadrate überbrückt. Kleben Sie auf ähnliche Weise den anderen Deckglas auf die Oberseite, wodurch eine parallele Deckglaszellenkammer entsteht. Injizieren Sie anschließend mit der Pipette 200 Mikroliter experimentellen Puffer zwischen die beiden Deckgläser.

Stellen Sie sicher, dass der Puffer an beiden Deckgläsern befestigt ist. Drehen und schütteln Sie die Kammer vorsichtig, damit der Puffer beide Enden der Kammer berührt. Spritzen Sie dann vorsichtig Mineralöl in beide Seiten der Kammer ein, flankieren Sie die experimentelle Pufferzone und dichten Sie so den Puffer gegen die Luft ab.

Injizieren von Suspensionen von Prob. Beads sind BCs und Ziele im oberen, mittleren bzw. unteren Bereich der Pufferzone. Um das BFP-Experiment zu starten, schalten Sie das Mikroskop und die Lichtquelle ein.

Stellen Sie die Kammer auf den Hauptmikroskoptisch. Der nächste Schritt besteht darin, alle drei Mikropipetten des BFP zu installieren. Die Sonde auf der linken Seite dient zum Greifen von A RBC.

Das Ziel auf der rechten Seite ist es, die Zelle zu greifen, und der Helfer unten rechts dient dazu, eine Perle zu greifen, um sie zu installieren, verwenden Sie einen Mikroinjektor, um eine Mikropipette mit experimentellem Puffer zu füllen. Nehmen Sie die Mikropipette vom Pipettenhalter und halten Sie sie an eine niedrigere Stelle, damit die Flüssigkeit aus der Spitze tropfen kann. Führen Sie die Mikropipette schnell in die Halterspitze ein und stellen Sie sicher, dass keine Luftblase in die Mikropipette gelangt.

Ziehen Sie während des Einsetzens die Halterschraube fest und montieren Sie dann jeden Pipettenhalter auf den entsprechenden Mikromanipulator. Schieben Sie die Mikropipette in Richtung der Kammer, so dass ihre Spitzen in den Pufferbereich der Kammer gelangen. Stellen Sie eine Position der Mikropipette ein und finden Sie sie unter dem Sichtfeld des Mikroskops.

Bewege dich in der Phase des Kammerhalters, um die Kolonien der drei Elemente zu finden. Passen Sie nacheinander die Position der entsprechenden Mikropipette an, indem Sie die Knöpfe der Manipulatoren drehen, um die Spitze der Mikropipette einer Zelle oder einem Kügelchen nähern zu lassen, und saugen Sie die Zelle oder den Kügelchen ab. Durch Einstellen des Drucks in der entsprechenden Mikropipette erfassen alle drei Mikropipetten die entsprechenden Elemente.

Bewegen Sie sich um die Kammerhalterbühne herum, um einen offenen Raum abseits der Kolonien der injizierten Elemente zu finden, in dem das Experiment durchgeführt wird. Schalten Sie den visuellen Modus des Mikroskops um, um das Bild im Computerprogramm zu visualisieren. Bewegen Sie alle drei Elemente auf den Pipettenspitzen in das Sichtfeld des Programms.

Richten Sie als Nächstes die Sondenperle und die Erythrozytenleiste aus und manövrieren Sie die Sondenraupe vorsichtig zur Spitze der Erythrox. Schlagen Sie nun die Perle kurz auf die RBC und ziehen Sie sie vorsichtig zurück, passen Sie den Druck der Hilfsmikropipette so an, dass die Perle sanft weggeblasen wird, so dass sie auf der RBC-Spitze kleben bleibt. Bewegen Sie die Hilfspipette weg und richten Sie das Ziel und die Promille auf dem Programm aus.

Messen Sie im Sichtfeld-Fenster mit den Programmwerkzeugen die jeweiligen Radien der Sondenmikropipette, den RBC und die kreisförmige Kontaktfläche zwischen RBC und Sondenperle. Diese Werte ermöglichen die Abschätzung der Federkonstante des RBC anhand der im Textprotokoll aufgeführten Gleichung. Nachdem Sie die gewünschte RBC-Federkonstante in das Programm eingegeben haben, zeichnen Sie eine horizontale Linie über den RBC-Scheitelpunkt, die im angrenzenden Fenster eine Kurve ergibt, die die Helligkeit jedes Pixels anzeigt.

Ziehen Sie die Schwellenwertlinie entlang dieser Linie, sodass sie etwa halb so tief wie die Kurve ist. Wählen Sie als Nächstes den gewünschten Experimentmodus aus, den thermischen Fluktuationsassay, den Adhäsionsfrequenz-Assay oder den Force-Clamp-Assay. Stellen Sie die Parameter wie gewünscht ein.

Klicken Sie auf Start, der es dem Programm ermöglicht, die Zielpipette zu bewegen und das Ziel in und aus dem Kontakt mit der Sonde zu fahren. Die Datenerfassung wird durchgeführt und parallel, wodurch die Position des Pro-Beads in Echtzeit aufgezeichnet wird. Stoppen Sie das Programm, indem Sie auf die Schaltfläche Experiment stoppen klicken, woraufhin ein Fenster herausspringt. Um das Speichern der erfassten Daten zu ermöglichen, schaltete das BFP-System die Anregungslichtquelle und die Fluoreszenzkamera ein, die von einem separaten Programm gesteuert werden.

Wählen Sie dann die Parameter für die Fluoreszenzbildgebung aus, einschließlich Verstärkungsbelichtung und Anregungskanäle. Befolgen Sie alle Vorbereitungen im BFP-Experimentprotokoll, einschließlich der Ausrichtung der Sonde und des Targets, um die Visualisierung des Live-Fluoreszenzbildes der Zielzelle zu ermöglichen, das durch 340 Nanometer oder 380 Nanometer Anregungslicht angeregt wird. Verwenden Sie das Schnittwerkzeug, um den Bereich, in dem sich die Zelle während des gesamten Aufnahmezeitraums befindet, grob zu unterteilen.

Klicken Sie anschließend gleichzeitig auf Aufnahme und beginnen Sie zu klicken. Record ermöglicht es, dass ein 340-Nanometer- und ein 380-Nanometer-Licht abwechselnd den intrazellulären Fluoreszenzchip anregen. Ein Paar entsprechender Fluoreszenzbilder wird abwechselnd etwa einmal pro Sekunde aufgenommen.

Wenn Sie auf Start klicken, beginnt das BFP-Experiment zur Analyse der molekularen Interaktion und das Fluoreszenzbildgebungsexperiment zur Überwachung der intrazellulären Kalziumsignalgebung, und fahren Sie mit der Analyse der Daten fort, wie im Textprotokoll beschrieben. In Zeitkraft-Rohdatenkurven wird die Kraft aus der Verfolgung der Positionsänderung des Pro-Wulstes abgeleitet. Bei einem Ereignis ohne Adhäsion kehrt die Kraft im Zeitsignal für die Kraftumkehr auf Null zurück, nachdem die Zielzelle von der Perlenoberfläche zurückgezogen wurde.

Umgekehrt manifestiert sich bei einem Bruchkraftereignis die Adhäsion durch eine schnelle Anhebung der Kraft auf ein positives Niveau während des Rückzugs, gefolgt von einem schnellen Abfall zurück auf Null. In einem Lebensereignis wird die positive Kraft geklemmt, um ein Plateau zu realisieren. Die Länge des Plateaus beträgt ein ganzes Leben.

Durch wiederholtes Durchführen von VFP-Experimentzyklen wird eine Kraft-Zeit-Kurve abgeleitet. Hier sind die Fluoreszenzbilder von ein paar oder zwei geladenen T-Zellen bei Anregung durch 340 Nanometer und 380 Nanometer Lichtkanäle zu sehen. Beide Bilder zeigen klare Konturen der Zelle, was darauf hindeutet, dass die Zelle gut gefärbt wurde. Nachdem die Daten zur Bindungskinetik und die Fluoreszenzdaten von einer T-Zelle abgeleitet wurden, sind sowohl die kumulative Lebensdauerkurve als auch die Kalziumspiegelkurve in derselben Abbildung dargestellt, um die Korrelation zwischen ihnen zu finden.

Jetzt sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das A-F-B-I-P-Experiment durchführt. Während dieses Vorgangs. Es ist wichtig, daran zu denken, zu überprüfen, ob die Kraftsonde einen Defekt aufweist, wie z. B. den Durchmesser der Mikropipette, die Länge des Vorsprungs der Gummizelle und die Position der Perle.

All dies wirkt sich auf die Genauigkeit der Kraftmessung aus. Diese Technik ebnet Forschern auf dem Gebiet der molekularmechanischen Biologie den Weg, den Mechanismus der mechanischen Transduktion in allen möglichen biologischen Systemen zu untersuchen.