Ein Allel-spezifische Gene Expression Assay zur Funktionsanalyse Grundlage genetischer Verbände testen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, zu testen, ob eine bestimmte DNA-Variante, wie z. B. eine mit der Krankheit assoziierte, einen Einfluss auf die Expression eines bestimmten Gens hat. Dies wird durch die Auswahl von Zelllinien erreicht, die sowohl für diese Variante als auch für einen kodierenden Schnitt im interessierenden Gen heterozygot sind. In einem zweiten Schritt werden DNA und RNA aus den Zellen extrahiert und dann als Template für eine allelspezifische primäre Extensionsreaktion verwendet.

Als nächstes werden primäre Verlängerungsprodukte massenspektrometrisch analysiert, um die relative Häufigkeit der beiden Allele zu quantifizieren. Es werden Ergebnisse erhalten, die zeigen, ob die ursprüngliche DNA-Variante, die mit einer Krankheit assoziiert ist, auch mit einer Differenz in der Genexpression verbunden ist, basierend auf quantitativen allelspezifischen Messungen mittels Massenspektrometrie. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie im Gegensatz zu einem Luciferase-Genassay keine molekulare Manipulation erfordert und das endogene Niveau der Genexpression misst.

Darüber hinaus sind wir in der Lage, die Expressionsniveaus zwischen den beiden Allelen auf intern kontrollierte Weise zu vergleichen, wodurch ein Teil der experimentellen Variabilität beseitigt wird. Diese Methode hilft uns, zentrale Fragen im Bereich der Humangenetik zu beantworten, wie z.B. die molekularen Mechanismen, die genetischen Assoziationen zugrunde liegen. Wir haben die Idee zu dieser Methode entwickelt, als wir eine genetische Assoziation identifizierten, die sich über drei Gene erstreckte, und ein Signal nicht auf ein einzelnes Gen verfeinern konnten.

Durch weitere genetische Kartierung. Die für diesen Assay verwendeten Zellen sollten das interessierende Gen exprimieren und zwei grundlegende genotypische Anforderungen erfüllen. Sie müssen sowohl für die DNA-Sequenzen, die mit der Krankheit assoziiert sind, als auch für DNA-Marker heterozygot sein, die Transkripte anhand ihres chromosomalen Ursprungs unterscheiden können. In der hier gezeigten Zelllinien-Auswahlstrategie sind die Zelllinien A und B, A heterozygot für einen transkribierten kodierenden Marker, der durch Dreiecke dargestellt wird.

Die Omnicell-Linie A ist jedoch heterozygot für die DNA-Sequenz, die mit der Krankheit assoziiert ist und als Risiko-DNA-Variante bezeichnet wird, die durch Kreise dargestellt wird. Das blaue Allel der Risikovariante ist mit einem niedrigeren Transkriptionsniveau assoziiert Nach der Auswahl der Zelllinienkultur, der Zellen in einem Kolben nach den Vorgaben des Lieferanten, verwenden wir in dieser Demonstration Fibroblasten. Obwohl dieser Assay gleichermaßen auf andere Zelltypen, einschließlich Primärzellen, anwendbar ist, bereiten Sie zwei 10-Zentimeter-Petrischalen für DNA- bzw. RNA-Extraktionen vor.

Wenn Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen, können sie für DNA- und RNA-Extraktionen mit Standardmethoden geerntet werden, einschließlich kommerziell erhältlicher Kits, die für den ausgewählten Zelltyp geeignet sind. I Vor der Durchführung dieses Assays wurden zwei Paare von PCR-Primern für jeden DNA-Marker entworfen, ein Paar für die genomische DNA-Amplifikation und das andere für die CDNA-Amplifikation, Vorwärts- und Rückwärtsprimer für die CDNA-Amplifikation in verschiedenen Exons platziert, um eine genomische Kontamination zu vermeiden; Design-Primer, um ein PCR-Produkt im Bereich von 100 bis 500 Basenpaaren Länge für jede Zelllinie zu erhalten; acht Mikroliter-PCR-Reaktionen vorbereiten. Jedes Mal vier unabhängige Reaktionen für die genomische DNA-Amplifikation und jeweils vier unabhängige Reaktionen für die CDNA-Amplifikation.

Mikro, das mit der PCR-Reaktion in Verbindung steht, enthält MLA's Tack dn, NTPs-Primer, Magnesiumchlorid und entweder genomische DNA oder CD NA. Führen Sie die PCR-Reaktionen unter den für jedes Primerpaar optimierten Bedingungen durch, wobei die Zyklusnummer in der linearen Phase der Amplifikation gehalten wird. Sobald die PCR-Reaktionen abgeschlossen sind. Entfernen Sie PCR-Primer und überschüssiges DN TPS, indem Sie jedem PCR-Produkt Exonuklease One und Garnelen-Alkali-Phosphatase SAP hinzufügen und 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, gefolgt von 15 Minuten bei 85 Grad Celsius.

Spotten Sie jedes PCR-Produkt zweimal auf einer 384-Well-Platte, so dass für jede Probe acht Messungen verfügbar sind. Insgesamt 16 Spots für den primären Verlängerungsassay. Entwerfen Sie den Verlängerungsprimer mit der Assay-Design-Software so, dass derselbe Primer sowohl für genomische als auch für C-D-N-A-P-C-R-Produkte verwendet werden kann.

Geben Sie die Primerlänge im Bereich von 14 bis 18 Basenpaaren an. Die primäre Verlängerungsreaktion wird mit der entsprechenden Mischung aus drei Desoxynukleotid-Terminatoren und einem Desoxynukleotid durchgeführt. Eine typische primäre Verlängerungsreaktion umfasst einen Startschritt bei 94 Grad Celsius für zwei Minuten, gefolgt von 40 Zyklen von 94 Grad Celsius für fünf Sekunden, 52 Grad Celsius für fünf Sekunden und 72 Grad Celsius für fünf Sekunden.

Schließlich werden die erweiterten Oligonukleotide durch matrixgestützte Laserdesorptionsionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie mit einem Spektro-Reader-Massenspektrometer quantifiziert. Ein wichtiger Punkt dieses Protokolls besteht darin, verschiedene Strategien zur Kontrolle des experimentellen Rauschens zu verwenden, um Artefakte auszurollen. Es ist wirklich wichtig, das Experiment mindestens dreimal zu wiederholen.

Die beste Kontrolle für das Experiment ist die Verwendung einer Zelllinie, die heterozygot für den Coating-Snip-Assay für die primäre Verlängerung ist, aber nicht das krankheitsassoziierte Allel trägt. Darüber hinaus entwerfen Sie Assays für alternative DNA-transkribierte kodierende Marker. Wenn diese nicht verfügbar sind, kann eine zusätzliche Kontrolle durch alternative PCR-Primerpaare bereitgestellt werden, die auf unterschiedliche Exons für den primären Extensionsassay abzielen.

Eine interne Kontrolle kann durch die Konstruktion von Verlängerungsprimern und das Knien sowohl an den Vorwärts- als auch am Rückwärtsstrang gewährleistet werden. Ein Beispiel für die allelspezifische Expressionsanalyse wird hier mit Beispielen von Massenspektrometrie-Spuren gezeigt. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse der Analyse von vier Allel-spezifischen primären Erweiterungsprodukten, die an vier verschiedenen Templates durchgeführt wurde.

Die oberen beiden Diagramme zeigen die Ergebnisse der Analyse der genomischen DNA von zwei verschiedenen Zelllinien, die beide heterozygot für einen transkribierten kodierenden Polymorphismus sind. Allerdings ist nur die Zelllinie A heterozygot für die Risiko-DNA-Varianz. Diese beiden unteren Diagramme stellen die Ergebnisse dar, die aus der Analyse der CDNA gewonnen wurden, die aus denselben Zelllinien als Ergebnis eines experimentellen Artefakts erzeugt wurde.

Der erste Peak ist immer höher als der zweite, auch in der Genomanalyse. Daher werden die Ergebnisse aus der Genomanalyse verwendet, um die CDNA-Daten zu normalisieren. Die statistische Analyse wird durchgeführt, indem der gesamte ELO-Typisierungsbericht innerhalb des Massen-Array-Softwaretyps extrahiert wird.

Dieser Bericht liefert Daten über den Peakbereich, und wir zeigen hier ein Beispiel relativ zu zwei Zelllinien, Zelle A und Zelle B heterozygot für einen kodierenden Snip, aber bei der nur Zelle A heterozygot für einen krankheitsassoziierten Marker ist. Die Säulen, die Holz in Grau verlegen, werden direkt von der Software generiert, während die Säulen, die Holz in Grün verlegen, für jede Zelle manuell abgeleitet werden. Es gibt acht Messungen sowohl für die CDNA als auch für die genomische DNA.

Die Software berechnet die Fläche unter jedem Spektralpeak, die die Häufigkeit jedes der beiden Allele darstellt. Das Allelverhältnis wird berechnet, indem die Fläche des Allels eins durch die Fläche des Allels zwei für jede CDNA und genomische Probe dividiert wird. Über die acht Messungen werden ein Mittelwert und ein Standardfehler berechnet.

Ein hoher Standardfehler größer als 0,1 weist darauf hin, dass die Messungen nicht konsistent sind und ignoriert werden sollten. Schließlich wird das mittlere Verhältnis von CDNA unter Verwendung des mittleren Verhältnisses der genomischen DNA normalisiert, um die Abweichung von einem Verhältnis von eins zu schätzen, die erwartet wird, wenn es keinen Unterschied in der allelspezifischen Expression gibt. Das normalisierte Verhältnis unterscheidet sich von dem in Zelle A, aber nahe dem in Zelle B, die Daten deuten darauf hin, dass Zelllinie A eine DNA-Variante in Phase mit dem Allel trägt, das durch den zweiten Peak gemessen wird, was die Expression des zu analysierenden Gens reduziert.

Zelllinie B bietet eine sehr komfortable Negativkontrolle. Bei diesem Versuch ist es sehr wichtig, informative genetische Varianten zu definieren und geeignete experimentelle Kontrollen zu definieren. Andere Methoden können verwendet werden, wie z. B. Haplotyp, spezifische Chromatin-Immunpräzipitation, die Ihnen helfen, Fragen zu beantworten, z. B. wo es genetische Varianten gibt, für die es keine transkribierten Marker gibt, die zur Analyse der allelspezifischen Genexpression verwendet werden können.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man RNA auf allelspezifische Weise analysiert und wie man dies zum Verständnis genetisch wichtiger Funktionsvarianten nutzen kann.