Ein Allel-spezifische Gene Expression Assay zur Funktionsanalyse Grundlage genetischer Verbände testen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin zu prüfen, ob eine bestimmte DNA-Variante, beispielsweise eine mit der Krankheit assoziierte, einen Einfluss auf die Expression eines bestimmten Gens hat. Dies wird erreicht, indem Zelllinien ausgewählt werden, die für diese Variante und einen kodierenden SNP im Gen von Interesse heterozygot sind. In einem zweiten Schritt werden DNA und RNA aus den Zellen isoliert und anschließend als Vorlage für eine allelespezifische primäre Verlängerungsreaktion verwendet.

Die primären Erweiterungsprodukte werden anschließend mittels Massenspektrometrie analysiert, um die relative Häufigkeit der beiden Allele zu quantifizieren. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, ob die ursprüngliche DNA-Variante, die mit einer Erkrankung assoziiert ist, ebenfalls mit einer Differenz in der Genexpression verbunden ist, basierend auf quantitativen, allelespezifischen Messungen durch Massenspektrometrie. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass im Gegensatz zu einem Luciferase-Reportergen-Assay keine molekulare Manipulation erforderlich ist und dass die endogenen Genexpressionsniveaus gemessen werden.

Außerdem können wir die Expressionsniveaus zwischen den beiden Allelen auf intern kontrollierte Weise vergleichen, wodurch eine gewisse experimentelle Variabilität eliminiert wird. Diese Methode hilft uns, zentrale Fragen auf dem Gebiet der Humangenetik zu beantworten, beispielsweise die molekularen Mechanismen, die genetischen Assoziationen zugrunde liegen. Die Idee zu dieser Methode entwickelten wir erstmals, als wir eine genetische Assoziation identifizierten, die sich über drei Gene erstreckte, und das Signal nicht auf ein einzelnes Gen eingrenzen konnten.

Durch weitere genetische Kartierung. Die für diesen Assay verwendeten Zellen sollten das Gen von Interesse exprimieren und gleichzeitig zwei grundlegende genotypische Voraussetzungen erfüllen. Sie müssen sowohl für die mit der Krankheit assoziierten DNA-Sequenzen als auch für DNA-Marker heterozygot sein, wodurch Transkripte anhand ihres chromosomalen Ursprungs unterschieden werden können. Bei der hier gezeigten Strategie zur Zelllinienauswahl sind die Zelllinien A und B, wobei A heterozygot für einen transkribierten kodierenden Marker ist, dargestellt durch Dreiecke.

Jedoch ist die Omnicell-Linie A für die mit der Krankheit assoziierte DNA-Sequenz, die als Risiko-DNA-Variante bezeichnet wird und durch Kreise dargestellt ist, heterozygot. Das blaue Allel der Risikovariante ist mit einem niedrigeren Transkriptionsniveau assoziiert. Nach der Auswahl der Zelllinienkultur kultivieren wir die Zellen in einem Kolben gemäß den Angaben des Herstellers; in dieser Demonstration verwenden wir Fibroblasten. Obwohl dieses Assay auch auf andere Zelltypen, einschließlich primärer Zellen, gleichermaßen anwendbar ist, bereiten Sie jeweils zwei 10-Zentimeter-Petri-Schalen für die DNA- und RNA-Extraktion vor.

Wenn die Zellen eine Konfluenz von 80 % erreichen, können sie mithilfe standardisierter Methoden, einschließlich kommerziell erhältlicher Kits, die für den gewählten Zelltyp geeignet sind, zur DNA- und RNA-Isolierung geerntet werden. Zuvor sollten für diesen Assay zwei Paare von PCR-Primern für jeden DNA-Marker entworfen werden, ein Paar zur Amplifikation der genomischen DNA und ein weiteres zur Amplifikation der cDNA; dabei sollten die Vorwärts- und Rückwärtsprimer für die cDNA-Amplifikation in unterschiedlichen Exons platziert werden, um genomische Kontamination zu vermeiden. Die Primer sollten so gestaltet sein, dass ein PCR-Produkt mit einer Länge zwischen 100 und 500 Basenpaaren für jede Zelllinie erhalten wird. Bereiten Sie acht Mikroliter-PCR-Ansätze vor: jeweils vier unabhängige Ansätze zur Amplifikation der genomischen DNA und vier unabhängige Ansätze zur Amplifikation der cDNA.

Mikro im Zusammenhang mit der PCR-Reaktion enthält MLA-Tack-dn, NTPs, Primer, Magnesiumchlorid und entweder genomische DNA oder CD-NA. Führen Sie die PCR-Reaktionen unter für jedes Primerpaar optimierten Bedingungen durch, wobei die Anzahl der Zyklen in der linearen Phase der Amplifikation gehalten wird. Sobald die PCR-Reaktionen abgeschlossen sind, entfernen Sie die PCR-Primer und überschüssige dNTPs, indem Sie Exonuclease I und Shrimp-Alkalische Phosphatase (SAP) zu jedem PCR-Produkt hinzufügen und 20 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubieren, gefolgt von 15 Minuten bei 85 Grad Celsius.

Tragen Sie jedes PCR-Produkt zweimal auf eine 384-Well-Platte auf, sodass acht Messungen für jede Probe verfügbar sein werden. Insgesamt 16 Aufträge für den primären Extensionsassay. Gestalten Sie den Extensionsprimer mit der Assay-Design-Software so, dass derselbe Primer sowohl für genomische als auch für cDNA-PCR-Produkte verwendet werden kann.

Geben Sie die Primerlänge im Bereich von 14 bis 18 Basenpaaren an. Führen Sie die primäre Verlängerungsreaktion mit einer geeigneten Mischung aus drei Desoxynukleotidterminatoren und einem Desoxynukleotid durch. Eine typische primäre Verlängerungsreaktion umfasst einen Startschritt bei 94 Grad Celsius für zwei Minuten, gefolgt von 40 Zyklen mit jeweils fünf Sekunden bei 94 Grad Celsius, fünf Sekunden bei 52 Grad Celsius und fünf Sekunden bei 72 Grad Celsius.

Schließlich werden die verlängerten Oligonukleotide mittels Matrix-unterstützter Laserdesorptions-Ionisations-Massenspektrometrie mit Flugzeitanalyse unter Verwendung eines Spectro-Reader-Massenspektrometers quantifiziert. Ein entscheidender Aspekt dieses Protokolls besteht darin, mehrere Strategien anzuwenden, um experimentelle Störgrößen zu kontrollieren und Artefakte auszuschließen. Es ist äußerst wichtig, das Experiment mindestens dreimal zu wiederholen.

Die beste Kontrolle für das Experiment besteht darin, eine Zelllinie zu verwenden, die für den Coating-Snip-Assay für die primäre Extension heterozygot ist, jedoch nicht das krankheitsassoziierte Allel trägt. Zusätzlich sollten Assays für alternative, kodierende DNA-Marker, die transkribiert werden, konzipiert werden. Falls diese nicht verfügbar sind, kann eine zusätzliche Kontrolle durch alternative PCR-Primerpaare erreicht werden, die auf verschiedene Exons für den Assay der primären Extension abzielen.

Ein interner Kontrollwert kann durch das Design von Verlängerungsprimern und die Bindung an beide Stränge, den vorwärts- und rückwärtslaufenden, erreicht werden. Hier wird ein Beispiel einer allelspezifischen Expressionsanalyse mit Beispielen von Massenspektrometrie-Spektren gezeigt. Diese Abbildung zeigt die Ergebnisse der Analyse von vier allelspezifischen primären Verlängerungsprodukten, die an vier verschiedenen Matrizen durchgeführt wurden.

Die oberen beiden Diagramme zeigen die Ergebnisse, die aus der Analyse der genomischen DNA von zwei verschiedenen Zelllinien erhalten wurden, wobei beide Zelllinien für eine transkribierte kodierende Polymorphie heterozygot sind. Allerdings ist nur die Zelllinie A für die Risiko-DNA-Variante heterozygot. Diese unteren beiden Diagramme zeigen die Ergebnisse, die aus der Analyse der cDNA gewonnen wurden, die aus denselben Zelllinien gewonnen wurde, als Folge eines experimentellen Artefakts.

Der erste Peak ist immer höher als der zweite Peak, auch bei der genomischen Analyse. Daher werden die Ergebnisse der genomischen Analyse verwendet, um die cDNA-Daten zu normalisieren. Die statistische Analyse erfolgt durch Extraktion des gesamten ELO-Typing-Berichts innerhalb der Massen-Array-Software.

Dieser Bericht liefert Daten zur Peakfläche, und hier zeigen wir ein Beispiel, das sich auf zwei Zelllinien bezieht, Zelle A und Zelle B, die heterozygot für eine kodierende SNV sind, wobei jedoch nur Zelle A heterozygot für einen krankheitsassoziierten Marker ist. Die in grau markierten Spalten werden direkt von der Software generiert, während die in grün markierten Spalten für jede Zelle manuell abgeleitet werden. Es liegen acht Messungen sowohl für die cDNA als auch für die genomische DNA vor.

Die Software berechnet die Fläche unterhalb jedes Spektrumspikes, die die Häufigkeit jedes der beiden Allele repräsentiert. Das Allelverhältnis wird berechnet, indem die Fläche des ersten Allels durch die Fläche des zweiten Allels für jede cDNA- und genomische Probe geteilt wird. Ein Mittelwert und der Standardfehler werden über die acht Messungen hinweg berechnet.

Ein hoher Standardfehler von mehr als 0,1 weist darauf hin, dass die Messungen nicht konsistent sind und daher verworfen werden sollten. Abschließend wird das cDNA-Mittelwertsverhältnis unter Verwendung des genomischen DNA-Mittelwertsverhältnisses normalisiert, um die Abweichung von einem Verhältnis von eins abzuschätzen, das erwartet wird, wenn kein Unterschied in der allelespezifischen Expression vorliegt. Das normalisierte Verhältnis weicht in Zelle A von eins ab, liegt aber in Zelle B nahe bei eins; die Daten legen nahe, dass die Zelllinie A eine DNA-Variante in Phasenkopplung mit dem durch den zweiten Peak gemessenen Allel trägt, die die Expression des analysierten Gens vermindert.

Die Zelllinie B bietet eine sehr praktische negative Kontrolle. Es ist äußerst wichtig, informative genetische Varianten zu definieren und geeignete experimentelle Kontrollen festzulegen, wenn man dieses Verfahren durchführt. Nach diesem Verfahren können auch andere Methoden angewendet werden, wie beispielsweise die haplotypenspezifische Chromatin-Immunpräzipitation, die dabei helfen, Fragen zu beantworten, beispielsweise wo genetische Varianten vorliegen, für die keine transkribierten Marker zur Analyse der allelspezifischen Genexpression zur Verfügung stehen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man RNA auf allelspezifische Weise analysiert und wie man dies nutzen kann, um genetisch wichtige funktionelle Varianten zu verstehen.