Membranpotentiale, Synaptic Responses, neuronalen, Neuromodulation und Muscle Histologie Mit dem Crayfish: Schülerlabor Übungen

Das übergeordnete Ziel der folgenden Experimente ist es, die Eigenschaften erregbarer Membranen und die ionische Basis des ruhenden Membranpotentials zu verstehen und Methoden zur Messung des Membranpotentials zu erlernen sowie Eigenschaften der synaptischen Übertragung zu demonstrieren. In einem Teil des Experiments wird das Ruhemembranpotential gemessen, während das extrazelluläre Kalium verändert wird. In einem anderen Teil des Experiments werden Mechanismen der synaptischen Differenzierung untersucht, indem stimulierte synaptische Reaktionen in verschiedenen motorischen Einheiten aufgezeichnet werden.

Als nächstes wird ein neuronaler Schaltkreis vorgestellt, der einfach zu warten ist. Dieses Präparat kann sowohl für den Unterricht als auch für die Erforschung verschiedener Aspekte eines sensorischen Schaltkreises zwischen ZNS und Motoneuron und Muskel verwendet werden. Diese Reihe von Experimenten zeigt, wie einfach es ist, das Krebsmodell zu verwenden, um Probleme im Zusammenhang mit der synaptischen Integration und Übertragung des Membranpotenzials sowie strukturellen Unterschieden zwischen Muskelfasertypen zu lösen.

Die Hauptvorteile der Verwendung des Krebspräparats bei der Vermittlung elektrophysiologischer Konzepte und Techniken sind die Leichtigkeit der Dissektion, die Leichtigkeit des Präparats mit minimaler Kochsalzlösung, die Leichtigkeit, synaptische Reaktionen zu erhalten, und die Leichtigkeit, die gesamte anatomische Anordnung der Muskeln zu erkennen. Diese Techniken können auch auf andere Präparate angewendet werden und werden unser Verständnis der synaptischen Physiologie und Modulation sowie der biochemischen und strukturellen Unterschiede in der demonstrierten Zubereitung erweitern. Um die Operation zu beginnen, wählen Sie einen Krebs mit einer Körperlänge von etwa sechs bis 10 Zentimetern aus und legen Sie ihn fünf Minuten lang in zerstoßenes Eis, um ihn zu betäuben, um den Krebs zu enthaupten, halten Sie ihn vom Hinterkopf weg und achten Sie darauf, dass Ihre Finger mit einer großen Schere außerhalb der Reichweite der Krallen und des Mauls des Krebses sind.

Entfernen Sie schnell den Kopf, indem Sie einen sauberen Schnitt hinter den Augen des Krebses machen, entfernen Sie die Beine und Krallen des Krebses, um Verletzungen zu vermeiden. Entfernen Sie die Styles bei den Rüden und die Schwimmer-Ettes bei den Männchen und Weibchen. Entsorgen Sie den Kopf und die Gliedmaßen.

Trennen Sie als Nächstes den Bauch vom Brustkorb, indem Sie einen Schnitt entlang der Gelenkmembran machen, die den Bauch und den Brustkorb verbindet. Bewahren Sie den Bauchteil des Krebses auf und entsorgen Sie den Brustkorb, indem Sie die Schere leicht nach unten zur Bauchseite zeigen und schräg einen Schnitt in die Schale entlang des unteren seitlichen Randes jeder Seite des Bauches machen. Achte darauf, nicht zu tief in die Krebse einzuschneiden.

Folgen Sie mit einer Pinzette dem natürlichen Schalenmuster der Linien der Krebse, die sich über die Länge jedes Segments erstrecken. Entferne den ventralen Teil der Schale, indem du ihn nach oben und hinten ziehst. Achten Sie darauf, die Bauchmuskulatur nicht zu zerstören.

Entferne die Beugemuskulatur. An dieser Stelle ist eine weiße Gewebemasse auf den tiefen Beugemuskeln zu sehen. Entferne dieses Gewebe vorsichtig mit einer Pinzette.

Der Magen-Darm-Trakt ist nun als kleine Röhre sichtbar, die entlang der Mittellinie der tiefen Beugemuskulatur verläuft. Entferne sie, indem du sie mit einer Pinzette oben kneifst und vom Bauch wegziehst. Schneide den unteren Teil des Magen-Darm-Trakts am Ende des Schwanzes ab.

Spülen Sie die Dissektion mit Kochsalzlösung ab, um sicherzustellen, dass Fäkalien die Zubereitung nicht beeinträchtigen. Mit Seziernadeln die obere und untere Ecke des Präparats an eine mit S Guard beschichtete Petrischale stecken. Die Bauchstreckermuskulatur liegt nun frei.

Gießen Sie Kochsalzlösung in die Petrischale, um das Präparat abzudecken, bis intrazelluläre Aufzeichnungen durchgeführt werden. Bringen Sie die Petrischale zum Mikroskop und verwenden Sie Wachs unter der Schale, um zu verhindern, dass sie sich bewegt. Die Apparatur, die für intrazelluläre Aufzeichnungen verwendet wird, ist in dieser Abbildung dargestellt.

Die entsprechenden Anschlüsse und Einstellungen sind im Begleittext angegeben. Richten Sie die Labordiagramm-Software gemäß den Anweisungen ein. Im Begleittext wird das Erdungskabel in das Salzbad eingeführt.

Legen Sie die Spitze einer mit drei molaren Kaliumchlorid gefüllten Mikropipette aus Glas in das Salzbad und testen Sie den Elektrodenwiderstand. Der Elektrodenwiderstand sollte 20 bis 60 Megaohm betragen. Verwenden Sie den groben Knopf am Verstärker, um die Linie auf dem Labordiagramm bei hoher Beleuchtungsintensität auf Null zu verschieben.

Schauen Sie durch das Mikroskop und identifizieren Sie die longitudinalen DEM-Muskeln. Verwenden Sie die Elektrodensonde, um die intrazelluläre Elektrode in eine Muskelfaser des DEM-Muskels einzuführen. Die Elektrode sollte kaum in die Muskelfaser eingeführt werden.

Achte darauf, dass du nicht ganz durch die Zelle dringst. Messen Sie die Amplitude des Ruhepotentials. Ziehen Sie den M-Cursor von der Position in der unteren linken Ecke des Diagrammfensters auf die Ablaufverfolgung.

Platzieren Sie den Marker M auf der Grundlinie und bewegen Sie den Cursor auf den tiefsten Punkt des aufgenommenen Signals. Der Unterschied zwischen der Markierung und dem aktiven Cursor wird oben rechts auf dem Bildschirm angezeigt. Dieser Wert ist die Spannung des ruhenden Membranpotentials.

Teilen Sie die aufgezeichnete Spannung durch die Stärke der Verstärkung, in diesem Fall wurde 10 x Verstärkung verwendet. Wandeln Sie dann die Spannung von Volt in Millivolt um. Nachdem Sie das Ruhepotenzial für diese Muskelfaser aufgezeichnet haben, schauen Sie durch das Mikroskop und entfernen Sie vorsichtig die Elektrode aus der Muskelfaser.

Wiederholen Sie die intrazelluläre Aufzeichnung an anderen Muskelfasern. Im nächsten Teil dieses Experiments wird der Effekt der Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration auf die Ruhemembran beobachtet. Potenziell werden sechs Krebs-Kochsalzlösungen mit Kaliumkonzentrationen von 5,4, 20, 40, 60, 80 und 100 Millimolar verwendet.

Wählen Sie einen Muskel, der nicht zuckt, für die nächste intrazelluläre Aufzeichnung zwischen den Aufnahmen. Ersetzen Sie die Badlösung durch die nächsthöhere Konzentration der Kaliumchloridlösung. Achten Sie darauf, die Zubereitung jedes Mal vollständig abzudecken.

Notieren Sie die Änderungen des Membranpotentials für jede Lösung. Der Effekt der Erhöhung der extrazellulären Kaliumkonzentration, des Membranpotentials, ist in diesem Screen-Capture-Diagramm der Ruhemembranpotentiale für jede Kaliumkonzentration in einem Semi-Log-Diagramm der extrazellulären Kaliumkonzentration im Vergleich zum Membranpotential dargestellt. Richten Sie das Ruhepotential auf 5,4 millimolares extrazelluläres Kalium aus.

Vergleichen Sie für die hypothetischen und die beobachteten Kurven die Steigung der beobachteten Linie mit der Steigung der hypothetischen Linie. Nach Abschluss dieser elektrophysiologischen Aufzeichnungen besteht der nächste Schritt darin, die Anatomie der Muskelfasern und ihr Innervationsmuster zu untersuchen. Die Zubereitung in die stehende Schüssel geben und Methylenblau hinzufügen.

Nach fünf Minuten das Methylenblau entfernen und frische Krebssalzlösung hinzufügen. Suchen Sie nach dem Hauptnerv, der die Muskeln innerhalb eines Segments innerviert. Skizzieren Sie das Innervationsmuster zu den Muskeln S-E-M-D-E-L, 2D, EL, one und DEM in einem Segment.

Schieben Sie als Nächstes das Präparat unter einen Abzug. Entfernen Sie die Kochsalzlösung und fügen Sie das Fixiermittel hinzu. Das hier verwendete Fixiermittel ist eine Poin-Lösung.

Der Zweck des Abzugs besteht darin, die Dämpfe des Fixiermittels zu vermeiden. Seien Sie sehr vorsichtig, dass diese Lösung nicht auf Ihre Haut oder in Ihre Augen gelangt. Wenn Ihre Augen zu brennen beginnen, waschen Sie Ihre Augen sofort an der Augenspülstation.

Lassen Sie die Boin-Lösung etwa 10 Minuten auf dem Präparat einwirken und tauschen Sie die Lösung dann mit einer Pipette gegen Kochsalzlösung aus. Schneiden Sie ein dünnes Segment des Muskels DEL eins oder DEL zwei aus. Lege es auf einen Objektträger.

Beschriften Sie die Folie. Wiederholen Sie den Vorgang für den SEM-Muskel. Verwenden Sie das Zusammengesetztenmikroskop, um das Sarkomer-Streifenmuster in beiden Gewebepräparationen zu betrachten.

In der nächsten Versuchsreihe wird untersucht, wie synaptische Reaktionen in den Bauchmuskeln von Krebsen aufgezeichnet werden können. Wähle einen anderen Krebs aus, enthaupte ihn. Entfernen Sie den Thorax und die Gliedmaßen und legen Sie die Bauchstreckermuskeln frei, wie in der Operation gezeigt.

Im ersten Abschnitt dieses Videos finden Sie mit dem Mikroskop den Nerv, der die motorischen Axone zu den Streckmuskeln transportiert. Suchen Sie nach dem Segment mit dem am besten zugänglichen Nerv. Der Nerv ist weiß und kann durch leichtes Aufblasen des Präparats mit einer Pipette mit Kochsalzlösung oder durch leichtes Aufblasen des Präparats gesehen werden.

Dadurch bewegt sich der Nerv und kann so leichter identifiziert werden. Platzieren Sie die Saugelektrode, die vom Mikrom-Manipulator gehalten wird, direkt über dem Nerv. Ziehen Sie vorsichtig an der Spritze, um den Nerv in die Elektrode zu ziehen.

Sie können durch das Mikroskop sehen, wie der Nerv in die Elektrode gesaugt wird. Passen Sie die Einstellungen in der Labordiagramm-Software an, wie im begleitenden Artikel beschrieben. Füllen Sie eine Mikroelektrode aus dreimolarem Kaliumchloridglas und verbinden Sie sie mit dem Kopftisch und dem Power Lab.

Verwenden Sie den Kursknopf am Verstärker, um die Linie auf dem Labordiagramm auf Null zu verschieben. Vor dem Einsetzen der Elektrode sollte der Kippknopf mehrmals ein- und wieder ausgeschaltet werden. Um den Elektrodenwiderstand zu testen, messen Sie die Amplitude der resultierenden Werte.

Schauen Sie durch das Mikroskop und führen Sie die Elektrode mit der Elektrodensonde in eine der Längsmuskelfasern ein, entweder DEM oder DL eins oder DL zwei. Achte darauf, dass du nicht durch die Muskelfaser dringst. Nun ist die Vorbereitung für das Experiment bereit.

Die Saugelektrode wird verwendet, um das segmentale Nervenbündel zu stimulieren, und die Glasmikroelektrode wird verwendet, um die synaptische Reaktion der Muskelfaser aufzuzeichnen, den Transplantatstimulator auszulösen, um den Nerv mit einem Hertz für phasische Reaktionen zu stimulieren. Platzieren Sie anschließend die Elektrode in einer SEL-Muskelfaser. Der SEL ist ein tonischer Muskel.

Stimulieren Sie den Nerv mit kurzen Impulsstößen bei 10 Hertz für tonische Reaktionen. Vergleichen Sie die aufgezeichneten Reaktionen der DEL- und SEL-Muskeln. Beachten Sie, dass die phasischen DEL-Muskeln größere Amplituden-synaptische Reaktionen aufweisen als die tonischen SEL-Muskeln.

Diese nächste Reihe von Experimenten konzentriert sich auf die Beugemuskeln der Krebse und nicht auf die Streckmuskeln. Beginnen Sie mit einem neuen Krebs und isolieren Sie den Bauch, wie in dieser Operation gezeigt. Im ersten Abschnitt dieses Videos geben Sie das isolierte Schwanzpräparat in eine mit Kochsalzlösung gefüllte Petrischale, stecken Sie den Schwanz und den oberen Teil des Präparats fest.

Beachten Sie, dass dec Caro Experimente an den tonischen Beugemuskeln durchführt, der ventrale Nervenstrang muss intakt bleiben. Beginne mit einem Skalpell einen Längsschnitt durch die Gelenkmembran zwischen zwei Rippen auf der ventralen Seite des Präparats. Seien Sie sehr vorsichtig, wenn Sie diesen Schnitt machen, nicht zu tief zu schneiden, da ein tiefer Schnitt die motorische Nervenwurzel durchschneiden könnte, um sicherzustellen, dass die oberflächlichen Muskeln nicht beschädigt werden.

Führen Sie den nächsten Schritt aus. Der Blick durch ein Mikroskop mit einer Schere oder einem Skalpell schneidet horizontal aus dem Längsschnitt in die dünne Membranschicht, die den Muskel bedeckt. Vergrößern Sie den Schnitt, um eine Klappe aus Gelenkmembran zu bilden, und heben Sie die Klappe nach oben.

Schneiden Sie mit einer Schere den Lappen ab, der die oberflächlichen Beugemuskeln für die intrazelluläre Aufzeichnung der oberflächlichen Beugemuskulatur freilegt. Verwenden Sie die gleichen Instrumente und den gleichen Aufbau, die für die Aufzeichnung des Ruhemembranpotentials und der synaptischen Reaktionen der abdominalen Extensoren verwendet wurden. Verwenden Sie wie zuvor eine intrazelluläre Elektrode, die mit drei molaren Kaliumchlorid gefüllt ist.

Führen Sie die Elektrode in eine Muskelfaser der oberflächlichen Beugemuskulatur ein und achten Sie darauf, dass sie nicht durch den Muskel dringt. Erfassen Sie die spontane Aktivität der EPSPs. Beachten Sie die unterschiedlichen Größen der EPSPs und ob IPSPs vorhanden sind.

Nehmen Sie einen kleinen Pinsel und streichen Sie vorsichtig entlang des Nagelhautrandes innerhalb desselben Segments, in dem sich die Aufnahmeelektrode befindet. Notieren Sie jede Veränderung der Häufigkeit oder Größe der EPSPs aufgrund der Stimulation, wenn eine stärkere Reaktion beobachtet wird. Dies würde auf die Rekrutierung zusätzlicher Motoneuronen hindeuten, die auf die Veränderung des sensorischen Nervenfeuerns reagieren.

Tauschen Sie die Kochsalzlösung vorsichtig gegen eine Lösung aus, die einen Neuromodulator enthält, wie z. B. mikromolares Serotonin oder Kochsalzlösung, die mit Kohlendioxid gesprudelt ist. Wiederholen Sie dann die Pinselstimulation. Beachten Sie die Auswirkungen, die das Wechseln der Badlösung auf die aufgezeichnete Aktivität hat.

Tauschen Sie die Badesalzlösung wieder auf normale Kochsalzlösung aus und beobachten Sie, dass die Muskelfaseraktivität wieder auf den Ausgangswert zurückkehrt. Diese Abbildung zeigt EPSPs, die in einer oberflächlichen Beugemuskelfaser aufgezeichnet wurden. Beachten Sie die unterschiedlichen Größen der EPSPs.

In der nächsten Phase dieses Experiments wird eine extrazelluläre Elektrode verwendet, um Aktionspotentiale von Motoneuronen zu überwachen, die auf Aktivität im sensorischen Schaltkreis zwischen ZNS und Motoneuron reagieren. Beginnen Sie mit der Herstellung einer Saugelektrode, um die sensorischen Nerven zu stimulieren. Ziehe ein Stück Plastikschlauch über eine Flamme.

Der nächste Schritt besteht darin, den Schlauch wieder auf die gewünschte Größe zu kürzen. Dazu musst du dir den Nerv in deiner Vorbereitung ansehen, um den gewünschten Öffnungsdurchmesser für deine Saugelektrode zu beurteilen. Je nach Größe des Krebses können die Nervenbündel in der Größe von etwa einem Millimeter bis zu einigen Millimetern Durchmesser variieren.

Schneiden Sie den gedehnten Abschnitt des Schlauchs ab, um die Öffnung in der Spitze auf die richtige Größe zu bringen, um den Nerv zu halten. Ist die Öffnung zu groß, könnte der Nerv herausfallen. Ist die Öffnung zu klein, könnte der Nerv durch den Druck der Elektrode geschädigt werden.

Platzieren Sie den Kunststoffschlauch auf der Spitze einer Glaselektrode. Die Einrichtung der Elektrophysiologie und Software unterscheidet sich geringfügig von der Überwachung extrazellulärer Reaktionen im Vergleich zu intrazellulären Aufzeichnungen. Das Gerät, wie im Begleitartikel angegeben, saugt den dritten Weg, der den oberflächlichen Beugemuskel in die Saugelektrode innerviert.

Sie können nun damit beginnen, Aktionspotentiale zu erfassen. Auf diesem Weg gibt es fünf Exzitor-Motoneuronen und ein Inhibitor-Motoneuron. Nach der Aufzeichnung der Grundaktivität stimulieren Sie die Nagelhaut mit einer Bürste, um die Veränderung der generierten Aktionspotentiale zu beobachten.

Ersetzen Sie anschließend die Badelösung wie im vorherigen Experiment durch Neuromodulatoren wie Serotonin und zeichnen Sie jede Veränderung der Reaktion auf. Zusätzliche Übungen sind im Begleittext aufgeführt. Diese Aufzeichnung zeigt die Aktionspotentiale, die aus dem dritten Weg vor und während der Stimulation der Nagelhaut mit einer Bürste aufgezeichnet wurden, vergleichen Sie die Häufigkeit der Aktionspotentiale vor dem Bürsten mit ihrer Häufigkeit während der Stimulation.

Diese Aufzeichnung zeigt die Aktionspotentiale, die aus dem dritten Weg in normaler Kochsalzlösung und in einer Serotoninlösung aufgezeichnet wurden. Vergleichen Sie die Häufigkeit von Aktionspotentialen in normaler Kochsalzlösung mit ihrer Häufigkeit und Serotonin, wie gerade gezeigt. Durch das Bürsten wird die Zündfrequenz gegenüber der Grundlinie erhöht.

Die Aktivität zeigt auch, dass Serotonin die Feuerfrequenz gegenüber normaler Kochsalzlösung erhöht. Diese Abbildung zeigt, dass es bei Kombination von Bürsten und Serotonin zu einer noch stärkeren Erhöhung der Feuerhäufigkeit kommt. Der Vergleich von extern und theoretisch abgeleiteten Effekten der externen Kaliumkonzentration auf das Ruhemembranpotential zeigt den Einfluss von Ionen auf das Membranpotential.

Wir haben Ihnen auch gezeigt, wie Sie ntic-Reaktionen an neuromuskulären Verbindungen sowohl der phasischen als auch der tonischen Muskeln aufzeichnen können. Diese Techniken können für investigative Schülerlaboratorien verwendet werden, um grundlegende Konzepte und Physiologie zu lehren. Die in dieser Laborübung erhaltenen Techniken können zur Beantwortung von Fragen im Zusammenhang mit anderen Laborpräparaten sowie zu physiologischen Anwendungen in Bezug auf Medizin und Gesundheit verwendet werden.